铜绿假单胞菌3型O-特异性多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫特性分析
摘要：目的研制铜绿假单胞菌3型O-特异性多糖（O-specific polysaccharide,O-SP）-破伤风类毒素（Tetanus toxoid,TT）结合疫苗,并分析其免疫特性。方法采用热酚水法提取铜绿假单胞菌国际抗原分型系统（International Antigen Typing System,IATS）3型菌株的脂多糖（Lipopolysacchride,LPS）,去除类脂A后纯化O-SP,用1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化O-SP,己二酸二肼（ADH）作为连接臂,在碳二亚胺（EDAC）作用下,与TT结合制备O-SP-TT结合疫苗,检测其理化性质,并分析结合疫苗的免疫原性和免疫保护性。结果 O-SP收获量相当于水解LPS量的30%,其蛋白质和核酸含量均低于1.0%,O-SP衍化度为3.83%,O-SP与TT的结合率约为40%,多糖蛋白质比（w/w）为1∶2.18。O-SP-TT结合疫苗可刺激小鼠产生高效价的IgG抗体,与O-SP组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;结合疫苗免疫小鼠能保护5 LD50和10 LD50活菌的攻击,小鼠免疫O-SP-TT后兔抗血清对3 LD50和5 LD50活菌攻击具有良好的保护作用。结论制备的铜绿假单胞菌3型O-SP-TT结合疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性,该疫苗有望成为防治IATS 3型铜绿假单胞菌感染的有效疫苗。我国百日咳疫苗生产用菌株主要抗原片段基因序列分析
摘要：目的对我国百日咳疫苗生产用菌株主要抗原片段基因进行序列分析,为我国百日咳疫苗的研制和质量控制提供依据。方法分别从我国百日咳杆菌疫苗生产用菌株CS株基因组DNA中扩增百日咳毒素（Pertussis toxin,PT）、外膜蛋白（Pertactin,PRN）、菌毛蛋白2（Fimbriae 2,FIM2）、菌毛蛋白3（Fimbriae 3,FIM3）基因,克隆至pMD18-T载体,测序,并与GenBank中登录的百日咳杆菌其他菌株的PT、PRN、FIM2、FIM3基因序列进行比较,构建系统进化树。结果百日咳杆菌CS株PT、PRN、FIM2和FIM3基因的扩增产物大小均与预期一致。CS株PT基因与国内的另一疫苗生产株18323亲缘关系最近,在同一分支上,且与国际标准株Tohama在同一亚分支内;PRN、FIM2和FIM3基因与国际标准株Tohama均在同一进化分支上。结论百日咳杆菌CS株与国际标准菌株Tohama亲缘关系较近,与临床分离的其他流行株亲缘关系较远。人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选
摘要：目的构建人源抗狂犬病病毒单链抗体（Single-chain fragment variable,scFv）噬菌体抗体库,并进行筛选。方法以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定。以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验（Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT）检测噬菌体抗体颗粒的中和活性。结果获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性。结论已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法。戊型肝炎病毒ORF2蛋白与新型融合标签Halo Tag的融合表达
摘要：目的在大肠杆菌KRX中表达戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）ORF2与新型融合标签Halo Tag融合蛋白。方法采用RT-PCR法从4型HEV毒株中扩增ORF2基因部分片段（aa 382~620）,插入含新型融合标签Halo Tag的原核表达载体pFN18the中,构建重组表达质粒pFN18the-ORF2,转化大肠杆菌KRX,鼠李糖诱导表达Halo-ORF2融合蛋白,纯化后Western blot分析融合蛋白的反应原性。结果经RT-PCR扩增出717 bp的目的基因片段;重组表达质粒pFN18the-ORF2经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白Halo-ORF2相对分子质量为57 900,表达量约占菌体总蛋白的15%,以包涵体形式表达,纯化后纯度达90%以上,可与HEV IgG阳性血清特异性结合。结论在大肠杆菌KRX中表达了Halo-ORF2融合蛋白,为HEV结构蛋白抗原表位的筛选及戊肝血清学诊断的研究奠定了基础。Tollip体外转染HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制
