狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析
摘要：目的克隆狂犬病病毒（Rabies virus，RV）4aG株G蛋白基因，并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较，为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV4aG株中扩增G蛋白基因，并进行序列测定，利用生物信息学软件绘制系统进化树，预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位，并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示，4aG株与CVS株的进化关系较远；4aG、4aGVl8、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间，其他毒株在459-478氨基酸之间；PV株有5个糖基化位点，RV．97株有3个糖基化位点，其他毒株均有4个糖基化位点；G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间；不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同，与CVS株比较，PV株抗原表位与其最为接近，4aG、4aGVl8、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大，但其在Vero细胞上传代稳定，可用于制备Vero细胞纯化疫苗。鼠疫组分疫苗F1抗原、rV抗原含量的检测及其质量控制
摘要：目的采用双抗体夹心ELISA法检测鼠疫组分疫苗中F1和rV的抗原含量。方法利用Fl、rV抗原单克隆抗体，对鼠疫组分疫苗原液进行抗原鉴别试验；分别应用F1、rv抗原双抗体夹心ELISA法对疫苗原液进行抗原定量检测；验证AI（OH），佐剂吸附抗原的完全性；将疫苗成品于4℃放置18个月，分别于1和18个月时取样，用建立的双抗体夹心ELISA法检测F1和rV抗原含量，分析抗原的稳定性；对3批鼠疫菌rV抗原原液3步纯化工艺进行验证。结果鼠疫组分疫苗原液中的F1和rV抗原具有良好的反应原性；用建立的双抗体夹心ELISA法检测4批F1和rV抗原原液中F1和rV抗原的含量与Lowry法检测结果的误差均在±20％以内；4批鼠疫组分疫苗离心后的上清液中均未检测到F1和rV抗原，表明AI（OH），佐剂吸附抗原完全；4℃保存18个月，疫苗中的F1和rV抗原含量稳定；3批鼠疫菌rV抗原原液经阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析3步纯化，rV抗原在纯度增加的同时，抗原含量也增加。结论已建立的Fl、rV抗原双抗体夹心ELISA法可用于鼠疫组分疫苗中Fl和rV抗原的定量检测。《中国生物制品学杂志》关于稿件优先数字出版的启事
摘要：为缩短学术周期，提高学术论文的时效性和影响力，争取创新性科研成果的首发权，《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网（CNKI）签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。“优先数字出版”是以印刷版期刊录用稿件为出版内容，先于印刷版期刊出版日期的数字出版方式，属于正式出版范畴。乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性
摘要：目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SAl4．14．2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27／3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1：1比例混合，加入保护剂，冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度，细胞病变法检测风疹病毒滴度；通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全．I生试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内；联合疫苗于37℃放置7d，与放置前相比，风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1．0LgCCID50／ml和1．0LgPFU／ml，符合《中国药典》三部（2010版）要求；联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应；鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部（2010版）要求；联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后，乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性，本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗的稳定性
