PPE68基因重组卡介苗的构建及其免疫原性
摘要：目的构建携带结核分枝杆菌PPE68基因的重组卡介苗（BCG）,并检测其诱导小鼠的免疫应答情况。方法将带有分枝杆菌复制子OriM的穿梭质粒pBudCE4.1/PPE68/OriM电转化入BCG中,PCR鉴定重组BCG。用鉴定正确的PPE68/OriM重组BCG免疫BALB/c小鼠,每2周免疫1次,共3次,末次免疫后2周采血,分离血清,检测血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平;取脾、肺,分离脾淋巴细胞,检测经特异性蛋白刺激后淋巴细胞的增殖水平;进行脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞计数,计算CD4＋/CD8＋比值;检测脾、肺荷菌量并观察组织病理变化。结果 PPE68/OriM重组BCG经PCR鉴定构建正确;其免疫小鼠后,可诱导小鼠血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平显著增加（P〈0.05）,脾淋巴细胞增殖显著（P〈0.05）,CD4＋和CD8＋T细胞百分比增加,CD4＋/CD8＋T细胞比值降低,脾、肺均无菌落生长且未见明显病理改变。结论成功构建了PPE68基因重组BCG,其免疫BALB/c小鼠能明显提高小鼠的Th1型免疫效应,有利于机体抗结核菌感染。狂犬病病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代适应性
摘要：目的探讨狂犬病病毒（Rabies virus,RV）aG株在原代鸡胚成纤维细胞上的传代适应性。方法将RV北京株固定毒10aG株豚鼠脑毒种在鸡胚成纤维细胞上连续传代培养,显微镜观察细胞的形态变化,ELISA检测各代次收获液中的病毒量,取11、21、31代病毒收获液,小鼠脑内毒力测定法检测病毒滴度。利用正交试验筛选最适病毒培养条件,以筛选的最佳比例接种病毒,绘制病毒生长曲线,并进行特异性及免疫原性检测。结果狂犬病病毒aG株感染鸡胚成纤维细胞未观察到明显的细胞病变效应,随着传代次数的增加,病毒含量呈上升趋势,11、21、31代病毒收获液的滴度分别为4.0、7.7和7.17 LogLD50/ml;多次传代后,最适培养条件为细胞浓度150×104个/ml、接种比例1∶500、血清浓度2%、收获时间为5 d;病毒连续收获3次后,细胞开始脱落,经检测其病毒滴度可达7.0 logLD50/ml以上,中和指数可达8 500,第21代病毒制备成的试制疫苗效价为2.0 IU/ml。结论 RV北京株固定毒10 aG株豚鼠脑毒种可适应于鸡胚细胞培养,为鸡胚细胞狂犬病疫苗的研究奠定了基础。甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白的原核表达、纯化及其免疫保护性
摘要：目的原核表达、纯化甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,并检测其免疫原性和免疫保护性。方法采用PCR从甲型副伤寒沙门菌（CMCC 50973）基因组DNA中扩增btuB基因,插入原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经分子筛和亲和层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中抗BtuB IgG抗体效价,并用最小绝对致死剂量活菌攻毒,计算小鼠的保护率。结果重组原核表达质粒pET-30a-btuB经双酶切和测序证实构建正确;重组蛋白的相对分子质量约为67 000,表达量约为菌体总蛋白的25%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度大于90%,可与鼠抗His-Tag单抗特异性结合;纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠可获得高效价的抗BtuB IgG抗体,且可获得60%的保护率。结论成功原核表达并纯化了甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,重组蛋白免疫原性良好,并能够为小鼠提供一定的保护作用。重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定
