双基因表达载体的构建及生物活性观察
摘要：为了促进肠上皮细胞增殖、加速肠上皮机械屏障修复和防止肠源性感染的发生，利用分子克隆技术首先获得含胰高血糖素样肽-2（GLP-2）编码序列的高血糖素原cDN段，通过PCR重叠延伸技术成功拼接GLP2的信号肽及成熟肽，同时将成熟肽N-末端第二位丙氨酸的序列（GCT）定点突变为GGT序列（甘氨酸）；并以我室保存的pcDNA3．1-HD-5-cDNA为模板克隆防御素-5（HD-5）信号肽及成熟肽序列，分别构建到双基因表达载体pVITRO3，转染肠上皮细胞并观察其对肠上皮细胞增殖活性和杀菌能力的影响，结果显示构建的pVITR03-HD-5-GLP2双基因性表达载体具有促进肠上皮细胞增殖和抑制细菌增殖和黏附的作用。SCD-1下调大鼠非酒精性脂肪肝肝脏能量储存的机理研究
摘要：目的：探讨硬脂酰CoA去饱和酶-1（SCD-1）对高脂饮食引起大鼠非酒精性脂肪肝肝脏能量储存下降的机理。方法：30只SD大鼠随机分为实验组和对照组，前者用高脂饮食分别喂养8wk、16wk和24wk，后者同期予正常饮食。采用RT实时荧光PCR分析大鼠肝脏SCD-l mRNA、β-actin mRNA及UCP2 mRNA与β-actinmRNA的比值，荧光素酶-荧光素发测定肝脏ATP含量。结果：肝组织HE染色显示实验组大鼠肝脏内有弥漫性肝细胞脂肪变性，8wk达到脂肪肝诊断标准。8wk表现为单纯性脂肪肝，16之4wk进展为脂肪性肝炎。8wk、16wk和24wk时实验组和对照组SCD-l mRNA的测定值分别为0．39±0．18和0．83±0．28（P〈0．05），0．44±0.17和0．8l±0．30（P〈O．05），0．47±0．23和0．88±0．22（P〈0．01）；肝UCP2mRNA的测定值依次为5．41±1．94和3．56±1．43（P〉0：05），9．56±2．95和3．68±1．74（P〈0．05），13．74±3．17和3．79±1．65（P〈0．01）；肝匀浆ATP含量为2．40±0．54和2．96±0．43（P〉0．05）、2．26±0．55和3．00±0．42（P〈0．05），1．74±0．45和2．79±0：40（P〈0：01）。结论：长期高脂饮食促使脂肪在肝内蓄积形成非酒精性脂肪肝，同时加重氧化应激对肝细胞的打击和肝脏的炎症反应。^188Re-RGD-4CK的制备及其示踪动力学研究
摘要：目的：探讨^188Re标记RGD-4CK的方法及其在健康家兔体内的示踪动力学特性。方法：采用预锡化法^188Re直接标记RGD-4CK，纸层析测定标记多肽的标记率并计算比活度。测定9只家兔经耳缘静脉注射37MBq^188Re-RGD-4CK后不同时相点血液中的放射性浓度，采用DAS软件评价标记多肽示踪动力学行为，以F值检验、AIC值、R2值并结合αvβ3受体在正常机体表达实际，对血液放射性浓度一时间数据进行房室模型曲线拟合，根据拟合结果计算示踪动力学参数。结果：^188Re-RGD-4CK的标记率大于97％，比活度为3．97±0．02TBq／mmol。^188Re-RGD-4CK在健康家兔体内的放射浓度实测值符合以1／C2为权重系数拟合的二室模型理论计算值。结论：预锡化法^188Re直接标记RGD-4CK制备方法简便，标记率高，无需分离纯化。^188Re-RGD-4CK在健康家兔体内的示踪动力学符合以1／C2为权重系数拟合的二室模型。透明质酸介导的树突状细胞肿瘤抗原提呈效应的形态学研究
摘要：目的：探讨透明质酸对树突状细胞肿瘤抗原提呈效应的调节作用。方法：建立B16黑色素瘤小鼠模型；用GM—CSF和IL－4诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞，并用透明质酸孵育，Brdu标记；经肿瘤周围皮下回输，以普通DC、生理盐水为对照组；测量瘤体积，计算抑瘤率。光镜、透射电镜、免疫组织化学法观察HA-DC于肿瘤局部组织和淋巴结内的分布和形态学特征。结果：HA—DC细胞组的抑瘤作用强于DC细胞组（P〈0．05）；HA—DC细胞主要分布于肿瘤周围和淋巴结副皮质区，透射电镜观察可见HA—DC组肿瘤周围组织中有大量树突状细胞和淋巴细胞浸润．相互有膜接触，淋巴细胞以突起深入肿瘤细胞，并与其接触、融合，肿瘤细胞发生凋亡。结论：DC负载透明质酸后可以有效激活和扩增淋巴细胞，增强机体肿瘤特异性CTL效应。生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建