摘要：目的考察毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液和成品的稳定性。方法将3批疫苗原液置4℃存放，分别于0、1、2、3、6个月时取样，测定其在各时间点的乙型肝炎表面抗原S、前S1（PreSl）、前S2（PreS2）抗原滴度及HPLC纯度；将3批疫苗成品置25℃和4℃存放，进行加速稳定性和长期稳定性试验，分别于0、1、2、3、6个月和0、3、6、9、12、18、24个月时取样，进行小鼠效力、pH值、细菌内毒素和无菌测定。结果3批疫苗原液于4oc保存6个月，表面抗原S、PreSl、PreS2抗原滴度及HPLC纯度均无明显变化；3批疫苗成品于25℃放置6个月和4℃放置24个月，各个时间点的小鼠效力均符合暂定规程的要求，pH值保持稳定，细菌内毒素和无菌试验均符合《中国药典》三部（2005和2010版）要求。结论毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液及成品稳定性良好。无明胶保护剂在麻疹风疹联合减毒活疫苗中的应用
摘要：目的研制一种安全有效的无明胶保护剂，并应用于麻疹风疹联合减毒活疫苗的制备。方法制备麻疹风疹联合减毒活疫苗原液，取同一批麻疹病毒原液，分别加入不同成分和配比的无明胶保护剂，制成成品，以含明胶保护剂作对照，检测成品外观、病毒滴度及水分，确定保护剂的成分，再确定保护剂的配比。将麻疹与风疹病毒原液混合，加入筛选出的无明胶保护剂，制备麻疹风疹联合减毒活疫苗（共3批），同时制备3批含明胶保护剂对照疫苗。按《中国药典》三部（2010版）要求对联合疫苗原液、半成品、成品进行检定；分别将制备的联合疫苗于2～8℃放置3和6个月，检测疫苗外观、病毒滴度及水分的变化，于37℃放置1、2．3、4周，检测病毒滴度的变化；按《中国药典》二部（2010版）要求进行过敏试验。结果含海藻糖和右旋糖酐成分的保护剂为首选保护剂。制备的无明胶保护剂联合疫苗原液、半成品及成品的各项检定指标均符合《中国药典》三部（2010版）要求；无明胶保护剂联合疫苗成品于2-8℃放置6个月的水分和病毒滴度及37℃放置4周的病毒滴度与对照组疫苗相比，差异均无统计学意义（P〉0．05）；注射了无明胶保护剂联合疫苗的豚鼠在试验期内均未发生过敏反应，符合《中国药典》二部（2010版）的要求。结论无明胶保护剂对麻疹和风疹病毒具有较好的保护作用。肺炎链球菌pbp1a基因重组原核表达质粒的构建与鉴定
摘要：目的构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）pbpla基因重组的原核表达质粒，并进行鉴定。方法化学合成S．pneumoniae含STMK区的p6pla基因片段，PCR扩增后，与pUCl9载体连接，构建重组表达质粒pUCl9-pbpla，转化耐青霉素的p如la基因突变的S．pneumoniae，测定青霉索对转化菌的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC），以鉴定PBPla的活性；SDS-PAGE和Westernblot分析重组PBPla蛋白的表达。结果p6pla基因扩增产物可见约330bp的特异条带，大小与预期一致，测序表明重组质粒全长360bp，无碱基的缺失、插入等突变；青霉素对转化菌的MIC从8μg／ml下降为2μ／ml；表达的重组PBPla蛋白相对分子质量约为11000，可与抗＆pneumoniae青霉素敏感株兔血清特异性结合。结论成功构建了S．pneumoniae.pbpla基因重组原核表达质粒，其能在S．pneumoniae中表达有活性的PBPla蛋白，为进一步研究PBPs在细菌耐药变异中的作用提供了实验材料，也为进一步探讨消除细菌耐药性变异的措施奠定了基础。Wistar大鼠热休克蛋白70基因重组腺病毒质粒的构建及病毒制备
摘要：目的构建Wistar大鼠热休克蛋白（Heat shock protein 70，HsP70）基因重组腺病毒质粒，并制备重组腺病毒。方法利用RT-PCR技术从Wistar大鼠脾脏组织中扩增HSP70基因序列，并克隆至pMDl8-T载体中，测序鉴定后，将克隆的HSP70基因编码阅读框亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中，并利用I-CeuI与I-SceI将重组穿梭质粒上的HSP70基因的表达框切下，连接到携带腺病毒骨架载体pAdxsi上。重组腺病毒质粒经PacI酶切线性化后，转染至293（R）细胞进行病毒的包装，获得重组腺病毒pad-CMV-HSP70，收集病毒上清，感染BRL细胞，Westernblot检测BRL细胞中HSP70的表达。病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后，检测重组腺病毒纯度、颗粒滴度及感染性滴度。结果克隆质粒、穿梭质粒经PCR及酶切鉴定，均可见2269bp的目的基因条带，测序结果与GenBank登录的序列一致；XhoI酶切结果显示，HSP70基因已正确克隆至腺病毒质粒中；重组腺病毒感染BRL细胞后，细胞中HSP70的表达量显著升高（P〈0．01）；重组腺病毒纯化后纯度为1．29，颗粒滴度为5．31×10^12VP／ml，感染性滴度达1×10^11pfu／ml。结论已成功构建Wistar大鼠HSP70基因重组腺病毒质粒，并制备出高滴度的重组腺病毒颗粒，为进一步研究HSP70的生物学活性及作用机制奠定了基础。嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB的构建与鉴定
