灭活轮状病毒疫苗与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗联合使用免疫效果评价
摘要：目的评价灭活轮状病毒疫苗（inactivated rotavirus vaccine,IRV）与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（inactivated poliovirus vaccine,IPV）免疫大鼠后,两种疫苗间免疫效果的相互作用。方法将Wistar大鼠随机分成联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组：联合免疫组接种IPV后4周,经双侧腿同时免疫IPV和IRV,共2次,间隔4周;单疫苗免疫组2组,分别免疫3针IPV和2针IRV,每针均间隔4周;间隔免疫组免疫1针IPV后4周,开始进行IPV和IRV间隔免疫（每针间隔2周,共6周）。分别于每次免疫后4周经尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验结合免疫荧光抑制方法检测血清抗RV中和抗体水平,ELISA法检测血清抗RV特异性Ig G抗体水平,微量中和试验法检测血清抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平。结果大鼠经2针IRV免疫后,血清抗RV中和抗体和特异性Ig G抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）均明显上升,血清抗体阳转率均达100%;经3针IPV免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体GMT均明显上升,抗体阳转率均达100%;联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组间血清抗RV中和抗体水平、特异性Ig G抗体水平及抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 IRV和IPV免疫大鼠后均获得到良好的免疫效果,两种疫苗联合使用时,免疫效果无相互干扰作用。截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达
摘要：目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代（P1）重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌
摘要：目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa（Gap C1）的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列（GI：30348860）设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林（Amp）和氯霉素（Cm）抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌（HB101LOG）。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1在大肠埃希菌中的表达
摘要：目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合表达质粒,转化不同宿主菌（大肠埃希菌DH5α、BL21）,在不同的温度下（37、20℃）进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。原核增强子样序列筛选及其功能区域鉴定
摘要：目的从污水和土壤中富集的微生物菌体中筛选原核增强子样序列,构建包含增强子样序列的表达载体,并通过构建缺失突变体鉴定其功能区域。方法将人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）主要衣壳蛋白基因L1截短序列L11与氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）连接,作为报告基因,从污水和土壤富集的微生物菌体中筛选具有增强子活性的序列,构建包含增强子样序列的表达载体,表达HPV L11蛋白,检测其增强活性;通过构建ER1的缺失突变体,测定不同突变体对L11蛋白表达的作用情况,确定其功能区域。结果从样品基因组DNA中筛选出1条具有一定增强蛋白表达功能的增强子样序列,可使检测菌株氯霉素抗性提高5倍,HPV L11蛋白表达水平提高1.78倍。其增强活性主要位于117~317 bp区域。结论从污水和土壤中成功筛选到1条增强子样序列,携带有增强子样序列的表达载体可提高目的蛋白表达水平。HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