摘要：目的构建携带绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011PFU/ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点。单纯疱疹病毒-1基因转移载体在BALB/c小鼠体内的生物分布
摘要：目的研究单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）基因转移载体在BALB/c小鼠体内的生物分布。方法建立实时定量PCR反应方法,并对方法进行验证。BALB/c小鼠经肌肉注射1×107pfu HSV-1,每隔2 d给药1次,共3次。分别于末次给药后24 h和63 d摘取组织脏器,采用建立的实时荧光定量PCR法检测不同组织脏器中HSV-1基因拷贝数。结果建立的荧光定量PCR法线性范围宽,特异性强,重复性好。HSV-1基因转移载体广泛分布于各个组织器官,主要分布在背根神经节、注射部位、肺和脾脏,分布量随注射时间的延长逐渐下降。结论 HSV-1经肌肉注射后,能高效地将目的基因转运到小鼠体内的各个部位;HSV-1能为基因转移提供安全,有效的载体平台。脓肿分枝杆菌非溶血性磷脂酶C的原核表达及活性鉴定
摘要：目的原核表达脓肿分枝杆菌非溶血性磷脂酶C,并检测其生物学活性。方法以脓肿分枝杆菌标准株（ATCC19977）基因组DNA为模板,PCR扩增非溶血性磷脂酶C基因,克隆至pQE-30载体,构建重组原核表达质粒pQE-30-MAB0555,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2＋-NTA层析纯化后,采用杯碟法检测其生物学活性。结果重组原核表达质粒pQE-30-MAB0555经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为53 000,纯化后蛋白浓度为0.40 mg/ml,具有溶解蛋黄中卵磷脂的酶活性,无溶血活性。结论成功地在大肠杆菌DH5α中表达了非溶血性磷脂酶C,为进一步研究其生物学功能及其在脓肿分枝杆菌致病机制中的作用提供了材料,也为研制脓肿分枝杆菌临床治疗药物及寻找新的药物作用靶点提供了思路。慢性脑血流灌注不足对老龄大鼠海马组织CA1区ABCA1的表达及脂代谢的影响
摘要：目的探讨慢性脑血流灌注不足对老龄大鼠海马组织CA1区ABCA1的表达及血清中总胆固醇（Total cholesterod,TC）和高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）含量的影响。方法采用持久性双侧颈总动脉结扎法（Permanent occlusion of bilateral common carotid arteries,2VO）致老龄大鼠脑血流灌注不足,术后不同时间采用免疫组化法检测大鼠海马组织CA1区ABCA1的表达,全自动生化分析仪检测大鼠血清中HDL和TC的水平。结果术后1周,大鼠海马组织CA1区ABCA1表达阳性的细胞数与假手术组相比明显减少（P〈0.01）;术后2周,ABCA1阳性细胞数逐渐增多;术后3周,ABCA1阳性细胞数明显增加,数量最多,分布最广（P〈0.01）;术后4周,ABCA1阳性细胞数又开始下降（P〈0.01）。术后2周,与假手术组相比,大鼠血清中HDL和TC含量显著升高（P〈0.05）,随着缺血时间的延长,又逐渐降低,术后4周与术后2周相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 ABCA1和HDL、TC在血管性痴呆模型大鼠海马和血清中呈动态表达,推测ABCA1在血管性痴呆中发挥了保护作用。两种转基因载体对关节软骨细胞中内参基因转录水平的影响
