H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的构建及鉴定
摘要：目的构建同时含有禽流感H5N1疫苗株NIBRG-14的血凝素（Hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（Neurami-nidase,NA）及基质蛋白（Matrix protein,M1）3种基因的重组杆状病毒,并研究其表达产物的生物学特性。方法利用RT-PCR法从禽流感H5N1疫苗株NIBRG-14中扩增HA、NA及M1基因片段,并同时亚克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBacDual中,构建重组杆状病毒穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒Bacmid-HA-NA-M1a。Westernblot法和血凝试验检测HA、NA及M1蛋白在Sf9细胞中的表达;表达的重组蛋白经超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化后,透射电镜观察病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）的形态结构,并通过单向免疫扩散（Single radialimmunodiffusion,SRID）试验检测HA的含量。结果已成功构建了重组杆状病毒,该病毒可同时表达HA、NA及M1蛋白,3种蛋白可自行组装成VLPs,并分泌至细胞培养上清中,血凝效价可达1∶64;重组杆状病毒表达的蛋白形成的VLPs与NIBRG-14标准抗血清形成沉淀环,浓缩及纯化后的重组蛋白HA含量分别为36和27μg/ml;透射电镜观察可见直径约100 nm的典型流感VLPs。结论构建的重组杆状病毒可表达VLPs,为禽流感新型疫苗的研制奠定了基础。呼吸道合胞病毒截短G蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性
摘要：目的构建呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）截短G蛋白的原核表达载体,并对表达、纯化后的蛋白进行免疫原性及相关免疫指标的检测。方法人工合成G蛋白基因的部分核酸序列,采用重叠PCR法将CX3C模序替换为RSV M蛋白上的CTL表位,构建原核表达载体GCX3C-pET22b和GCTL-pET22b,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni2＋亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,免疫昆明小鼠,实验分GCX3C组（100μg GCX3C）、GCTL组（100μg GCTL）、阴性对照组（100μlPBS）,分别于0、1、4周经小鼠双后侧肌肉注射免疫,经尾梢静脉取血,分离血清,检测IgG水平及嗜酸性粒细胞的数量,并通过小鼠体外淋巴细胞杀伤试验鉴定RSV特异性CTL应答。结果重组原核表达载体经双酶切及测序鉴定,证明G蛋白基因改造成功;重组蛋白的相对分子质量约14 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RSV血清发生特异性反应;小鼠血清中的特异性IgG水平随免疫次数的增加而升高（P〈0.01）,GCX3C蛋白和GCTL蛋白的几何平均滴度分别为1 584.89和1 995.26;GCX3C组较GCTL组小鼠血清中嗜酸性粒细胞数量明显增加（P〈0.01）;GCTL蛋白免疫小鼠后可产生RSV特异性的CTL应答效应。结论已成功原核表达了GCX3C蛋白和GCTL蛋白,两种蛋白均有较好的免疫原性,GCTL蛋白可消除由CX3C模序引起的嗜酸性粒细胞增多,并增强了CTL效应,G蛋白基因的改造达到了预期效果。＂血液制品新产品、新工艺、新设备及2010版GMP实施＂研讨会通知
摘要：中国医学装备协会生物工程装备技术专业委员会定于2013年4月23-26日在贵州省贵阳市举办＂血液制品新产品、新工艺、新设备及2010版GMP实施＂研讨会。本次会议将邀请国家药品监管部门、国家科研单位、血液制品生产单位知名专家、学者到会交流,并将继续得到全国血液制品生产和研究单位的参与和支持。现将有关事宜通知如下。肠道病毒71型中和抗体的保护水平
摘要：目的通过检测乳鼠模型、健康婴幼儿和疫苗免疫后目标人群的肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）中和抗体效价,为确定EV71疫苗保护水平提供基础数据。方法 6份不同EV71病毒株免疫血清经中和抗体准确定量后,分别通过两个EV71乳鼠攻毒模型,检测EV71中和抗体保护水平。采用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,分别对健康婴幼儿及疫苗免疫后血清进行中和抗体准确定量。结果在2个乳鼠攻毒模型中,6份免疫血清的中和抗体保护水平接近,ED50分别为10～50 U和6.1～54.2 U;婴幼儿人群7、12和24月龄抗体阳性率分别为45.0%、48.8%和56.8%,阳性人群的抗体效价分别为113.8、120.3和330.6U/m（l均值为173.2 U/m）l,母亲抗体阳性率和效价分别为86.7%和114.3 U/ml;中、高剂量疫苗2针免疫后,婴幼儿抗体阳性率均为100%,效价为356.0和1 136.2 U/ml,较婴幼儿人群自然感染水平高2.1～6.6倍。结论应用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,确定了以U/ml为单位的乳鼠攻毒抗体保护水平及婴幼儿人群抗体水平和疫苗免疫后抗体水平,为EV71疫苗免疫人群中和抗体保护水平的确定提供了依据。无乳链球菌GapC蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及纯化
