植物应答低温胁迫的转录调控网络研究进展
摘要：低温胁迫严重影响植物的生长发育及作物的产量。为了生存,植物形成了复杂而高效的调控网络以抵御和适应低温胁迫,其中转录调控起关键作用。转录因子通过结合启动子区域的顺式作用元件,调控一系列基因的表达,在植物非生物逆境应答网络中起着关键作用。文章全面综述了参与调控植物低温胁迫应答的转录因子,包括AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive factor）、MYB（myeloblastosis）、bHLH（basic helix-loop-helix）、NAC（NAM、ATAF1、ATAF2和CUC2）、ZFP（zinc finger protein）、WRKY、VOZ（vascular plant one zinc-finger protein）、CAMTA（calmodulin-binding transcription activator）及EIN3（ethylene-insensitive 3）等,简要概述了各类转录因子的结构特征,重点介绍了其在植物抗寒中的功能及调控机制,并基于转录因子间的调控关系,绘制出植物低温应答的转录调控网络。在该调控网络中,CBF（C-repeat binding factor）转录因子起着关键分子开关的作用。CBFs特异地与启动子区域的DRE/CRT（dehydration-responsive element/C-repeat element,A/GCCGAC）顺式作用元件结合,从而激活COR（cold regulated）、LTI（low-temperature induced）、DHN（dehydrin）及RD（responsive to dehydration）等一系列低温应答基因的表达。CBFs的表达受ICE1/2（inducer of CBF expression 1/2）、CAA1（circadian clock-associated 1）、LHY（late elongated hypocotyl）、MYB56、ZFP1/182及CAMTA1/2/3等转录因子的正调控,而受MYB15、MYBS3、ZAT12、PIF4/7、WRKY34及EIN3等转录因子的负调控。ICE1蛋白的转录活性受翻译后修饰的严谨调控,包括SIZ1（SAP and Miz 1）介导的SUMO（small ubiquitin-related modifier）化修饰和HOS1（high expression of osmotically responsive gene 1）介导的泛素化修饰。HOS1-SIZ1系统精细严谨地调控着ICE1-CBFs及其靶基因的表达,以适应外界温度的变化。同时,ICE1的表达还受JAZ1/4的负调控和ERF2的正调控。除CBF依赖�大豆（Glycine max）GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能
摘要：【目的】鉴定大豆抗逆相关转录因子GmDREB5的互作蛋白,分析其互作蛋白GmUBC13的特性及其生物学功能,解析GmDREB5提高植物抗逆性的分子机制。【方法】通过酵母双杂交系统,以大豆GmDREB5的AP2功能域为诱饵对干旱处理的大豆cDNA文库进行筛选,获得GmDREB5候选互作蛋白后通过酵母互作及体外Pull-down试验确定GmDREB5与候选蛋白之间的互作关系;同时,分析互作蛋白GmUBC13的进化关系、蛋白结构及亚细胞定位等特性;通过半定量RT-PCR分析其互作蛋白GmUBC13在干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理下的表达谱;通过转化烟草鉴定GmUBC13的生物学功能。【结果】通过筛选大豆干旱处理的cDNA文库获得一个GmDREB5互作蛋白GmUBC13（ubiquitin conjugating enzyme 13）,GmUBC13属于泛素结合酶蛋白家族,GmUBC13含有UBCc保守域（ubiquitin-conjugating enzyme catalytic domain）、与泛素连接酶E3互作的氨基酸残基以及高度保守的半胱氨酸催化位点。进化树分析表明,GmUBC13的氨基酸序列与拟南芥（Arabidopsis thaliana）含有16个成员的E2家族的第XV亚组的AtUBC13A、AtUBC13B以及水稻（Oryza sativa）的泛素结合酶蛋白Os01g0673600分别具有99%、97%和97%的同源性。酵母互作试验及体外Pull-down分析证明GmUBC13与GmDREB5蛋白之间存在相互作用。表达特性分析表明,GmUBC13受干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理的诱导表达。GmUBC13在ABA的胁迫条件下,1 h开始有表达,10 h时表达量上升到最大,24 h稍微降低;在干旱和盐胁迫条件下,1 h开始表达,并随着胁迫时间的增长,表达量逐渐上升,24 h表达量达到最大;在低温胁迫条件下,GmUBC13受诱导较快,5 h表达达到最大,在10 h和24 h时未表达。蛋白亚细胞定位结果显示,GmDREB5蛋白定位在细胞核和细胞膜上,GmUBC13定位在细胞核中。基因功能鉴定结果证明,过表达GmUBC13的转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和受�冬小麦种植面积空间抽样样本布局的优化设计