摘要：目的制备丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）,并进行纯化和鉴定。方法采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体p CI-HBSE1、p CI-HBSE2、p CI-HBSE3、p CI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBs Ag定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应。结果电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度最高的VLPs-SE2 HBs Ag含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平。结论成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础。多拷贝GnRH类似物的原核表达及其纯化
摘要：目的原核表达促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone,Gn RH）类似物,并进行纯化。方法人工合成8拷贝Gn RH类似物基因,并利用同尾酶技术构建16拷贝的Gn RH类似物基因,将8和16拷贝串联的Gn RH类似物基因分别克隆至p GEX-2t原核表达载体上,构建Gn RH类似物基因多拷贝串联表达的重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21,利用优化后的IPTG诱导表达条件表达的重组Gn RH类似物蛋白经Glutathione Sepharose 4B柱纯化并酶解后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒p GEX-2t-8Gn RH analogue和p GEX-2t-16Gn RH analogue经双酶切及测序证明构建正确。当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导2 h时,破菌后上清中目的蛋白表达量最高。表达的重组蛋白相对分子质量约37 000,可与兔抗Gn RH单克隆抗体特异性结合,纯化后的重组蛋白相对分子质量约1 400,蛋白浓度约260μg/ml。结论已成功构建Gn RH类似物多拷贝基因重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达,为多拷贝法生产生物活性小肽Gn RH类似物奠定了基础。2015中国（南京）国际生物医药产业博览会
摘要：随着Biotech China在境内外宣传力度的不断加大,引起了国内外生物医药行业组织的广泛关注,先后有美国、加拿大、瑞士、德国、澳大利亚、芬兰、苏格兰、以色列、印度、韩国及中国台湾等国家和地区组团参展,展会国际化程度进一步提升。2015中国（南京）国际生物医药产业博览会将于2015年9月3~5日在南京国际博览中心展出。磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定
摘要：目的构建携带磷酸酶张力蛋白同系物（phosphoatase and tensin homolog,PTEN）基因的sh RNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。方法在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的psh RNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的psh RNA,将其克隆至重组穿梭载体p Shuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒p Shuttle-GFP-PTEN-sh RNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体p Adxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA。将重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA,经3轮扩增,测定病毒滴度。荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。结果与空白对照组比较,psh RNA1和psh RNA3组中PTEN基因m RNA表达量分别下降了44%和68%（P〈0.05,确定p GPU6/GFP/Neo-PTEN-sh RNA3为最佳转染质粒）;重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42%和51%（P〈0.05）。结论成功构建了PTEN基因sh RNA重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。利用同源片段交换提高腈水合酶的热稳定性