摘要：目的探讨Tollip转染人肝癌细胞系HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制,为乙型肝炎的治疗寻找新的靶点。方法含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后,采用脂质体LipofectamineTM2000转染HepG2215细胞,共设4个转染组：脂质体转染对照组（15μl脂质体）、空质粒转染对照组（6μg空质粒、15μl脂质体）、空质粒重组质粒共转染组（3μg空质粒、3μg pCMV-HA-Tollip、15μl脂质体）及重组质粒转染组（6μgpCMV-HA-Tollip、15μl脂质体）,转染48 h后,收集细胞,经Western blot检测AKT、p-AKT、NF-κB以及HA标签蛋白的表达;收集上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg的水平。结果重组质粒pCMV-HA-Tollip经双酶切鉴定构建正确。空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组均有HA标签蛋白的表达,而脂质体转染对照组和空质粒转染对照组无HA标签蛋白表达;与空质粒转染对照组比较,空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组中NF-κB和p-AKT蛋白的表达明显降低（P〈0.01）,而AKT蛋白的表达无明显变化（P〉0.05）;空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量明显低于空质粒转染对照组（P〈0.01）,对HBsAg的抑制率分别为24%和41%,对HBeAg的抑制率分别为13%和31%。结论 pCMV-HA-Tollip重组质粒在HepG2215细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌,其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF-κB的表达有关。弱化二氢叶酸还原酶基因增进人神经生长因子β亚基在CHO细胞中的表达
摘要：目的通过弱化二氢叶酸还原酶基因（Dihydrofolate reductase,DHFR）增进人神经生长因子β亚基（β-Humannerve growth factor,β-hNGF）在CHO细胞中的表达。方法从质粒pUC18-β-NGF中扩增β-NGF基因,克隆至pMD18-T载体,构建克隆质粒β-hNGF/pMD18-T;经人工合成弱化SV40启动子与DHFR基因顺式表达元件,并插入pBudCE4.1质粒,构建质粒w-DHFR/pBudCE4.1;分别双酶切质粒β-hNGF/pMD18-T和w-DHFR/pBudCE4.1后连接,转化大肠杆菌Top10’,构建重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1,转染CHO-DHFR-后,筛选阳性细胞克隆,ELISA法检测阳性CHO细胞株表达β-NGF的水平,鸡背根神经节增殖法检测重组β-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1经酶切和测序证明构建正确;共获得5株表达β-hNGF的CHO细胞株,且表达的β-NGF能使神经节出现明显的神经纤维,表达量为0.1μg/μl。结论通过弱化SV40启动子和DHFR基因,在CHO细胞中成功表达了β-hNGF基因,表达量增加且具有生物学活性。人端粒酶蛋白催化亚单位基因逆转录病毒真核表达质粒的构建及其对人乳腺癌相关成纤维细胞增殖的影响
摘要：目的构建人端粒酶蛋白催化亚单位（Human telomerase reverse transcriptase,hTERT）逆转录病毒真核表达质粒,并检测其在人乳腺癌相关的成纤维细胞（Cancer-associated fibroblast,CAF）中的表达及其对CAF增殖的影响。方法扩增pIRES-EGFP-hTERT质粒,酶切回收hTERT片段,正向克隆至逆转录病毒载体pBABE-puro上,构建重组质粒pBABE-puro-hTERT,转染PT67细胞,进行逆转录病毒的包装。将PT67细胞上清感染原代培养的人乳腺癌CAF,荧光定量PCR和Westernblot分别检测hTERT基因在人乳腺癌CAF中的转录和表达,流式细胞术检测细胞的增殖情况。结果重组质粒pBABE-puro-hTERT经酶切和测序证实构建正确;与未处理的人乳腺癌CAF和感染pBABE-puro的细胞相比,感染重组质粒的人乳腺癌CAF中hTERT基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显增强,其增殖指数也明显增加（P〈0.05）。结论成功构建了hTERT基因逆转录病毒真核表达质粒,其能增强人乳腺癌CAF的增殖能力,为乳腺癌微环境CAF的研究提供了良好的细胞模型。柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析
摘要：目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒（Coxsackievirus B1,CVB1）分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。GINS2基因siRNA真核表达质粒的构建及其对NB4细胞凋亡的影响
