小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析
摘要：【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97%以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol.L-1IPTG诱导1—5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。Ta过量表达蔗糖转运蛋白基因增强转基因小麦的耐旱性
摘要：【目的】创制过量表达TaSUT1A的转基因小麦,分析TaSUT1A在转基因小麦中的遗传及其对干旱胁迫的应答反应,选育抗旱的转基因小麦新种质。【方法】采用基因重组技术构建了TaSUT1A表达载体,利用基因枪介导法将该载体转入小麦品种科农199,通过Bialaphos筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用RT-PCR检测TaSUT1A在转基因T3植株中的表达情况,在此基础上,对3个转基因系的T4转基因植株进行抗旱性鉴定和抗旱相关生理指标分析,验证其抗旱能力。【结果】经PCR检测和RT-PCR验证,获得了转TaSUT1A小麦阳性植株,与非转基因对照相比,20%PEG胁迫处理显著诱导了转基因株系根叶组织中目标基因TaSUT1A的上调表达。抗旱鉴定和抗性生理分析显示,在20%PEG胁迫处理下,转基因株系的萌发率比非转基因对照平均提高了32.8%,显著高于非转基因对照,并促进初生根的萌发和生长,初生根长和胚芽鞘长比非转基因对照平均增加了81.72%和170.77%;在20%PEG胁迫处理下,转基因植株叶组织中的蔗糖和可溶性糖平均提高了42.95%和36.56%,根中蔗糖和可溶性糖平均提高了58.01%和43.01%,均显著高于非转基因对照植株;与未胁迫处理相比,20%PEG胁迫处理后非转基因植株叶中的SOD活性由105.4 U·g^-1FW升高到139.1 U·g^-1FW,而转基因植株的活性由107.7—115.3 U·g^-1FW提高到168.2—211.6 U·g^-1FW,显著高于非转基因对照,同时,转基因小麦株系的MDA的产生较非转基因对照平均降低了37.47%,显著减少了MDA的产生。【结论】TaSUT1A在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,促进逆境胁迫中小麦的萌发和生长,超量表达TaSUT1A可显著提高转基因小麦的耐旱能力。高粱丝黑穗病菌4号生理小种抗性基因的定位
摘要：【目的】对高粱的丝黑穗病菌4号生理小种抗性基因进行定位分析,筛选与抗病基因连锁的分子标记,为抗丝黑穗病育种奠定基础。【方法】以对高粱丝黑穗病菌1、2、3、4号生理小种均表现免疫的材料961541为母本,以对1、2、3号生理小种免疫、对4号生理小种感病的材料V4B及高感材料PI550607为父本,进行杂交,构建F2群体。采用菌土法在播种时进行田间接种,抽穗后对抗/感亲本、F1及F2群体材料进行发病率调查。利用微卫星分子标记技术（SSR）和分离群体分组分析法（BSA）对961541/V4B的F2群体进行抗病基因的定位分析。【结果】961541/V4B组合中,抗病亲本961541发病率为0,感病亲本V4B发病率为21.5%,F1发病率为0,F2群体发病率为7.25%;961541/PI550607组合中,高感亲本PI550607的发病率为64.81%,F1及F2群体发病率分别为0和5%。适合性检验表明,2个组合的F2群体的抗、感病株比率均符合15：1（χ^2=0.201、0.322,P〉0.05）,4号生理小种的抗病性受2对非等位基因控制。所试274对SSR引物中共有53对引物在抗、感亲本间存在差异。利用筛选出的53对引物进一步对抗、感池进行特异引物筛选,仅位于高粱第1染色体上的SSR引物Xtxp325在抗、感池间表现差异。其中,抗池与免疫材料961541的带型一致,感池与鉴别寄主V4B的带型一致;选取5对引物（Xtxp325、Xtxp302、Xtxp32、Xtxp340和Xtxp248）进行连锁图谱构建,构建的连锁图谱全长355.3 cM,4号生理小种抗性基因Shs1与Xtxp325之间的遗传距离为27.7 cM。【结论】高粱丝黑穗病菌4号生理小种的抗病性受2对非等位基因控制。构建的连锁图谱全长355.3 cM,与发表的连锁图谱有较好的对应关系,高粱丝黑穗病菌4号生理小种抗病基因位于第1染色体上,Shs1与Xtxp325的遗传距离为27.7 cM。砂姜黑土小麦根系性状与冠层光合对不同灌水方式的响应