摘要：目的探讨质粒型和腺相关病毒两种转基因载体对家兔关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB内参基因mRNA转录水平的影响。方法将携带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EFGP）报告基因的质粒型载体pcDNA6.2-EGFP和腺相关病毒载体AAV2-EGFP分别转染至体外培养的家兔关节软骨细胞中,荧光显微镜观测转染后关节软骨细胞中EGFP的表达,实时PCR技术检测两各组关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB基因mRNA转录水平的变化。结果转染48 h后,两组转基因关节软骨细胞中均可见明显的绿色荧光;与正常对照组相比,4个内参基因在两组转基因细胞内的转录水平均下调,其中GAPDH和TUBB基因下调较小,腺相关病毒载体对转基因的影响最小。结论腺相关病毒载体对关节软骨细胞中内参基因表达的影响低于质粒型载体,表明腺相关病毒对关节软骨细胞本身影响较小;GAPDH和TUBB基因可作为实验的内参基因校正目的基因的表达量。大鼠心肌缺血再灌注损伤后硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖表达的变化
摘要：目的观察大鼠心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）后硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan sulphate proteoglycans,HSPG）和多配体蛋白聚糖-1（Syndecan-1,SDC-1）表达的变化。方法将健康SD大鼠随机分为2组：MIRI组开胸结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注120 min,复制大鼠MIRI模型;假手术组只穿线不结扎冠状动脉。实验结束后,HE染色观察心肌组织形态学结构;RT-PCR、免疫组化及ELISA分别测定冠状动脉左前降支中HSPG和SDC-1基因mRNA的转录水平、蛋白的表达水平及血清中二者的含量。结果光镜下可见假手术组大鼠心肌纤维排列整齐,横纹清晰,无炎性细胞浸润;MIRI组大鼠心肌纤维肿胀,有灶性出血,大量炎性细胞浸润。与假手术组相比,MIRI组大鼠冠状动脉左前降支中HSPG和SDC-1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低（P〈0.05）,血清中HSPG和SDC-1的含量均明显增加（P〈0.05）。结论 MIRI可导致HSPG和SDC-1脱落而含量减少,推测HSPG和SDC-1在MIRI中起重要作用,有望成为评估MIRI病情发生发展过程的重要生物学检测标志之一。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。蛋白酶体抑制剂MG132对肝癌细胞生长的影响及其机制
摘要：目的探讨蛋白酶体抑制剂MG132对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15生长的影响及其机制。方法用不同浓度的MG132（0、250、500、1 000 nmol/L）处理HepG2和HepG2.2.15细胞,采用MTT法、流式细胞术和Western blot法检测其对两种细胞增殖、细胞周期和细胞中相关蛋白GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin表达的影响。结果经MG132处理后,两种细胞的增殖均受到明显抑制,致使细胞周期阻滞在G1期,细胞中pGSK-3β和β-catenin蛋白的表达量上升,且均呈剂量依赖性,其对HepG2.2.15细胞的影响更为显著。结论 MG132可通过使肝癌细胞中GSK-3β失活和细胞周期阻滞抑制细胞增殖,为MG132成为一种新型HCC治疗药物提供了实验依据。rhIL-12与HBsAg联合给药对食蟹猴rhIL-12药代动力学的影响