摘要：目的构建无乳链球菌（Streptococcus agalactiae,S.agalactiae）gapC基因和鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimu-rium,S.typhimurium）fliC基因的融合基因gapC-fliC,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因和无乳链球菌gapC基因片段,通过柔性肽（Gly4Ser）2编码序列将二者串联并克隆至质粒pQE-30上,构建重组原核表达质粒fliC-gapC-pQE30,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行Western blot分析及融合蛋白活性检测。结果重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白FliC-GapC相对分子质量约95 000,表达量占菌体总蛋白的58%,主要以包涵体形式存在,且可与小鼠抗鼠伤寒沙门菌和抗无乳链球菌多抗血清发生特异性反应,具有较好的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）活性。结论成功构建了重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30,并在E.coli XL1-Blue中表达了融合蛋白,为下一步动物免疫保护性试验的研究奠定了基础。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管，中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办，是中华预防医学会系列杂志之一，月刊。宇佐美曲霉羧肽酶成熟肽基因的表达及鉴定
摘要：目的克隆、表达宇佐美曲霉（Aspergillus usami）羧肽酶成熟肽基因,并检测其酶学性质。方法根据前期克隆的宇佐美曲霉羧肽酶基因序列设计引物,克隆羧肽酶成熟肽基因AucpA,构建重组表达质粒pPIC9k-AucpA,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导重组蛋白表达。表达的重组蛋白经Sephadex-50层析纯化后,进行酶活性及其影响因素的检测。结果重组表达质粒pPIC9K-AucpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约81 000,纯化的重组羧肽酶最高比酶活为57.15 nkat/mg,最适反应温度为45℃,最适反应pH为3.5,金属离子、EDTA对重组羧肽酶的酶活性无影响,而PMSF对重组羧肽酶酶活性的抑制率达50%以上。结论已成功在毕赤酵母中表达了具有较高酶活的宇佐美曲霉羧肽酶,为进一步研究该重组酶的应用奠定了基础。《中国生物制品学杂志》关于稿件优先数字出版的启事
摘要：为缩短学术周期，提高学术论文的时效性和影响力，争取创新性科研成果的首发权，《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网（CNKI）签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定
摘要：目的构建瓣状内切核酸酶1（Flap endonuclease 1,FEN1）基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。高表达转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒的构建及鉴定
摘要：目的构建转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒,为进一步研究ZNF191的生物学功能及其在肿瘤基因治疗方面的应用奠定基础。方法从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,亚克隆至pLVX-AcGFP-N1质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确后,将含有ZNF191基因的重组质粒pLVX-ZNF191结合辅助质粒转染HEK293T细胞,包装重组慢病毒,Western blot检测感染的293T细胞内ZNF191蛋白的表达。结果酶切及测序鉴定pLVX-ZNF191质粒构建正确,Western blot检测重组慢病毒能显著提高293T细胞的ZNF191蛋白表达水平。结论已成功构建了ZNF191基因重组慢病毒表达载体pLVX-ZNF191,为进一步研究ZNF191的生物学功能及肿瘤的基因治疗奠定了基础。羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达
摘要：目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析。结果扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致;重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4 h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7%,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别。结论成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础。日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶的原核表达及纯化