摘要：【目的】明确小麦前期不同灌水方式对中后期根系性状、冠层光合及产量影响的潜在机理,揭示小麦根系性状与冠层光合间的关系。【方法】在人工玻璃防雨蓬下,设置以下10种灌水处理CK（生育前期水分充足）、W120d（苗后20 d灌水50 mm）、W240d（苗后40 d灌水50 mm）、W360d（苗后60 d灌水50 mm）、W480d（苗后80 d灌水50 mm）、W5100d（苗后100 d灌水50 mm）、W6120d（苗后120 d灌水50 mm）、W720d＋60d（苗后20 d灌水25 mm＋苗后60 d灌水25 mm）、W840d＋80d（苗后40 d灌水25 mm＋苗后80 d灌水25 mm）和W960d＋100d（苗后60 d灌水25 mm＋苗后100 d灌水25 mm）。研究前期不同灌水方式对小麦中后期根系性状、冠层单叶面积、叶绿素密度、光合速率、光合有效辐射、叶绿素荧光参数和产量的影响。【结果】小麦生育前期适当延迟灌水日期有利于增加总根长、总表面积、总体积、平均直径、总根尖数和总分叉数,其中W5100d与CK间的差异不显著,但两者显著高于W120d和W6120d。CK孕穗期和开花期的倒1、倒2和倒3叶的单叶面积最大,但与W5100d差异不显著,且总灌水量相同下灌水次数对冠层单叶面积的影响不显著。生育前期灌1水下冠层叶绿素密度随灌水日期的推迟呈先增加后下降的趋势,并以W5100d最高,W120d最低。W5100d孕穗期、开花期和灌浆中期的冠层光合速率显著高于CK,分别增加了7.5%、8.9%和8.9%,但冠层光合速率受灌水次数影响不明显。灌1水下,W5100d孕穗期、开花期和灌浆中期的冠层光合有效辐射最高,分别比W120d和W6120d显著增加了18.7%、9.7%、11.0%和5.7%、4.9%、4.3%。W5100d孕穗期和开花期的叶绿素荧光参数Fo、Fm、Fv/Fm、ΦpsII和ETR值最高,灌水次数对叶绿素荧光参数的影响不显著。W5100d的产量和收获指数与CK差异不显著,两指标分别比W120d和W6120d显著增加了15.4%、22.1%和3.2%、9.2%。【结论】生育前期过早和过80份国外春小麦种质资源抗条锈性评价
摘要：【目的】小麦条锈病是由小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst）引起的世界范围内小麦重要病害之一,培育和种植抗病品种是控制该病害的最有效策略。评价80份国外春小麦种质资源对中国当前小麦条锈菌流行小种的抗条锈性,为中国小麦抗条锈病育种提供依据和抗源。【方法】应用中国流行小麦条锈菌生理小种CYR29、CYR31、CYR32、CYR33以及致病类型PST-HY8和PST-V26对80份国外小麦种质资源进行苗期温室抗病性鉴定,以铭贤169和AvS为感病对照品种;并于2013年和2014年分别在陕西省杨凌和甘肃省天水进行田间成株期抗病性鉴定。根据苗期和田间成株期的抗病性鉴定结果对其进行抗病类型分类和评价。【结果】80份小麦种质资源的抗病类型可分为3类。第1类为全生育期抗病类型,有8份。其中PI660067、PI660119和PI660122在苗期和田间成株期均表现较高水平的抗病性。其余5个品系PI660056、PI607839、PI591045、TA5602和PI660064在苗期则对个别小种表现感病,并且在不同年份和不同测试地点成株期也表现感病。第2类为成株抗病类型,有28份。其苗期对所有测试小种均表现感病,有23份在田间成株期均表现抗病。但PI660075、PI660083、PI660085、PI660097和PI660107在不同年份和不同测试地点成株期表现感病。第3类为兼具成株期和对部分中国小种失去抗性的全生育期抗病类型,有44份,其苗期至少对一个测试小种表现抗病。有37份在田间成株期均表现抗病。但PI660065、PI660076、PI660079、PI660080、PI660095、PI660096和PI610750在不同年份和不同测试地点成株期表现感病。【结论】80份国外小麦种质资源中大部分对中国小麦条锈菌流行小种表现优良的抗病性。这些种质资源可作为抗源在今后抗病育种中加以利用,将丰富中国小麦抗条锈病基因的多样性。可能由于不同年份田间流行小种不同,造成一些�同时检测豇豆花叶病毒属与蚕豆病毒属病毒的通用RT-PCR检测方法