摘要：目的：设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列，并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒。方法：以小鼠SSTR5基因为靶序列，用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA，退火形成双链DNA后，与经BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR—Pμro／GFP连接，产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。结果：构建的重组表达质粒PCR产物为161bp，其中插入的SSTR5-siRN段为6lbp，测序结果与参考序列完全一致。结论：成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒，为进一步采用RNAi技术研究小鼠SSTR5基因表达对其生长情况的影响奠定了基础。关于2008年继续开展“生物医学”优秀论文评选活动的通知
摘要：为促进我国生物医学研究的进步与发展，本刊经研究决定于2008年继续开展”生物医学”优秀论文评选活动。为了确保优秀论文评比的公正与公平性，编辑部现将有关事项通知如下：人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究
摘要：目的：探讨并建立稳定可靠的人脐带血间充质干细胞（human umabilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）体外分离和培养方法。方法：采用密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞，利用MSC易黏附塑料贴壁生长的特性，分离MSC并进行体外扩增培养，观测其形态学特征，绘制不同代数hUCBMSC生长曲线，流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD105、HLA—DR等表达情况。结果：本法可成功、可靠地在体外自hUCB中分离培养出粘附细胞，该细胞在体外培养呈梭形或成纤维样，其指数生长倍增时间约为36h，其细胞表面表达β1整联蛋白CD29、CD105（endoglin），不表达造血细胞标志物CD34以及HLA-DR。结论：人脐带血中存在间充质干细胞，采用优化的实验方法可以提高培养成功率，稳定获得MSC并体外扩增培养。人脐带血可以作为获得间充质干细胞稳定充足的来源。保心颗粒保护阿霉素慢性心肌损伤的作用及机制研究
摘要：目的：观察保心颗粒对大鼠阿霉素心肌病的保护作用，并探讨其抗氧化作用机制。方法：SD大鼠随机分4组，空白对照组（A组），阿霉素组（B组，ADR组），阿霉素＋保心颗粒组（C组），保心颗粒组（D组）。A组普通饲料喂养，自由饮水。B组阿霉素2、5mg／kg（用生理盐水稀释为0、5mg／mL）腹腔注射，6天一次，共7次。普通饲料喂养，自由饮水。C组阿霉素处理同阿霉素组，药物饲料喂养（保心颗粒：普通饲料：1：20），保心颗粒组（D组）：保心颗粒喂养（同前）。观察生存率、心肌谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活力；免疫组化检测CuZnSOD蛋白表达水平。结果：（1）保心颗粒可以保护阿霉素心肌病。与ADR组比较，ADR＋保心颗粒组可明显提高大鼠的生存率（p〈0.01）。ADR组肝、肺淤血明显，ADR＋保心颗粒组则无明显淤血。（2）保心颗粒通过增加心肌抗氧化酶活力，增强心肌组织抗氧化酶mRNA转录水平以及蛋白质表达水平发挥其保护作用。结论保心颗粒从多个环节发挥其抗氧化作用，对阿霉素性心肌病具有明显的保护作用，为临床治疗心肌病提供新的恩路。重组腺相关病毒介导的大鼠脂联素载体的构建与鉴定
摘要：目的：克隆大鼠脂联素基因（Acrp30），并对载有脂联素的重组腺相关病毒（AAV）载体进行构建及鉴定。方法：根据Acrp30的基因序列设计引物，上游引入EcoR Ⅰ位点，下游引入sal Ⅰ位点，以EX—A0242-M01-Acrp30为模板扩增目的基因。将Acrp30基因克隆入pUC19载体中，获得重组质粒pUC19-Acrp30。然后用EcoRⅠ与salⅠ酶切pUC19-Acrp30及质粒pSNAV，回收酶切片段，T4DNA连接酶16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-Acrp30，EcoRⅠ／sal双酶切鉴定，并行全基因测序。结果：PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV-Acrp30重组成功，基因测序显示装入pSNAV质粒中的Acrp30基因正确。结论：脂联素病毒载体成功构建，可以满足脂联素基因研究和治疗的需要。原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立