摘要：目的探讨重组人白细胞介素-12（Recombinant human interleukin-12,rhIL-12）与乙型肝炎表面抗原（HBsAg）联合给药对食蟹猴rhIL-12药代动力学的影响。方法以抗rhIL-12单克隆抗体为包被抗体,生物素标记的抗人IL-12单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心BAS-ELISA法,测定食蟹猴血清中rhIL-12含量,并对其进行验证。将食蟹猴分为HBsAg（90μg/kg,肌肉注射）与rhIL-12（0.5μg/kg,皮下注射）联用低剂量组和HBsAg（90μg/kg,肌肉注射）与rhIL-12（40μg/kg,皮下注射）联用高剂量组,分别于给药后不同时间采血,分离血清,用建立的BAS-ELISA法测定血清中rhIL-12浓度,采用统计矩方法计算药代动力学参数。结果建立的双抗体夹心BAS-ELISA法的最低定量限为31.25 pg/ml,特异性较强,精密性和准确性良好,检测不同条件处理的样品均保持稳定;联合给药后,食蟹猴血清中rhIL-12的浓度随其剂量的增加而增加,于9 h左右达峰值,高、低剂量组半衰期分别为（21.24±2.03）和（16.05±4.76）h。结论 rhIL-12与HBsAg联合给药对食蟹猴rhIL-12的药代动力学无影响,本研究为IL-12的临床应用奠定了基础。姜黄素对慢性脑缺血老龄鼠认知功能障碍和血清HDL水平的影响
摘要：目的观察姜黄素对慢性脑缺血老龄鼠认知功能障碍和血清高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）水平的影响。方法采用双侧颈总动脉永久性结扎（Permanent occlusion of bilateral common carotid arteries,2VO）建立老龄鼠慢性脑缺血模型,并将模型鼠随机分为单纯缺血组以及姜黄素高剂量组（100 mg/kg）和低剂量组（50 mg/kg）,另设假手术组和正常对照组,单纯缺血组、假手术组和正常对照组注射等量DMSO。各组均于术后24 h开始经腹腔注射,每日1次,连续30 d。采用Morris水迷宫行为学实验测试老龄鼠的空间学习及记忆功能,全自动生化分析仪检测血清HDL水平。结果给药30 d后,经连续5 d的训练,姜黄素高、低剂量组的逃避潜伏期均明显短于单纯缺血组（P〈0.01）,在原平台所在象限停留时间占总游泳时间的比例明显高于单纯缺血组（P〈0.01或P〈0.05）,血清中HDL水平明显高于单纯缺血组（P〈0.01）。结论姜黄素可以改善慢性脑缺血老龄鼠的认知功能障碍,并提高血清HDL水平。本实验为早期诊断血管性痴呆提供了新的生物学指标,也为姜黄素治疗血管性痴呆提供了新的药物靶点。轮状病毒结构蛋白VP6的原核表达及其作为检测抗原在病毒检测中的应用
摘要：目的原核表达轮状病毒（Rotavirus,RV）结构蛋白VP6,并初步应用于以VP6为检测抗原检测RV血清抗体的ELISA方法,用于不同型RV免疫后抗体水平的检测。方法提取TB-Chen株RV基因组RNA,采用RT-PCR法扩增VP6基因,插入表达载体pETL中,构建重组表达质粒pET-VP6,转化E.coli BL21（DE3）,表达rVP6。表达的rVP6经纯化后,与TB-Chen株（G2P[4]型）、Wa株（G1P[8]型）和SA11株（G3P[2]型）RV分别免疫豚鼠,制备血清抗体,以SA11株血清抗体,经Western blot鉴定纯化的rVP6,以纯化的rVP6为检测抗原,采用ELISA法检测不同型RV免疫血清抗体。结果重组表达质粒pET-VP6经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的rVP6相对分子质量约为45 000,表达量占菌体总蛋白的34.7%;纯化的rVP6纯度达90%以上,蛋白浓度为8.304μg/μl,可与豚鼠抗RV SA11株血清抗体发生特异性反应;以纯化的rVP6为检测抗原,可检测TB-Chen、Wa、SA11株和抗rVP6的豚鼠免疫血清抗体。结论成功地在大肠杆菌中表达了rVP6,以具有共同组/亚组抗原特异性的rVP6作为检测抗原,可检测同一组/亚组内不同型的RV血清抗体,为研制以VP6为检测抗原检测RV感染的ELISA试剂盒奠定了基础。甲型H1N1流感流行期间长春市孕妇流感发病情况与甲流疫苗接种意愿调查