摘要：【目的】建立一个可同时检测豇豆花叶病毒属（Comovirus）和蚕豆病毒属（Fabavirus）病毒的通用RT-PCR检测方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在其保守区域设计简并引物,用于这2个病毒属病毒的通用RT-PCR检测,并进行灵敏性、特异性试验。为便于PCR产物直接测序,在简并引物中引入通用测序引物（RV-M和M13-47）,并通过序列分析对病毒种类鉴定。利用该方法对来自福建柘荣的太子参病毒进行检测验证。【结果】设计一对简并引物,建立了一个用于扩增豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒部分依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的通用RT-PCR方法。该方法成功用于检测安第斯马铃薯斑驳病毒（ApMoV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、蚕豆真花叶病毒（BBTMV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）和萝卜花叶病毒（RaMV）9种豇豆花叶病毒属病毒;蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）、蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2）2种蚕豆病毒属病毒共计17个分离物,而不能与同亚科的线虫传多面体病毒属病毒及健康寄主植物反应,显示出良好的广谱性和特异性。在简并引物的5′端分别加入一段非互补的通用测序引物序列（RV-M和M13-47）,不仅可以利用该通用测序引物进行PCR产物直接测序,而且检测灵敏度可以提高10—100倍。序列及系统发育分析表明,所扩增的序列可以把豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒区分到种的水平。利用该方法测定了BBSV的部分RdRp基因序列,显示出与RCMV具有最近的亲缘关系。利用该方法在太子参中检出BBWV2。【结论】建立的通用RT-PCR方法可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的广谱性检测,结合序列可进行病毒种类的快速鉴定,并且可能用于新病毒种类的检测鉴定。玉米蚜在8个玉米品种（系）上取食行为的比较分析
摘要：【目的】明确玉米蚜（Rhopalosiphum maidis）在8个玉米品种（系）上的取食行为,筛选出合适的刺吸电位（EPG）参数作为对不同玉米品种（系）进行抗蚜性分类的指标,为抗性玉米材料的筛选提供借鉴。【方法】利用直流型刺吸电位仪（DC-EPG Giga-4）记录玉米蚜在8个玉米品种（系）上的取食行为并进行比较分析,8个品种（系）分别为浚单20、郑单958、良玉88、先玉335、濮改340-1-1、旱21、87-1和齐319;以不同EPG参数为指标,对供试玉米品种（系）的抗蚜性进行分类,并与田间抗蚜性鉴定结果进行比较,之后选择合适的EPG参数,建议其可作为利用EPG技术筛选抗蚜性玉米材料的指标。【结果】玉米蚜在玉米上的EPG波形主要有Np、C、Pd、E1、E2和F波,其中Np、F、E1和E2波与玉米品种（系）的抗蚜性有关。到达韧皮部前：玉米蚜在抗性材料浚单20上的第1次刺探持续时间明显长于感性材料齐319,可能在浚单20叶片表皮上存有阻碍玉米蚜取食的因子;此外,玉米蚜在抗性材料浚单20、郑单958和良玉88上取食时,其F波总时间及平均持续时间显著长于或长于其他玉米品种（系）,说明玉米蚜取食这3个玉米品种时,其口针遇到的机械阻力较大。到达韧皮部后：玉米蚜在抗性材料浚单20和郑单958这两个玉米品种上的第1次E1波出现时间晚,持续时间长,表明这两个品种在韧皮部层次上对玉米蚜的抗性水平较其他玉米品种（系）高;玉米蚜在感性材料齐319和旱21上的E2波总时间及持续吸食时间相对较高,显著大于良玉88,说明玉米蚜喜好取食感性材料齐319和旱21的韧皮部汁液。此外,以各取食波形平均持续时间为指标对各玉米品种（系）进行聚类分析,可把供试玉米品种（系）划分为3类,其抗性强弱为：第Ⅰ类（浚单20、郑单958和良玉88）〉第Ⅲ类（濮改340-1-1、旱21和87-1）〉第Ⅱ类（先玉335和齐319）�黄土高原半干旱区不同覆膜连作玉米产量的水分承载时限研究