摘要：目的构建GINS2基因siRNA真核表达质粒,并检测其对NB4细胞凋亡的影响。方法人工合成针对GINS2基因的4组siRNA干扰序列和1组无同源性的序列,测序鉴定后转染低传代人早幼粒细胞系NB4细胞,经G418筛选后,通过QRT-PCR、Western blot检测重组质粒对NB4细胞中GINS2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的影响;流式细胞术检测NB4细胞的凋亡情况。结果 5组重组质粒经测序证明构建正确,4组干扰质粒转染NB4细胞后,细胞中GINS2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均有所降低,其中干扰组1基因干扰率达50%,蛋白相对表达量为56%;干扰组1细胞凋亡率为32.54%,较正常对照组和NC组明显上升（P〈0.01）。结论成功构建了GINS2基因siRNA真核表达质粒,抑制GINS2基因的表达可促进NB4细胞的凋亡,为进一步研究GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化
摘要：目的筛选Ⅰ型登革病毒（Dengue virus,DV）中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化;免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态。结果在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID50/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因;病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常。结论成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性。肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化
摘要：目的构建肠道病毒71型（Entervirus71,EV71）3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。斑马鱼模型评价BCG-CpG-DNA的安全性
摘要：目的用斑马鱼模型对BCG-CpG-DNA进行安全性评价。方法以斑马鱼胚胎为实验材料,将BCG-CpG-DNA设置4个浓度组（0.15、1.5、15、75 mg/L）,暴露斑马鱼,以胚胎培养液暴露为空白对照组,以三甲基氯化锡（TMT）和全氟辛烷磺酸盐（PFOS）暴露为阳性对照组,胚胎期6 hp（f受精后6 h）脱膜,8 hpf进行暴露毒性实验,研究其对斑马鱼发育、遗传、免疫以及行为的毒性影响。每组做3个重复,试验重复3次。结果未观察到BCG-CpG-DNA各浓度组的斑马鱼胚胎明显的畸形和孵化死亡情况,其自主运动、触摸运动、行为检测、免疫强度检测与空白对照组相比,差异均无统计学意义（P〉0.05）。TMT对照组暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经等均有不同程度的影响,导致心胞肿大,对光暗刺激反应敏感,相对荧光强度明显增强,嗜中性粒细胞数量增多,对炎症的敏感性增强,与空白对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 BCG-CpG-DNA暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经均无明显的急性毒性作用,在斑马鱼的胚胎暴露中具有较好的安全性。人源溶菌酶基因在杆状病毒系统中的表达
摘要：目的在杆状病毒系统中表达人源溶菌酶（Human lysozyme,hLY）基因,为其临床应用和大规模生产奠定基础。方法将人工合成的含信号肽和不含信号肽的溶菌酶基因克隆至重组杆状病毒表达系统的载体中,构建重组穿梭质粒,转染sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达,溶菌试验验证表达产物的溶菌酶活性。结果重组克隆质粒PFastBacHTA-signal-lysozyme和PFastBac HTA-lysozyme的PCR产物分别可见444和393 bp的目的基因条带,测序结果证实重组克隆质粒构建正确。PCR结果显示Lysozyme-1、Lysozyme-2、slysozyme-1、slysozyme-2、slysozyme-3、slysozyme-4号重组穿梭质粒可扩增出目的条带。sf9-PHLY和sf9-PHSLY的表达产物经12%SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约17 500和19 300的特异蛋白条带;表达的两种重组蛋白均可与鼠抗6×His单抗特异性结合;表达产物具有溶菌酶活性。结论成功在杆状病毒表达系统中表达了hLY基因,为其临床应用和大规模生产奠定了基础。《中国生物制品学杂志》关于稿件优先数字出版的启事