摘要：目的原核表达并纯化日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase of Schistosoma japonicum,SjLAP）。方法从日本血吸虫成虫中RT-PCR扩增LAP基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,转化感受态E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达的重组SjLAP蛋白（rSjLAP）经SDS-PAGE和Western blot分析后,经His Binding Purification Kit层析纯化,纯化的rSjLAP蛋白经SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度。结果克隆的SjLAP基因与GenBank中登录的基因序列比较有2个碱基发生置换,导致对应的2个氨基酸发生置换,但均不在关键区域;重组表达质粒pET-28a/SjLAP经双酶切鉴定证实构建正确;表达的rSjLAP蛋白相对分子质量约45 000,诱导4 h表达量最高;纯化的rSjLAP蛋白纯度较高,浓度达5.0 mg/ml,并可被抗小鼠His-tag单抗及血吸虫感染的患者血清和兔血清特异性识别,具有良好的反应原性。结论成功在大肠杆菌中表达了rSjLAP蛋白,纯化的rSjLAP纯度较高,为血吸虫病的诊断和预防等研究奠定了基础。白藜芦醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化
摘要：目的研究白藜芦醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞（Marrow stroma cells,MSCs）向神经元样细胞的分化。方法采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs,取第3代MSCs分为白藜芦醇诱导组、对照组和正常组,白藜芦醇诱导组先加入预诱导液（含10μg/L bFGF的DMEM/F12培养基）培养24 h,再更换诱导液（含15μmol/L白藜芦醇的DMEM/F12培养基）诱导6 h,然后更换维持液（含15μmol/L白藜芦醇,10μg/L bFGF,2%B27的DMEM/F12培养基）,继续培养至72 h;对照组预诱导与白藜芦醇诱导组相同,诱导时仅加入DMEM/F12培养基诱导6 h,再更换维持液（含10μg/L bFGF,2%B27的DMEM/F12培养基）,继续培养至72 h,倒置显微镜下观察诱导分化后MSCs形态;各组分别于诱导前及诱导后2、6、24、72 h采用间接免疫荧光法、Western blot法和RT-PCR法检测nestin、NSE蛋白及mRNA表达。结果白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元,间接免疫荧光染色显示诱导后细胞nestin和NSE阳性,对照组未见阳性细胞。白藜芦醇诱导组nestin、NSE蛋白及mRNA表达较对照组明显升高,诱导后2 h,nestin蛋白及mRNA表达达最高（P〈0.01）,之后逐渐下降;而NSE蛋白及mRNA表达逐渐升高,诱导后72 h达最高（P〈0.01）,对照组则无明显变化。结论白藜芦醇在体外可诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞,为白藜芦醇在干细胞移植领域的应用提供了实验依据。小鼠Hes1基因过表达逆转录病毒载体的构建及其在小鼠Lin~-造血细胞中的表达
摘要：目的构建过表达Hes1基因的逆转录病毒载体,并通过感染相对原始的小鼠Lin-造血细胞检测其感染效率。方法通过RT-PCR法从B6小鼠骨髓细胞中扩增Hes1基因功能区,将扩增产物连接入逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP,瞬时转染293T细胞,设转染空载体的细胞为对照组,流式细胞仪检测转染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达;将重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP及空载体与Lipofectamine 2000混合后,转染293T细胞,包装重组逆转录病毒,稳定感染小鼠Lin-细胞,设感染空载体病毒的细胞为对照组,流式细胞仪检测感染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达。结果测序证实重组逆转录病毒载体构建正确;转染293T细胞后第3天,重组逆转录病毒的转染效率约为95%,Hes1基因表达量约为对照组的5倍;病毒上清感染Lin-细胞后第4、5天,重组逆转录病毒的感染效率约为7%,Hes1基因的表达量约为对照组的6倍。结论已成功构建了过表达Hes1基因的重组逆转录病毒载体,并在小鼠Lin-细胞中稳定表达,为研究白血病环境下Hes1对造血干祖细胞的作用奠定了基础。人白细胞介素-29的生物信息学分析