摘要：【目的】以黄土高原半干旱区有限降水持续高效利用为目标,研究不同覆膜方式下连作玉米（Zea MayL.）的产量表现和水分利用特征,揭示其增产机理,明确不同覆膜方式下有利于土壤水分持续高效利用的连作年限,为试区高产、水分高效持续利用型玉米连作技术提供理论依据。【方法】以田间定位试验为基础,量化连作玉米农田土壤水分的年际平衡关系、产量稳定性;以持续高产和收获期不发生土壤干燥化为依据,确定适用于不同覆膜方式的玉米连作年限。【结果】3年试验结果表明,全膜双垄沟播具有良好的保墒、提高土壤水分有效性,利于协调关键生育时期土壤-作物的水分供需关系,提高产量和水分利用效率的作用。与半膜平作处理相比,全膜双垄沟播玉米的籽粒产量、水分利用效率分别提高了41.8%和33.4%,生物产量、单位耗水的干物质累积量、总产值、净产值、毫米水产值和产投比分别提高了21.8%、12.3%、31.2%、27.8%、21.1%和-3.2%;与露地栽培处理相比生物产量、单位耗水的干物质累积量、总产值、净产值、毫米水产值和产投比分别提高了24.9%、39.1%、225.5%、1 423.9%、212.4%和93.5%。地膜覆盖增大了玉米全生育时期的耗水量,全膜双垄沟播、全膜平作和半膜平作耗水量较露地栽培增幅分别为15.5%—29.2%、10.0%—20.8%和4.2%—12.6%。单季较高的耗水量导致3种覆盖处理在连作第二年收获期土壤贮水量较连作开始期分别降低了37.3%、33.5%和30.9%,第三年降低了29.6%、27.5%和23.9%,造成土壤水分亏缺;随着连作年限的延长,土壤水分亏缺累计,出现土壤干化现象,引起产量波动,不利于土壤水分的持续利用。【结论】黄土高原半干旱区,在同等降雨条件下,全膜双垄沟播具有明显的增产增效和提高水分利用效率的作用,是理想的玉米种植模式;当年降雨量在320 mm左右时,全膜双垄沟播�北方地区不同黄瓜品种氮素吸收与利用效率的差异
摘要：【目的】研究北方地区栽培黄瓜品种氮素吸收利用的差异,为氮高效黄瓜品种筛选提供参考依据。【方法】选用华北型黄瓜品种为材料,采用二因素裂区设计,以氮素营养水平为主区,设低氮素（3.5 mmol·L^-1）和高氮素（11.0 mmol·L^-1）两个水平;以品种为副区,设32个水平,进行水培试验。测定含氮量、氮素吸收与利用效率,并划分品种营养效率类型。【结果】供试黄瓜品种在两个氮素水平下氮素吸收效率和氮素利用效率的相关指标均存在显著差异。两氮素水平下的植株干物重（CVN3.521.49%和CVN1118.51%）、氮素吸收效率（CVN3.519.90%和CVN1119.94%）和氮素利用指数（CVN3.525.49%和CVN1119.25%）均有较大的品种差异。干物重与茎叶氮素累积量和氮素利用指数极显著相关（P〈0.01）,相关系数分别为rN3.50.933^＊＊和rN110.925^＊＊,rN3.50.964^＊＊和rN110.941^＊＊。氮素吸收效率与茎叶氮素累积量和氮素利用指数极显著正相关,相关系数分别为rN3.50.986^＊＊和rN110.963^＊＊,rN3.50.809^＊＊和rN110.768^＊＊;氮素利用效率与茎叶含氮量极显著负相关,相关系数分别为rN3.5-0.909^＊＊和rN11-0.886^＊＊。以两个氮素水平下的植株干物重平均值为标准,对黄瓜品种的氮素营养效率进行分类,干物重大于平均值的为高效型,小于平均值的为低效型,可将32个华北型黄瓜品种分成4种氮素营养类型,即双高效型、高氮高效型、低氮高效型和双低效型。其中低氮高效型品种数量最少,占供试品种的15.6%。通径分析显示,氮素吸收效率在两氮素水平下对氮效率（植株干物重）的贡献率远大于利用效率,二者对氮效率的通径系数分别为qN3.51.069和qN110.931,qN3.50.347和qN110.361。【结论】黄瓜苗期的氮效率存在品种差异。植株干物重可作为同一供氮水平下苗期氮效率评价的首选指标,茎叶氮素累积量、茎叶含氮量和氮素利用�根系边缘细胞对肉桂酸胁迫下黄瓜和黑籽南瓜活性氧代谢与根系活力的影响