摘要：目的：观察高脂负荷在胰岛素抵抗形成中的意义。方法：用不同浓度棕榈酸、胰岛素分别培养骨骼肌细胞2h、6h、12h、24h，对棕榈酸诱导组的一部分细胞给予1×10^-7M胰岛素刺激2h，用血糖检测试剂盒（GOD-POD）检测各组培养液中的葡萄糖含量，研究不同浓度棕榈酸、胰岛素对骨骼肌细胞摄取葡萄糖的影响，观察胰岛素的生理功效的变化。结果：0．6mM棕榈酸诱导12h以上或者5×10^-7M胰岛素诱导24h后，培养液中的葡萄糖浓度比正常组高且有显著性差异，表明细胞的糖代谢能力降低。经1×10^-7M胰岛素刺激2h后的棕榈酸诱导组，培养液中葡萄糖的浓度与未经胰岛素刺激的棕榈酸诱导组相比无显著差异，胰岛素的生理功效降低，证实棕榈酸诱导组细胞已对胰岛素产生耐受。结论：高脂或高胰岛素条件均可诱导原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型。帕金森病和正常人外周血单个核细胞的蛋白质组差异分析
摘要：目的：通过研究帕金森病和正常外周血单个核细胞（PBMC）的蛋白质组差异，初步探讨外周免疫系统与帕金森病的病理联系。方法：用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人帕金森病和正常单个核细胞总蛋白质，考马斯亮蓝染色，PDQuest2-DE软件分析，对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，用Mascot查询系统查询SWISS—PROT数据库。结果：获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳考染图谱，对其中的21个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析，经数据库查询，初步鉴定为一些与蛋白降解、抗氧化应激、信号转导、细胞骨架、细胞周期调控等有关的蛋白质。结论：建立了帕金森病PBMC的双向凝胶电泳图谱，提示帕金森病和正常的PBMC的蛋白质表达具有差异。肽-半乳糖苷-阿霉素脂质体在肝细胞癌靶向治疗中作用
摘要：目的：获得一种对肝细胞癌具有特异靶向的药物传递系统载体－聚乙二醇修饰的MMP－2底物肽－半乳糖苷－阿霉素脂质体（PEG－PD-Gal-ADM-liposomes），为临床肝癌的靶向治疗提供实验依据。方法：将二棕榈磷脂酰基乙醇胺（DOPE）与聚乙二醇化的MMP-2底物肽连接（Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln），即获得可被MMP-2切割的聚乙二醇-底物肽-DOPE，再与半乳糖苷脂质体（Gal-1iposomes）、阿霉素（ADM）耦合，最终获得聚乙二醇修饰的MMP-2底物肽-半乳糖苷-阿霉素脂质体（PEG-PD-Gal-ADM-1iposomes），体外观察其对人肝癌细胞株HepG2的效应。结果：MTT法显示PEG-PD-Gal-ADM脂质体对人肝癌细胞株HepG2的毒性作用弱于半乳糖苷-阿霉素脂质体（PEG-Gal-ADM）的作用（P〈0.05），对人结肠癌细胞株SW480的毒性作用二者之间无显著差异；用MMP-2（5μg／m1）预处理后，PEG-PD．Gal-ADM脂质体对人肝癌细胞株HepG2的毒性作用与Gal-ADM脂质体的作用相近，无显著差异（P〉0．05）；加入过量的半乳糖封闭半乳糖受体后，二者的毒性作用均有下降，无显著性差异（P〉0.05）。结论：PEG-PD-Gal-ADM脂质体是一种新型的HCC特异靶向治疗药物传递载体，可能是将来HCC靶向治疗的重要手段。N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性位点的构成研究
摘要：目的：用生物信息学软件预测出N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的活性中心的金属离子结合位点。方法：选用DEPC．WRK、PMSF、NBS、DTNB5种化学试剂选择性修饰N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶中组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、色氨酸和半胱氨酸；同时考察Co^2＋、Fe^3＋、Mg^2＋、Mn^2＋、Zn^2＋、Ni^2＋、CU^2＋等金属离子对酶活性的影响。结果：在DEPC、WRK修饰后，酶的活力明显下降，而PMSF、NBS、DTNB对酶的活力影响不大；说明组氨酸和酸性氨基酸为酶活性中心的必需氨基酸，而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不参与酶活性中心的组成；co^2＋对酶反应有促进作用，验证了生物信息学的预测结果；底物N-乙酰-D，L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用，保护作用随浓度增加而增加。结论：本研究为深入研究酶结构与功能的关系提供实验依据，为N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的工业应用提供理论参考。禽流感抗原基因NA，HA的克隆及其表达载体的构建