摘要：目的利用生物信息学技术对人白细胞介素-29（Human nterleukin-29,IL-29）进行分析,为定点突变hIL-29,以提高其生物学活性奠定理论基础。方法利用生物信息学技术分析克隆得到的hIL-29基因,预测hIL-29基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及可能影响其生物学活性的关键氨基酸位点;预测其三维结构,并与IFNλ3的晶体结构进行比对;对检索到的9个物种的IL-29基因同源序列进行比对,并构建系统进化树。结果 hIL-29基因编码蛋白含200个氨基酸残基,其N-末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽的相对分子质量为20 018,理论等电点为9.08,肽链中含一个由胞内向胞外的跨膜结构域;hIL-29的空间构象由6个α螺旋（A～F）和无规则卷曲组成,螺旋A、B和F可能是hIL-29与特异性受体结合而发挥生物学效应的活性部位,A、F螺旋中有4个氨基酸残基可能是影响其生物学活性的关键氨基酸位点;系统进化分析显示,hIL-29与狗、猫、大熊猫、马、野猪、黑猩猩、长臂猿的IL-29具有较高的同源性,处于同一个大分枝,而人、黑猩猩、长臂猿的IL-29处于同一个小分枝,在系统进化树中的距离最近。结论关键位点氨基酸的差异可能对hIL-29的生物学活性影响较大,可作为对hIL-29进行分子改造的突变位点。本研究为后续进行hIL-29的定向改构及其构效关系等的深入研究奠定了理论基础。氧化型低密度脂蛋白的内皮损伤作用及其对人脐静脉内皮细胞中OX40L表达的影响
摘要：目的观察氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）的内皮损伤作用及其对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中OX40L表达的影响。方法采用CCK-8法检测不同浓度ox-LDL（50、100和150 mg/L）对HUVEC增殖活力的影响;流式细胞术检测100 mg/L ox-LDL处理的HUVEC细胞周期及凋亡率的变化;Western blot法检测不同浓度ox-LDL（50、100和150 mg/L）处理的HUVEC中OX40L蛋白的表达水平;免疫荧光及激光共聚焦检测100 mg/L ox-LDL处理的HUVEC中OX40L蛋白的定位,均设加入等量培养基的HUVEC作为对照组。结果与对照组相比,随着ox-LDL浓度的升高,HUVEC的增殖活力明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.01）;ox-LDL 100 mg/L组细胞被阻滞在S期,凋亡率明显增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）;与对照组相比,随着ox-LDL浓度的升高,HUVEC中OX40L的表达量逐渐升高,差异均有统计学意义（P〈0.05）;ox-LDL100 mg/L组HUVEC表达OX40L的荧光明显增强,差异有统计学意义（P〈0.01）,且OX40L蛋白定位于细胞膜及细胞质上。结论 ox-LDL对HUVEC具有明显的损伤作用,可促进HUVEC中OX40L的表达,影响OX40/OX40L炎症信号通路。猪附红细胞体ORF2蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测
摘要：目的预测猪附红细胞体[亦称猪嗜血支原体（Mycoplasma suis,M.suis）]ORF2基因编码蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位。方法应用生物信息学软件DNAstar的Editseq将M.suis中ORF2的基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列,与GenBank中登录的氨基酸序列进行比对,通过Protean模块预测ORF2蛋白的二级结构及其亲水性区域、柔韧性区域、抗原指数、表面可及性等特性,并预测B细胞优势抗原表位。结果 ORF2蛋白具有规则的二级结构,多处于亲水性区域、柔韧性区域、表面可及性较大和抗原指数较高的区段,潜在的优势B细胞抗原表位为17~23、121~127、138~144、192~200氨基酸区段。结论预测了ORF2蛋白二级结构和B细胞抗原表位,为M.suis表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。重组干酪乳杆菌贮存期内质粒稳定性及活菌数的检测
摘要：目的检测产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）基因重组干酪乳杆菌（Lactobacillus casei,L.casei）贮存过程中质粒的稳定性及活菌数的变化。方法将ETEC K88重组干酪乳杆菌（pLA-K88/L.casei）接种于MRS培养基,转种WPC培养基,收集菌液,置4、15、37℃贮存。通过抗生素MRS（＋）和MRS（-）平板计数菌落数的方法及PCR法检测重组质粒在4℃贮存1、15、30、60、90和120 d的稳定性;Dot ELISA法检测菌液外源蛋白免疫学活性的变化;平板计数法检测4、15、37℃贮存1、2、3、7、15、30、60、90、120、210和240 d的活菌数。结果在4℃贮存120 d内,重组质粒稳定性良好,目的基因片段无缺失,外源蛋白活性稳定,乳清蛋白对工程菌的稳定性及外源蛋白的免疫原性均无影响;工程菌在4℃贮存效果最好,存活时间最长,第240 d活菌数仍保持在9×106cfu/ml以上,15和37℃贮存期仅为90和15 d。结论 ETEC基因重组干酪乳杆菌于4℃贮存条件下,质粒及外源基因表达稳定。