摘要：【目的】了解肉桂酸（CA）胁迫下根系边缘细胞（RBC）对黄瓜和黑籽南瓜活性氧代谢与根系活力的影响,探索RBC增强根尖抵御CA胁迫的生理机制,阐明黑籽南瓜抵御CA胁迫能力强于黄瓜的原因。【方法】选用‘中农16’黄瓜和云南黑籽南瓜种子,采用悬空培养的方法,待根系长到5 mm时分成两组。组1：每隔1 h对黄瓜和黑籽南瓜的初生根分别喷施0和0.25 mmol·L^-1的CA水溶液（pH 6.0）;组2：种子的初生根先用小水流（蒸馏水）每4 h冲洗一次,去除RBC,再用0和0.25 m mol·L^-1的CA水溶液每1 h喷施根系1次。处理0、12、24和36 h时测量活性氧代谢指标;处理24 h时测量根系鲜重、根系呼吸速率和根系活力等指标。【结果】无CA胁迫时,有无RBC对根尖的鲜重和生理代谢没有显著影响。当根尖附着RBC时,CA胁迫导致黄瓜根系鲜重和根系活力下降,活性氧（ROS）水平和丙二醛（MDA）含量显著增加,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及过氧化物酶（POD）的活性明显上升,呼吸速率和抗CN呼吸速率也明显上升;与黄瓜明显不同的是,CA胁迫对黑籽南瓜根系鲜重、根系活力、ROS水平、MDA含量、SOD、CAT及POD的活性、呼吸速率和抗CN呼吸速率影响均不显著。RBC去除后,CA胁迫对黄瓜根系的生理代谢影响趋势和RBC去除之前相一致,胁迫程度更大;黑籽南瓜受到CA胁迫的影响与黄瓜基本一致,较RBC去除前差异显著。【结论】RBC通过降低根系中ROS水平及MDA含量,减轻了CA对黄瓜和黑籽南瓜根系的毒害;黑籽南瓜的RBC防御CA对自身根系毒害的能力明显强于黄瓜;若根尖没有RBC保护,CA对黄瓜和黑籽南瓜均造成明显的毒害。外源精胺对菜用大豆贮藏冷害及蔗糖代谢的影响
摘要：【目的】探讨精胺（Spermine,Spm）处理延缓菜用大豆贮藏冷害以及调节其蔗糖代谢的作用机理,为菜用大豆的采后贮藏保鲜技术提供参考。【方法】以‘新大粒1号’菜用大豆为试验材料,分别用0.5、1和2 mmol·L^-1外源Spm浸泡处理20 min,以清水浸泡为对照,于1℃、相对湿度为85%—90%的环境条件下贮藏10周,每周分别测定与菜用大豆抗冷性相关的生理指标,籽粒中蔗糖、果糖和葡萄糖含量,及与蔗糖代谢相关的酶活性指标。【结果】贮藏第2周即出现冷害,随着冷藏时间延长,菜用大豆冷害发生逐渐加重。与对照相比,Spm处理使冷害症状出现时间推迟到第3周,延缓了贮藏后期冷害指数的上升;也抑制了菜用大豆细胞膜透性的增加,贮藏5周后,0.5和1 mmol·L^-1Spm处理与对照的差异均达到显著水平（P〈0.05）;此外,冷藏期间的菜用大豆籽粒中膜脂过氧化产物-丙二醛（MDA）不断积累,低浓度Spm能缓解膜脂过氧化,减少MDA积累,而高浓度Spm可能产生毒害作用;与对照相比,1 mmol·L^-1Spm明显提高了菜用大豆冷藏期间抗氧化酶—过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性;与此同时,Spm处理也显著减少了菜用大豆籽粒蔗糖的损失（P〈0.05）,经过Spm处理的菜用大豆籽粒中果糖与葡萄糖含量低于对照,但整个贮藏期不同浓度处理间差异不显著（P〉0.05）。进一步通过冷藏菜用大豆籽粒可溶性糖含量与酸性转化酶（AI）、中性转化酶（NI）、蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）4种蔗糖代谢相关酶活性之间的相关性分析发现,蔗糖含量与AI活性呈极显著负相关（P〈0.01）,与SPS活性呈极显著正相关（P〈0.01）,而与NI和SS活性之间没有显著相关性,说明AI和SPS对菜用大豆冷藏期间蔗糖的降解起到了关键的调节作用,外源Spm通过对蔗糖代谢相关酶活性的调节有效抑制了冷�脱脂米糠复合酶解工艺条件优化及其营养特性评价