摘要：目的构建携带FLAG-3NLS-FRB融合基因的嵌合腺病毒，并检测其在AD．293细胞中的表达。方法将FLAG标记的3段核定位信号（FLAG-3NIJs）与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域（FRB）基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中，测序鉴定后，与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组，获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB,感染AD-293细胞进行包装、扩增。采用基因转移单位（Genetransferunit，GTu）法测定病毒滴度；RT．PCR及Westernblot检测FLAG-3NLS-FRB在AD-293细胞中的转录及表达。结果腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确；FLAG-3NLS-FRB正确克隆至腺病毒骨架质粒中；在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB，病毒滴度为2．0×10^13GTU／ml；嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36h，在细胞中可检测到FLAG-3NI-S-FRB基因的转录和蛋白的表达。结论成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB，并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB融合蛋白。人松弛素H2类似物在毕赤酵母中的高效表达及其活性
摘要：目的利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达人松弛素H2类似物Humanrelaxin．2analogue，HR2），并检测其生物活性。方法通过密码子优化合成HR2基因，构建重组表达质粒pPICZαA-HR2，转化毕赤酵母菌GSll5，甲醇诱导表达，并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Westernblot分析。表达产物经超滤和柱层析纯化后，切除人工c肽，检测其生物活性。结果经双酶切鉴定和测序证实，重组表达质粒pPICZαA-HR2构建正确；Tricine-SDS-PAGE分析显示，表达的重组蛋白相对分子质量约6500，表达量占菌体总蛋白的47．6％，为451μg／ml，且为分泌表达；Westernblot分析显示，重组蛋白具有良好的反应原性；纯化的重组蛋白纯度达96％；经检测C肽切除的重组HR2对THP-1细胞具有刺激活性。结论成功在毕赤酵母GSll5中高效分泌表达了重组松弛素H2类似物，并具有一定的生物活性。microRNA沉默卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白基因对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的治疗作用
摘要：目的探讨靶向卡氏肺孢子菌（Pneumocystiscarinii，PC）主要表面糖蛋白基因（Major souface glycoprotein gene，MSG）上游保守序列（upstream conserved sequence，UCS）的microRNA重组质粒对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia,PCP）的治疗作用。方法将sD大鼠经腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠7周，制备大鼠PCP感染模型。将模型大鼠随机分为5组：microRNA重组质粒治疗组（M组）、磺胺药物治疗组（H组）、生理盐水对照组（c1组）、空载体质粒对照组（c2组）和模型对照组（C3组），其中M组和C1、C2组经尾静脉分别注射含microRNA重组质粒pPC-ucs、生理盐水和空载体，H组用磺胺药物灌胃治疗，C3组不做处理，每日1次，疗程为7d。