摘要：为缩短学术周期,提高学术论文的时效性和影响力,争取创新性科研成果的首发权,《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网（CNKI）签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。连续3次基因抓捕构建人EEF1A1-人凝血因子Ⅶ杂合基因座
摘要：目的利用人类真核翻译延伸因子1A1（Human eukaryotic translation elongation factor 1A1,hEEF1A1）基因座完整的上下游调控序列和人凝血因子Ⅶ（Human coagulation factorⅦ,hFⅦ）基因组序列构建hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。方法首先构建连入6个同源臂的pBR322作为连续3次基因抓捕的载体;然后通过Red同源重组系统,在大肠杆菌内进行缺口修复。第一步将hEEF1A1基因3′端侧翼序列亚克隆至抓捕载体上,第二步将hFⅦ完整基因组序列亚克隆至抓捕载体上,第三步将hEEF1A1基因5′端完整侧翼序列亚克隆至抓捕载体上。结果经3次基因抓捕,3个基因片段在抓捕载体上无痕连接,形成一条长约50 000 bp的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。经PCR、酶切及测序验证,构建的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座中,原hEEF1A1基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ基因组序列精确置换。结论成功构建了hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座,为哺乳动物细胞表达大载体的制备提供了实验依据。结肠癌源性exosomes的分离及其相关免疫学性质
摘要：目的分离结肠癌细胞株的exosomes,并分析其在致敏抗原呈递细胞及激活相关效应细胞过程中的作用。方法差速离心法分离体外培养的正常exosomes和经热休克处理的sw1116细胞（Heat shocked sw1116,HS-sw1116）分泌的exosomes（Heat shocked exosomes,HS-Exo）,并在电子显微镜下观察exosomes和HS-Exo的形态结构;SDS-PAGE初步分析exosomes和HS-Exo的蛋白组分,CCK-8法检测其促外周血单个核细胞（Peripheral blood monouclear cells,PBMCs）增殖的能力。结果电子显微镜观察,exosomes和HS-Exo的形态学结构无明显差异,其平均直径约为150 nm;exosomes和HS-Exo的蛋白条带分布情况基本相同,在高相对分子质量区域蛋白分布较多;exosomes比sw1116细胞更易引起PBMCs的增殖反应,HS-sw1116细胞和HS-Exo促PBMCs增殖的作用比sw1116细胞和exosomes更明显（P〈0.05）。结论结肠癌sw1116细胞株可分泌exosomes,其比肿瘤细胞更易引起PBMCs的增殖,热休克处理可进一步增强细胞和exosomes的促PBMCs增殖的能力,exosomes在结肠癌免疫治疗方面具有重要的应用价值。FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响
摘要：目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞（P〈0.05）。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组（P〈0.01）;细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组（P〈0.05）。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组（P〈0.01）,S期细胞比例显著低于SGC-7901组（P〈0.01）。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。甲型肝炎病毒与水痘病毒感染2BS细胞的超微结构变化
摘要：目的观察甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）、水痘带状孢疹病毒（Varicella zoster virus,VZV）分别感染与共同感染二倍体细胞2BS株时细胞超微结构的变化。方法电镜观察HAV单独感染21、23、25 d,VZV单独感染1、3、5 d及HAV感染21 d后再以VZV感染1、3、5、7 d的2BS细胞的超微结构。结果与正常对照2BS细胞相比,单独感染HAV的2BS细胞超微结构无明显变化;单独感染VZV的2BS细胞的超微结构主要出现核膜破坏;HAV与VZV共同感染的2BS细胞核内出现VZV包涵体,核膜缺失,胞浆中可见HAV与VZV形态,且细胞粗面内质网和滑面内质网膨胀,内质网小池内有致密颗粒。结论HAV与VZV共同感染的2BS细胞的超微结构与两种病毒单独感染的细胞的超微结构存在不同的变化规律和形态特征,先感染HAV后感染VZV的2BS细胞比单独感染VZV的2BS细胞受到的破坏程度轻。