摘要：目的通过计算机辅助半理性设计对热不稳定的恶臭假单胞菌Psedomonas putida NRRL-18668腈水合酶（EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase）分子进行改造,提高酶催化的热稳定性和活性。方法以嗜热假诺卡菌Pseudonocardia thermophila JCM3095和睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone 5-MGAM-4DNHase作为模板,利用位点靶向氨基酸重组（site-targeted amino acid recombination,STAR）软件和分子动力学模拟分析选择合适的同源靶片段,通过同源交换替换Pseudomonas putida NRRL-18668NHase相应的片段,构建7株分别含有3种不同来源片段的新型杂合NHase,检测其热稳定性及活性;圆二色光谱分析野生酶和杂合酶3AB的二级结构。结果 7株杂合NHase（1A、2B、2C、2BC、3AB、3AC、3ABC）经50℃热处理10 min后,与野生型NHase相比,热稳定性分别提高了1.5~3.5倍,其中杂合NHase 3AB的热稳定性提高了3.5倍,酶活力提高了1.4倍;野生酶和杂合酶3AB二级结构中α螺旋含量分别为（34.56±3.21）%和（36.88±1.41）%,,β折叠含量分别为（19.78±3.21）%和（18.69±1.74）%。结论通过利用热稳定性的同源片段来替换相应的热不稳定结构域这种理性设计的方法,成功将不耐热的NHase改造成耐热杂合NHase,同时提高了酶的比活力,并能维持NHase分子的基本二级结构不改变。MIP-1a细胞因子与痘苗病毒天坛株终身免疫保护性的相关性
摘要：目的分析MIP-1a细胞因子与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tian Tan strain,VTT）终身免疫保护性的相关性。方法将VTT分别经肌肉注射免疫C57/BL6小鼠和MIP-1a的KO小鼠模型B6.129P2-Ccl3,每只剂量2×107PFU/ml,每组10只,30和180 d后,再次用相同剂量的VTT进行激发,激发3 d后,处死小鼠,取脾淋巴细胞,采用流式细胞术分析CD44＋CD62L-CD4＋的外周效应记忆性T细胞（effector memory T cell,Tem）在两种小鼠体内的差异;同时用四聚体（tetramer）对荷载痘苗病毒特异性的CD8＋T细胞表位（VACV-B8R20-27 Kb）进行染色,分析MIP-1a的缺失对长效免疫记忆的影响。结果获取的CD4＋的记忆性T细胞的表型以CD4＋CD44＋CD62L-为主,即以Tem为主;获取的CD8＋的记忆性T细胞也以Tem（CD44＋CD62L-）为主,数量很少。B6.129P2-Ccl3小鼠受到再次激发后,体内VTT特异性CD8＋T细胞在30和180 d的比例均明显少于C57/BL6小鼠;在30 d激发时,tetramer＋CD8＋T细胞的比例明显高于180 d激发。结论 MIP-1a细胞因子与痘苗病毒产生长效免疫记忆相关,本实验为延长疫苗的免疫记忆提供了参考。辽宁锡伯族群体Rh血型D基因频率分布
摘要：人类红细胞血型由约20多种血型系统组成,ABO和Rh血型是与人类输血关系最为密切的两个血型系统。人类红细胞上的Rh血型系统包括5种不同的抗原：C、c、D、E、e。从理论上推断,有3对等位基因Cc、Dd、Ee控制着6个抗原,但实际上未发现单一的抗d血清,因而认为不存在d基因,在红细胞表面不表达d抗原。在5个抗原中,D抗原的抗原性最强。人脐血干细胞在局灶性脑缺血大鼠体内的迁移与分化
摘要：目的观察人脐血干细胞（human umbilical cord blood stem cells,HUCBSCs）在局灶性脑缺血大鼠体内的迁移与分化,探讨HUCBSCs移植对缺血性脑损伤大鼠神经功能恢复可能的作用机制。方法采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）再灌注模型,将造模成功的20只大鼠随机分为2组：移植组15只,造模成功后24 h,经尾静脉移植1 ml（2×106个）DAPI/CM-Dil荧光染料标记的HUCBSCs;模型组5只,造模成功后24 h,经尾静脉移植等量生理盐水。分别于移植前及移植后3、7、15 d进行神经功能缺损评分（neurological severity score,NSS）,并取脑组织,制备冰冻切片,HE染色观察脑组织形态,荧光显微镜观察HUCBSCs在脑组织中的迁移和分布,免疫荧光法检测脑组织中巢蛋白（Nestin）和神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）的表达。结果移植组大鼠HUCBSCs移植后7 d起,其改良的NSS（m NSS）显著低于对照组（P〈0.05）。移植后15 d,大鼠脑组织病理改变明显减轻。移植后3 d起,可见病灶及其周围部位有阳性细胞存在,随着时间的推移,脑缺血病灶部位的阳性细胞增多;移植后7 d,迁移至病灶部位的细胞数增加;移植后15 d,迁移至病灶部位的细胞数量达观察期内的高峰,各时间点阳性细胞数差异有统计学意义（P〈0.05）。移植后15 d,大鼠脑组织中CM-Di I/NSE-FITC和CM-Di I/Nestin-FITC双阳性细胞率分别为85.2%和81.6%。结论 HUCBSCs经静脉移植后,能在大鼠体内存活,并向损伤部位迁移,具有向神经元细胞方向分化的潜能,对脑缺血大鼠的神经功能恢复具有促进作用。北京市海淀区新生儿乙型肝炎疫苗高免疫应答影响因素调查