1周后吉姆萨染色，油镜下计数大鼠肺组织液印片中PC包囊数；HE染色，光镜观察肺组织病理改变；ELISA法检测大鼠血清中IL-10和IFNy的表达水平；RT-PCR法检测肺组织中PCMSG-UCSmRNA的表达水平；电镜观察PC的超微结构。结果与c1、C2和c3组相比，M组和H组大鼠肺组织PC包囊数均明显减少（P〈0．05），肺组织炎症较轻，大鼠血清IL-10的表达水平均显著降低（P〈0．05），而IFNγ的表达水平显著升高（P〈0．05），大鼠肺组织PCMSG．UCSmRNA的表达水平均显著降低（P〈0．05）；电镜观察显示，M组和H组PC包囊表面均出现破损，Cl、C2、C3组未发现破损。结论micmRNA重组质粒pPC．UCS对大鼠PCP有明显的治疗作用，为治疗PCP提供了新的思路。转化生长因子-β1基因shRNA表达质粒的构建及其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响
摘要：目的构建转化生长因子-β1（Transforminggrowthfactor-β1，TCV-β1）基因短发夹RNA（Short hairpin RNA，shRNA）表达质粒，并观察其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响。方法设计并合成2对靶向TGF．B1基因的RNA干扰序列和1对阴性对照序列，并构建重组表达质粒pshRNA-TGF-βa、pshRNA-TGF-βlb和pshRNA-TGF-β1c（阴性对照），以脂质体介导转染SW480细胞，荧光显微镜观察转染情况；RT-PCR和Western blot检测转染细胞中TGF-βl基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平；Transwell侵袭试验检测沉默TGF-β1基因表达对细胞侵袭能力的影响。结果TGF-β1基因shRNA重组表达质粒经酶切鉴定和测序分析证明构建正确。与空白对照组相比，3种质粒转染的细胞均有较强的荧光表达；pshRNA-TGF-β1a和pshRNA-TGF-β1b组细胞TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显减低（P〈0．05）；SW480细胞的侵袭能力也明显降低（P〈0．05）。结论成功构建了TGF-β1基因shRNA重组表达质粒，其能有效抑制结肠癌细胞SW480中TGF-β1基因的表达，并可显著降低细胞的侵袭能力，为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。人肺癌ILK基因siRNA重组表达质粒的构建及其对A549细胞增殖的影响
摘要：目的构建人肺癌整合素连接激酶（Integrin-linked kinase，ILK）基因siRNA重组表达质粒，并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列，克隆至载体pGenesil-1中，构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK利用脂质体转染A549细胞，经G418稳定筛选后，采用RT．PCR和Westernblot检测细胞中ILK基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平，MTr法检测细胞的增殖活力。结果重组表达质粒pGenesil-1．ILK经salI单酶切及测序证明构建正确，其转染A549细胞后，细胞ILK基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低（P〈0．05），且细胞的增殖能力也显著降低（P〈0．05）。结论成功构建了人ILK基因siRNA重组表达质粒，ILK基因沉默可显著抑制A549细胞增殖，为肺癌靶向基因治疗的研究提供了新的思路。活性氧物质在多柔比星诱导的心肌细胞凋亡中的作用
摘要：目的观察活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）在多柔比星（Doxorubicin，Dox）诱导的心肌细胞凋亡中的作用。方法将大鼠胚胎期心肌细胞H9C2分为对照组、Dox0．1p．mol／L组和Dox1．0μmol／L组，Dox作用24h后，采用硫代巴比妥酸（Thibatituri cacid，TBA）法检测丙二醛（Malondialchehyche，MDA）含量；血浆三价铁降低能力法（Ferricreducingabilityofplasma，FRAP）检测总抗氧化能力（Total antioxidation capability，T．AOC）；DCFH-DA荧光探针染色法检测ROS含量；JC．1染色法检测线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，△ψm）；TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数（AI）。结果与对照组相比，DOX1．0μmol／L组MDA、ROS含量及AI显著上升（P〈0．05），T．AOC及△ψm显著下降（P〈0．05）。结论Dox诱导心肌细胞凋亡过程中，ROS生成增加，超过了抗氧化体系的清除能力，氧化应激损伤机制发挥了重要作用。L-精氨酸对人肝细胞中内源凝血因子Ⅷ表达的激活作用