摘要：【目的】建立复合酶同步酶解脱脂米糠工艺,比较其在酶解前后营养特性的变化,为脱脂米糠高值转化利用提供技术指导。【方法】以脱脂米糠为原料,先经高温糊化和高温α-淀粉酶液化,再经糖化酶、纤维素酶和蛋白酶3种酶同步酶解,制备高营养价值脱脂米糠复合酶解提取物。以还原糖得率和蛋白提取率为评价指标,针对双评价指标对工艺参数的优化有差异性,运用模糊综合评判模型对工艺参数进行双评价指标综合评判,优化建立糖化酶、纤维素酶和蛋白酶3种酶复合酶解工艺。采用冷冻干燥法制备脱脂米糠热水浸提物冻干样、脱脂米糠复合酶解提取物冻干样。参考国标方法,测定脱脂米糠原料、脱脂米糠热水浸提物冻干样和脱脂米糠复合酶解提取物冻干样中固形物含量、碳水化合物物含量、可溶性膳食纤维含量和总蛋白含量,通过比较热水浸提和复合酶酶解后提取物中营养组成变化来评价复合酶解工艺优劣。利用高速氨基酸分析仪测定3种样品中氨基酸含量,并根据FAO/WHO必需氨基酸参考模式,对3种样品中的蛋白进行营养价值评价。【结果】采用模糊综合评判模型确定最佳脱脂米糠复合酶解工艺条件为：复合酶的总添加量3.5%,复合酶添加比例为糖化酶：酸性纤维素酶：酸性蛋白酶=1：3：3,酶解pH 4.1,酶解温度57.5℃,料水比1：5,酶解时间190 min。采用复合酶同步酶解脱脂米糠时,原料利用率、碳水化合物转化率、可溶性膳食纤维得率和蛋白提取率分别为48.34%、65.33%、6.68%和58.75%,复合酶解提取物蛋白中必需氨基酸占总氨基酸比例达到36.93%。与热水浸提相比,采用复合酶解工艺原料利用率、碳水化合物转化率、可溶性膳食纤维提得率和蛋白提取率分别提高了118.73%、90.74%、284.22%和257.14%,必需氨基酸含量提高了276.33%（P〈0.05）。与脱脂米糠原料相比,复合酶解腐胺和脯氨酸对哺乳期仔猪空肠绒毛-隐窝轴上皮细胞的多胺代谢及Wnt信号通路的影响
摘要：【目的】研究腐胺和脯氨酸对哺乳期仔猪空肠绒毛-隐窝轴上皮细胞的多胺（腐胺、亚精胺和精胺）代谢、Wnt信号通路关键基因的mRNA相对表达量的影响。【方法】选取18头0日龄的刚出生的三元杂交（长白×大白×杜洛克）仔猪,随机配对分成3组,每组6个重复,每个重复1头猪,对照组,腐胺组和脯氨酸组,分别灌喂等体积的生理盐水,5 mg·kg^-1体重添加剂量的腐胺和25 mg·kg^-1体重添加剂量的脯氨酸,到14日龄断奶,断奶后3 d屠宰,分离空肠绒毛-隐窝轴的3个不同分化程度（绒毛顶端,绒毛中段和隐窝）的细胞,分别为F1,F2,F3。高效液相色谱法测定F1,F2,F3中的多胺浓度,RT-PCR测定多胺代谢途径中的相关基因以及Wnt信号通路中关键基因的mRNA相对表达量。【结果】1、在绒毛顶端细胞F1中,与对照组相比,脯氨酸组的腐胺、亚精胺、精胺的浓度均显著增加（P〈0.05）,而腐胺组的多胺均无显著差异（P〉0.05）;在绒毛中段细胞F2中,除了腐胺的含量无显著差异外,脯氨酸组和腐胺组的亚精胺、精胺的浓度均显著高于对照组（P〈0.05）,且脯氨酸组的亚精胺和精胺的浓度均显著高于腐胺组（P〈0.05）;在隐窝底端细胞F3中,腐胺组和脯氨酸组的腐胺、亚精胺、精胺浓度与对照组的浓度差异均不显著（P〉0.05）。2、鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因在绒毛顶端上皮细胞F1中的mRNA表达量,腐胺组显著高于脯氨酸组和对照组（P〈0.05）;精氨酸酶（arginase）在F2中的mRNA表达量,脯氨酸组显著高于腐胺组和对照组（P〈0.05）;sFRP3在绒毛中段上皮细胞F2中的mRNA表达量,脯氨酸组的显著高于腐胺组（P〉0.05）;sFRP4在隐窝上皮细胞F3中的mRNA表达量,腐胺组显著高于对照组和脯氨酸组（P〈0.05）。【结论】添加了外源腐胺和脯氨酸,促进了哺乳期仔猪的空肠绒毛-隐窝轴上皮细胞的分化细胞的多胺浓度及促进了多胺的湖羊羔皮候选基因在不同花纹间的表达与毛囊发育特性关联的研究