摘要：目的探讨北京市海淀区新生儿12月龄内全程接种10μg酵母乙型肝炎疫苗（hepatitis B vaccine,Hep B）的免疫效果及影响乙肝表面抗体（抗-HBs）高应答的因素。方法对在北京居住半年及半年以上、12月龄内完成全程Hep B接种的儿童家长进行调查,获得儿童一般情况、Hep B接种情况、体重、身长、出生体重、是否早产、母亲分娩方式、喂养方式、母亲乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）、父亲HBs Ag情况等数据,采集被调查儿童静脉血标本2 ml,分离血清,定量检测抗-HBs和HBs Ag。以非条件多因素Logistic回归模型分析抗-HBs高应答率（抗-HBs≥1 000 IU/L）的影响因素,估计各研究因素的比值比（odds ratio,OR）和95%可信区间（confidence intervals,CI）。结果共调查7~15月龄儿童691名,纳入分析666名,儿童无HBs Ag阳性出现,抗-HBs阳性（≥10 IU/L）率达99.8%（665/666）;抗-HBs阳性的儿童中,低应答（抗-HBs≥10 IU/L且〈100 IU/L）率1.2%,中应答（抗-HBs≥100 IU/L且〈1 000 IU/L）率34.0%,高应答率64.8%。经Logistic回归模型分析,与女童相比,男童全程接种Hep B后更易产生抗-HBs高应答（OR=1.396,95%CI：1.010~1.930）;与采血时间距第3剂Hep B（Hep B3）间隔〈60 d的儿童相比,间隔≥60 d的儿童抗-HBs高应答率更低（OR=0.326,95%CI：0.186~0.573）。结论北京市海淀区新生儿12月龄内全程接种Hep B后,产生的抗-HBs阳性率高。抗-HBs阳性的儿童中,抗-HBs高应答率随着采血时间和Hep B3间隔的延长而下降,男童抗-HBs高应答率高于女童。北京市2011～2012年60岁以上老年人群接种流感病毒裂解疫苗的安全性评价
摘要：目的评价北京市2011~2012年60岁以上老年人群接种北京天坛生物制品股份有限公司（以下简称天坛生物）生产的流感病毒裂解疫苗的安全性。方法通过疑似预防接种异常反应（adverse event following immunization,AEFI）信息管理系统,收集2011~2012年北京市免费接种流感病毒裂解疫苗的60岁以上老年人群接种的不良反应发生情况,采用描述性流行病学方法分析相关信息。结果接种天坛生物生产的流感病毒裂解疫苗的536 812名观察对象中,共报告AEFI 10例,其中不良反应共6例（一般反应和异常反应各3例）,发生率为1.12/10万;接种其他厂家生产的流感病毒裂解疫苗的701 820名观察对象中,共报告AEFI 21例,其中不良反应共10例（一般反应6例,异常反应4例）,发生率为1.42/10万。两组总体不良反应报告发生率、一般反应报告发生率、异常反应报告发生率差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论天坛生物生产的流感病毒裂解疫苗具有良好的安全性,可用于相关人群的流感免疫预防。冰点下降法测定乙型脑炎减毒活疫苗和两种脑膜炎球菌多糖疫苗的渗透压摩尔浓度
摘要：目的采用冰点下降法测定乙型脑炎减毒活疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗及相应稀释剂的渗透压摩尔浓度。方法按照《中国药典》三部（2010版）附录渗透压摩尔浓度测定法,采用冰点下降法分别测定市售20批乙型脑炎减毒活疫苗、55批A群脑膜炎球菌多糖疫苗和7批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗及相应稀释剂的渗透压摩尔浓度。结果 3种疫苗之间的渗透压摩尔浓度存在较大的差异,在260~700 m Osmol/kg之间,其中乙型脑炎减毒活疫苗的批间和批次内渗透压摩尔浓度之间的差异较大,A群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗各自的批间和批次内渗透压摩尔浓度差异不大;3种疫苗稀释剂的渗透压摩尔浓度也存在较大差异。结论在上述3种疫苗质量控制体系中应酌情增加渗透压摩尔浓度检查项。大规模纯化脊髓灰质炎病毒的蔗糖垫层离心法的建立
摘要：目的建立可大规模纯化脊髓灰质炎病毒（poliovirus,PV）的蔗糖垫层离心法。方法病毒大量增殖后,收集病毒液,经PEG浓缩、三氟三氯乙烷抽提后,采用蔗糖垫层或Cs Cl密度梯度离心法纯化PV（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）,电镜下观察病毒形态,进行核酸及感染性滴度的检测。将纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV免疫豚鼠,心脏采血,分离血清,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果蔗糖垫层离心法纯化的各型PV,病毒颗粒形态典型,背景清晰,除完整的光滑型病毒颗粒外,还可见大量空心病毒颗粒样品,纯化效果较好;Cs Cl密度梯度离心法纯化的PV样品,病毒形态也较典型,但完整的病毒颗粒较多。两种纯化方法获得的病毒基因组核酸特征显著,背景清晰,无明显差异。蔗糖垫层离心法纯化的各型PV的感染性滴度及免疫后豚鼠血清中和抗体滴度均高于Cs Cl密度梯度离心法。结论蔗糖垫层离心法纯化的PV纯度高,免疫原性好,可用于大规模纯化PV或其他病毒。