摘要：目的探讨L-精氨酸对人肝细胞LO2中内源凝血因子Ⅷ（CoagulationfactorⅧ，FⅧ）表达的激活作用。方法将LO2细胞分为试验组和对照组，试验组加入L精氨酸（终浓度为10mmol／L）分别培养24、36、48和60h，对照组用等体积的灭菌水取代L精氨酸培养。采用RT-PCR法检测LO2细胞中人FⅧ基因mRNA的转录水平并测序鉴定，一期法检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性（FⅧ：c），Western blot检测24、48h时相点LO2细胞中人FⅧ蛋白的表达，免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察L-精氨酸作用48h后LO2细胞中人FVI的表达。结果加入L-精氨酸培养36、48、60h后，LO2细胞中有人FⅧ基因mRNA的转录，而对照组未出现人FⅧ基因mRNA的转录；各时相点两组细胞培养上清液中人FⅧ：C的水平差异均无统计学意义（P〉0．05）；Westernblot及激光共聚焦均观察到加L-精氨酸培养48h后LO2细胞中出现人FⅧ的表达，而对照组细胞中均无人FⅧ的表达。结论L-精氨酸可激活人正常肝细胞中内源FⅧ的表达。人参皂苷Rgl诱导人红白血病K562细胞株衰老与p16-Rb信号通路的相关性
摘要：目的探讨人参皂苷Rgl（以下简称Rgl）诱导人红白血病K562细胞株衰老与p16-Rb信号通路的相关性。方法以不同浓度的Rgl（0、5、10、20、40和80μmol／L）作用于K562细胞不同时间（24、48、72h），MTr法筛选Rgl抑制K562细胞增殖的最佳作用浓度及作用时间，以该浓度干预K562细胞不同时间，流式细胞术检测细胞的细胞周期；以最佳浓度Rgl干预K562细胞最佳时间，集落培养法检测细胞集落形成能力；衰老相关-13-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色检测阳性细胞百分率；透射电镜观察细胞的超微结构；Southernblot检测细胞的端粒长度；Westernblot检测细胞中P16和RB蛋白的表达。结果Rgl在体外可明显抑制K562细胞增殖，其最佳作用浓度及作用时间分别为20μmol／L和48h；经20μmol／LRgl诱导48h的K562细胞与常规培养对照组相比，细胞出现G：／M期阻滞（P〈0．05），集落形成能力明显减弱（P〈0．05），SA-β-Gal染色阳性率增加（P〈0．01），细胞体积增大，且溶酶体，线粒体体积增大，数目增多，端粒缩短加速（P〈0．05），P16和RB蛋白表达上调（P〈0．05）。结论Rgl能诱导人红白血病K562细胞株衰老，可能与Rgl激活了p16-Rb信号通路有关。人参皂苷单体Rh2（S亚型）对人急性髓系白血病细胞株KG1α增殖、凋亡的影响及其机制
摘要：目的探讨人参皂苷单体Rh2（S亚型）对人急性髓系白血病细胞株KG1α增殖、凋亡的影响及其机制。方法取对数生长期的KGlα细胞，分为两组：空白对照组（常规培养）和人参皂苷单体Rh2（S）组，采用MTr法检测细胞的增殖活力，倒置显微镜观察细胞的形态及数量，透射电镜观察细胞的超微结构，流式细胞仪检测细胞周期的分布，Real-time PCR检测细胞中β-cenin基因mRNA水平，免疫细胞化学法检测细胞中β-cenin、TCF4、CyclinDl蛋白的定位及表达,Westernblot检测细胞中β-caenin、TCF4、CyclinDl蛋白的表达水平。结果人参皂苷单体Rh2（S）对KGla细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。与空白对照组比较，Rh2（S）作用48h后，可见KGla细胞分散生长，数量明显减少；可见数量不等，程度不同的凋亡细胞；Go／Gl期细胞比例明显上升（P〈0．05），G2＋M和s期细胞比例明显下降（P〈0．05）；细胞中β-catenin基因mRNA水平明显降低（P〈0．01）。β-catenin、TCF4、CyclinDl蛋白的表达水平明显降低（P〈0．05或P〈0．01）。结论人参皂苷单体Rh2（S亚型）对KGla细胞具有明显的增殖抑制作用，其机制可能抑制Wnt／B-cenin／TCF4／CyclinDl信号通路，使细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。Corning CelISTACK -40培养室培养MDBK细胞的效果
摘要：康宁公司开发出一种用于大量培养黏附细胞的可放大培养体系-CelISTACK培养室，最小的为ceUsltACK-1培养室，其细胞生长面积为636cm^2；最大的为CellSTACK-40培养室，其细胞生长面积为25440cm^2。将MDBK细胞分别接种至CellSTACK-40培养室与一种类似产品（也为40层培养室），接种量均为15000个／cm^2，