摘要：HA和NA是禽流感病毒重要的保护性抗原基因，为了得到禽流感植物疫苗，本试验采用高保真PCR扩增方法得到目的基因，分别克隆到pMDl8－T载体。经测序证实核酸序列正确后，克隆到含有GUS基因的高效植物双元表达载体pBI121上，获得含有HA／NA基因的植物双元表达载体pBI121－HA和pBI121－NA，采用冻融法将含HA／NA基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌LBA4404，菌液浸染生菜子叶，共培48小时后进行Gus基因表达检测，x—gluc染色显蓝色，说明带有HA/NA的植物双元表达载体构建成功，为下一步的生菜转HA／NA基因研究奠定基础。嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚硫酸还原酶的α亚基黄素蛋白（cysJ）的表达、纯化及活性测定
摘要：亚硫酸还原酶是嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氧化还原系统电子传递链的重要组分之一。本文以嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC23270基因组为模板，通过基因重组技术在大肠杆菌中表达，用一步亲和层析法纯化出浓度和纯度都较高的亚硫酸还原酶的α亚基黄素蛋白（cysJ）。通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外可见分光光度法等方法确定其性质并成功测定了活性，为进一步研究亚硫酸还原酶的功能及其应用提供了条件。CGRP对兔成骨细胞NO／NOS系统调控的实验研究
摘要：目的：探讨外源性降钙素基因相关肽（CGRP）对体外培养兔成骨细胞一氧化氮／一氧化氮合成酶（NO/NOS）系统的时序调控作用。方法：将体外培养的成骨细胞用不同浓度的CGRP处理0．5h、1h、4h和12h，通过Western—blot检测细胞NOS的蛋白表达变化，使用NOS分型试剂盒测定细胞NOS的酶活性，硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO浓度。结果：在0．5h－12h时间段，CGRP实验组细胞培养液中NO含量明显高于对照组（p〈0．05或p〈0．01）；实验组成骨细胞中eNOS的表达和酶活力明显高于对照组（p〈0．05或p〈0．01），而iNOS的表达和酶活力检测未发现有明确的统计学差别。结论：CGRP可通过调节成骨细胞的N0／NOS系统促进成骨细胞的增殖分化从而影响骨代谢。灯盏花素注射液对鼠尾再植血液循环影响的实验研究
摘要：目的：评价灯盏花素注射液对鼠尾再植辅助治疗的效果和可行性。方法：90只雄性SD大鼠，30只为一组随机分为三组进行再植，术后分别予灯盏花素注、肝素、丹参注射液注射，术后观察再植鼠尾的血液循环情况。结果：灯盏花素注射液组28条再植尾成活，伤口Ⅰ期愈合，术后2周内，28条再植尾色泽红润，毛细血管返流时间正常，皮肤弹性正常，皮温状况良好，超声Dopple及血管造影显示尾动脉血循通畅，而高于丹参注射液组和肝素组。结论：灯盏花素注射液在促进断尾血液循环方面相对丹参注射液、肝素而言具有明显的优越性。生物活性肽SSDI固相合成工艺的研究
摘要：目的：研究生物活性肽SSDI的固相合成工艺，并为大规模合成目标肽提供理论依据。方法：采用固相合成法，原料氨基酸以Fmoc形式保护，用Wang树脂为载体，经l-氧3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（TBTU）＼I-羟基-苯并-三氮唑（HOBt）＼二-异丙基乙胺（DIEA）混合试剂缩合，20％哌啶的DMF溶液脱保护，用三氟乙酸＼茴香硫醚＼巯基乙醇＼苯酚＼水混合作为切割试剂将多肽从Wang树脂上切割下来。结果：多肽粗品的得率高达70％，经RP-HPLC纯化，可获得纯度在98％以上的目标肽，经MALDI-MS质谱鉴定其分子量与理论值一致。结论：此合成方法操作简单，产品得率高，适合大规模合成目标肽。