摘要：【目的】研究5个候选基因在不同花纹组间的表达量与毛囊各指标的相关性,进一步了解候选基因与毛囊发育特性间的关联,筛选用于后期功能验证的基因。【方法】利用荧光定量PCR技术检测5个基因在不同组别间的表达量,结合组织学与显微观测技术,分析5个基因与毛囊发育间的关联。【结果】湖羊毛囊成群分布,湖羊大花、小花、中花多以3毛囊群居多,直径较大的为中心初级毛囊,直径相对较小的为侧部初级毛囊。湖羊大花与中花、小花初级毛囊直径呈极显著差异（P〈0.01）,小花与中花初级毛囊直径差异不显著（P〉0.05）。中花次级毛囊直径与大花、小花次级毛囊直径呈极显著差异（P〈0.01）,但小花次级毛囊直径与大花次级毛囊直径差异不显著（P〉0.05）。初级毛囊数大花、中花、小花间差异均不显著（P〉0.05）,但相同视野中大花初级毛囊数多于中花、小花。中花次级毛囊数与大花、小花次级毛囊数呈极显著差异（P〈0.01）,但大花、小花次级毛囊数差异不显著（P〉0.05）;MMP2基因在中花皮肤组织中的表达量与大花、小花分别呈极显著差异（P〈0.01）,在大花皮肤组织中的表达量与小花差异不显著（P〉0.05）;BMP7基因在大花皮肤组织中的表达量与小花呈显著差异（P〈0.05）,在中花皮肤组织中的表达量与大花、小花分别差异不显著（P〉0.05）;SFXN1基因在小花皮肤中的表达量与大花、中花分别呈显著差异（P〈0.05）,在大花皮肤组织中的表达量与中花差异不显著（P〉0.05）。其余基因在3组个体间差异不显著;MMP2基因相对表达量与大花次级毛囊数呈显著正相关（P〈0.05）。BMP7基因相对表达量与小花初级毛囊直径呈显著正相关（P〈0.05）,与小花次级毛囊数呈极显著正相关（P〈0.01）,与中花初级毛囊直径、次级毛囊数呈显著负相关（P〈0.05）;SFXN1基因相对HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响
摘要：【目的】构建鸡HOPX基因（homeodomain only protein X）全长编码区（coding region sequence,CDS）的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体（pCMV-HA vector）,获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定pCMV-HA-HOPX。采用胶原酶法分离培养12日龄AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞,瞬时转染pCMV-HA-HOPX,转染6 h时后消化细胞,按照每孔50 000个细胞数接种12孔培养板,并在细胞贴壁0、24、48和72 h,分别采用显微镜观察和CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响;同时,利用TRIzol法提取组织和细胞总RNA,并反转录合成cDNA,采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因Cyclin D1和PCNA的mRNA表达。【结果】测序结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp,与NCBI的鸡HOPX基因mRNA序列（NM_204556）一致;利用HA标签抗体的Western blotting分析显示,真核表达载体pCMV-HA-HOPX能够表达出预期大小的蛋白分子（约9.5kD）,表明鸡HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX构建成功。显微镜观察发现,转染pCMV-HA-HOPX载体的细胞（HOPX过表达组）在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染pCMV-HAvector空载体（空载体对照组）的细胞数量;CCK-8检测分析发现,转染pCMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值（OD值）在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组（P〈0.01）。与细胞增殖检测结果相一致,细胞增殖标志基因表达检测分析发现,在细胞贴壁后培养24 h后,HOPX过表达组细胞Cyclin D1基因的mRNA表达量显著低于空载体对照大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析