摘要：目的调查甲型H1N1流感（简称甲流）流行期间长春市孕妇流感发病情况与甲流疫苗接种意愿。方法以2009年8月～2010年3月在长春市60个社区卫生服务中心进行围产期保健并建卡的7 080名孕妇为目标人群,根据孕期构成比,分别随机抽取32名孕早期、73名孕中期和75名孕晚期孕妇为调查对象,采用问卷调查法,于2010年3月15～18日通过电话调查该人群急性上呼吸道感染罹患情况、甲流疫苗免费接种政策知晓情况、接种意愿及不愿接种的原因。结果共获取了179名孕妇的基本信息,其中有12.85%的孕妇愿意接种甲流疫苗,教育程度及高危情况对孕妇接种甲流疫苗的意愿有显著影响（P〈0.001）;孕妇对甲流疫苗免费接种信息的知晓途径主要来源于社区防保医生告知（41.73%）;不愿意接种甲流疫苗的孕妇主要是担心疫苗的安全性;39.75%不愿意接种甲流疫苗的孕妇表示甲型H1N1流感再次出现高峰期时愿意接种。结论本次调查结果具有代表性,为今后采取有针对性的干预措施和干预渠道提供了依据,也为下一步重点人群疫苗接种的需求和预算提供了参考。佛山市南海区首例B群流行性脑脊髓膜炎病例的流行病学调查分析
摘要：目的对佛山市南海区首例B群流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）病例的流行病学特点进行调查分析,为进一步完善流脑防控策略与措施提供科学依据。方法查阅病例病案,访视病例家属及其他相关知情人,并进行病例的流行病学个案调查。结果患儿邱某某,男性,1岁2个月,于2011年7月11日开始发病,因发热、皮疹就诊并住院治疗,经抗感染、对症支持治疗后好转出院;发病前无与同类患者接触史;家庭居住条件和卫生环境一般;实验室检测证实,该病例为B群脑膜炎奈瑟菌感染;药敏试验显示,病原菌株对替卡西林、哌拉西林、美罗培南、亚胺培南、氨曲南、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星等均敏感,对复方新诺明、庆大霉素不敏感,对丁胺卡那霉素耐药;经采取综合预防控制措施,未出现二代病例。结论该病例确诊为佛山市南海区首例B群流脑病例,预防控制B群流脑的关键是采取以加强病原学检测、敏感药物使用为重点的综合防控措施。TCF7L2基因rs290487多态性与辽宁地区2型糖尿病发病的相关性
摘要：目的探讨TCF7L2基因rs290487多态性与辽宁地区2型糖尿病发病的相关性。方法选取2008年12月～2010年7月在中国医科大学附属第四医院内分泌科临床确诊为2型糖尿病的患者255例，提取患者全血基因组DNA，PCR扩增TCF7L2基因单核苷酸rs290487，PCR产物经ACCⅡ酶切后，琼脂糖凝胶电泳分析rs290487的多态性及等位基因rs290487的突变与2型糖尿病发病的相关性。结果TCF7L2基因rs290487TF、TC、CC3个基因型在2型糖尿病组与对照组的分布频率分别为48．24％、46．67％、5．10％和50．74％、40．39％、8．87％，组间差异均无统计学意义（P〉0．05）；TCF7L2基因rs290487多态位点在两组间的基凶型分布符合Hardy—Weinberg平衡定律；BinaryL Logistic回归校正了性别、年龄、体重指数、血压、血脂等因素后，TCF7L2基因rs290487多态性与2型糖尿病的发生无相关性（P〉0．05）。结论辽宁地区人群中TCF7L2基因rs290487多态性与2型糖尿病的发生无相关性。河南省息县和新安县健康人群乙型脑炎中和抗体阳性率及发病率
摘要：目的分析河南省信阳息县和洛阳新安县健康人群流行性乙型脑炎（乙脑）病毒中和抗体水平及发病率。方法选择息县和新安县为监测点,所监测健康人群按年龄随机分组,采用微量中和试验检测乙脑流行季节前（5月）后（11月）血清中和抗体水平,分析流行季节前后两县健康人群乙脑中和抗体阳性率和发病率及与年龄的相关性。结果息县健康人群中乙脑血清中和抗体平均阳性率在乙脑流行季节前达69.96%,中和抗体阳性率随年龄的增长而逐渐升高,20岁以上年龄组中和抗体阳性率达100%;新安县中和抗体阳性率随年龄变化起伏较大,出现＂双峰现象＂。两县5岁以下儿童中均有乙型脑炎病例出现,而新安县发病率亦出现＂双峰现象＂,存在成人乙脑病例,80岁以上人群发病率达26.93%。结论河南省信阳息县和洛阳新安县健康人群中乙脑血清中和抗体的阳性率与发病率密切相关;各年龄组人群之间的中和抗体阳性率及两县相同年龄组人群的中和抗体阳性率均有差别。