摘要：【目的】硫转运蛋白（sulfate transporter,SULTR）参与根系对外界环境中硫酸根（SO42-）的吸收与转运。大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特异表达,其功能是将外界的SO42-吸收转运到植物根系中。文章克隆大豆硫转运蛋白GmSULTR1;2b的启动子,研究该启动子的驱动活性和组织表达情况,从而了解GmSULTR1;2b的调控机制,为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析预测该基因上游2 259 bp为启动子,并利用在线数据库PLACE和Plant-CARE预测该启动子序列的调控元件。以大豆品种南农N2899的DNA为模板,进行普通PCR扩增,将克隆的启动子序列与GUS连接构建植物重组表达载体pSULTR1;2b∷GUS。利用冻融法将重组质粒转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导的遗传转化法转化大豆进行瞬时表达,以GUS为报告基因对启动子的活性进行分析。另外,将重组质粒转入发根农杆菌K599中进行大豆毛状根转化试验,借助于GUS报告基因,通过体视镜观察毛状根的横切面,分析启动子在根中的表达情况。最后以转化的阳性毛状根为材料,通过GUS酶活试验（GUS activity）分析启动子的活性。【结果】克隆大豆品种南农N2899的GmSULTR1;2b启动子与NCBI序列基本一致。通过在线预测分析启动子的调控元件发现该启动子具有真核生物启动子必须的核心元件TATA-box外,还含有激素应答元件ERE（乙烯响应元件）、ABRE（脱落酸响应元件）等,胁迫应答元件TC-rich repeats（干旱胁迫以及病虫害胁迫）、AT-rich element（AT-rich的DNA与蛋白结合位点）和MYB等。重组载体pSULTR1;2b∷GUS经PCR和测序鉴定,证实已构建成功。大豆瞬时表达后进行X-gluc染色显示,重组载体侵染的大豆显蓝色,说明GmSULTR1;2b启动子能够驱动下游GUS的表达。对转化的毛状根染色之后,体视镜下观察阳性根的横切面,发现GUS主要在根毛、根�不同耐冷性杂草稻和栽培稻抗氧化系统对冷水胁迫的响应
摘要：【目的】从孕穗期到抽穗开花是水稻对温度最为敏感的阶段,这一阶段的低温冷害严重制约了东北地区水稻生长和种植面积的进一步扩大,探明水稻耐冷生理机制,将为东北水稻生产提供重要保障。探索耐冷性不同的杂草稻和栽培稻在冷水胁迫下开花期剑叶的活性氧代谢、抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的变化规律,为耐冷性水稻品种的选育和栽培提供理论依据。【方法】以耐冷性强的杂草稻WR03-45、栽培稻丽江新团黑谷和冷敏感的杂草稻WR03-26、栽培稻秀子糯为试验材料,采用盆栽方法,根据剑叶叶枕距判断主穗进入孕穗期的时间,于孕穗期在冷水池中进行低温处理,未经冷水处理的参试材料作为对照。在开花期,剪取参试材料的剑叶保存于-85℃的超低温冰箱中,用于测定超氧阴离子自由基（）产生速率、过氧化氢（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）5种抗氧化酶活性和还原型抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）两种抗氧化剂含量,研究孕穗期低温冷害对剑叶的活性氧（ROS）积累、抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的影响。【结果】冷水胁迫下,冷敏感的杂草稻WR03-26开花期剑叶仅有CAT和GR活性显著增加,冷敏感的栽培稻秀子糯开花期剑叶SOD、CAT和GR活性显著增加;WR03-26和秀子糯剑叶的AsA和GSH含量及AsA/DHA值和GSH/GSSG值与对照无显著差异;WR03-26和秀子糯剑叶产生速率显著增加,H2O2含量极显著增加,膜脂过氧化产物MDA含量显著增加。耐冷性强的杂草稻WR03-45开花期剑叶SOD活性显著升高,POD、APX、CAT和GR极显著升高,耐冷性强的栽培稻丽江新团黑谷开花期剑叶SOD、POD和APX活性显著升高,CAT和GR活性极显著升高;WR03-45和丽江新团黑谷剑叶的抗氧化剂（AsA和