摘要：【目的】样本布局是空间抽样调查方案设计中的关键要素。优化设计样本布局对于提高抽样样本对总体的代表性、降低抽样调查成本、改善抽样外推总体精度具有重要意义。论文针对现有农作物种植面积空间抽样调查技术体系中存在样本布局设计合理性不足的问题（如采用简单随机抽样进行样本布局设计时,无法保证各样本单元间相互独立、彼此间不存在空间相关性;而以往系统等距布样方式又存在样本间隔的制定缺乏科学依据）,进一步提高现行农作物种植面积空间抽样调查效率。【方法】选取安徽省蒙城县和冬小麦种植面积为研究区和研究对象,以正方形网格作为抽样基础单元,基于蒙城县2009年和2010年的冬小麦空间分布数据（分别源自ALOS AVNIR-2和Landsat5 TM影像提取结果）,通过地统计学理论与“3S”技术（遥感、地理信息系统和全球定位技术）及传统抽样方法相结合,首先,设计8种抽样单元尺寸水平,利用不同种尺寸水平的抽样单元离散抽样区、构建抽样框;其次,选取简单随机抽样方法初选样本单元,利用初选样本构建抽样单元内冬小麦种植面积比例的变异函数理论模型,基于该模型分析抽样单元间空间关联性和异质性,定量确定抽样单元空间关联阈值;然后,遵循传统抽样理论要求样本间相互独立原则,以抽样单元空间关联阈值为抽样间隔,采用空间系统等距的布局方式对冬小麦种植面积空间抽样样本布局进行了优化设计;最后,以简单随机抽样方法为对照,选取抽样外推总体相对误差、总体总值估计量的变异系数（CV）及样本容量为评价指标,对布局优化设计后的抽样样本外推总体精度、稳定性（通过变异系数反映）及抽样成本（通过样本容量反映）进行定量评价试验研究。【结果】抽样单元内冬小麦种植面积比例的变异性随单元尺度的增大而�干旱胁迫对油菜蕾薹期生理特性及农艺性状的影响
摘要：【目的】针对长江流域特别是长江上游近几年春季降水偏少易导致干旱的特点，研究水分胁迫对油菜蕾薹期生理特性及农艺性状的影响，为揭示油菜蕾薹期抗旱机制及抗早品种选育提供理论依据。【方法】采用盆栽的方式，在遮雨网室对两种抗旱性不同的油菜品种中双10号（抗旱性弱）和94005（抗旱性强）蕾薹期进行干旱胁迫，以各性状的抗旱系数研究油菜相关生理指标及农艺性状的变化，在此基础上筛选出适用于该区域油菜蕾薹期抗旱性鉴定的指标。【结果】随着干旱时间的延长，两种油菜的叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、RWC、叶绿素含量、RuBP羧化酶活性、株高、茎粗、一次分枝数以及单株产量抗旱系数均呈下降趋势，下降幅度与胁迫时间成正相关。其中，气孔导度、蒸腾速率抗旱系数下降幅度与材料抗旱性成正相关，其余指标则与材料抗旱性成负相关。抗旱性弱的材料气孔限制值、水分利用率抗旱系数分别呈现出上升-下降与一直下降的趋势，抗旱性强的材料则均为上升趋势。POD、SOD、CAT活性、可溶性糖以及可溶性蛋白相对值随着干旱胁迫时间的延长先升高后下降，抗旱性强的材料增加幅度高于抗旱性弱的材料；细胞膜透性、丙二醛（MDA）含量和脯氨酸相对值随干旱胁迫时间的延长呈上升趋势。对干旱胁迫下的油菜蕾薹期和复水后的成熟期相关指标之间的关系进行分析表明，干旱胁迫下，产量与净光合速率、RWC、叶绿素含量和一次分枝数抗旱系数呈极显著正相关，与细胞膜透性、MDA含量抗旱系数呈显著负相关。主成分分析将单株产量、净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔限制值、水分利用率、Rwc、叶绿素、RuBP羧化酶、SOD、POD、CAT、细胞膜透性、MDA、可溶性糖、株高、茎粗及一次分枝数划分�环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响
摘要：【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein,Crp）基因在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp）,通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S.spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S.spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S.spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S.spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S.spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S.spinosa-1�球孢白僵菌对烟粉虱后代生命表参数的亚致死影响
摘要：【目的】关于昆虫病原真菌对昆虫生命表亚致死影响的研究较少,而由真菌侵染所产生的亚致死影响对于寄主昆虫的种群动力学至关重要,并最终影响着目标昆虫的害虫地位。论文旨在比较烟粉虱（Bemisia tabaci）亲代3龄若虫经球孢白僵菌（Beauveria bassiana）处理及对照子代种群的生命表参数,探讨球孢白僵菌对烟粉虱生命表参数的亚致死影响。【方法】应用年龄-阶段两性生命表分析经球孢白僵菌处理的烟粉虱后代的发育历期、存活率和繁殖率数据,以蒸馏水处理的个体作为对照。应用bootstrap方法计算种群生长参数的平均数和标准误;采用t-test比较分析球孢白僵菌处理组和对照组烟粉虱的种群参数、发育历期和繁殖力间的差异。【结果】球孢白僵菌处理的烟粉虱与对照之间在成虫前期、总产卵前期、1—4龄若虫存活率和生命表参数上存在着显著差异。与对照处理的烟粉虱成虫前期（20.59 d）相比,亲代接种球孢白僵菌使后代个体的成虫前期显著延长（26.58 d）。经球孢白僵菌处理的烟粉虱后代存活率（0.195）要比对照个体（0.76）低。球孢白僵菌处理烟粉虱后代种群的内禀增长率（r）、周限增长率（λ）、净增殖率（R0）、平均世代时间（T）和总繁殖率（GRR）分别为0.063 d-1、1.065d-1、6.85,30.613 d和41.883,而对照烟粉虱后代种群的上述参数分别为0.137 d-1、1.147 d-1、33.443、25.575d和51.44。【结论】亲代经球孢白僵菌处理的烟粉虱其子代种群增长要比对照组慢,死亡率高,但生殖能力并无显著性影响。该研究可为了解昆虫病原真菌对烟粉虱的长期影响提供理论依据。中国化肥投入区域差异及环境风险分析
摘要：为了全面认识中国各省区农业化肥使用的区域差异及对生态环境的潜在威胁,准确把握其环境风险程度,加强风险管理,促进农业可持续发展,对中国化肥投入的分布特征和环境风险进行分析。【方法】考虑氮磷钾3种化肥不同的环境污染效应,建立带有权重系数的化肥使用环境风险指数计算模型,评价中国化肥投入的环境风险。应用定性定量相结合的层次分析法,确定氮磷钾三因子的权重系数。根据原国家环境保护总局2007年设定的生态县建设化肥使用强度小于250 kg.hm-2的标准,按照目前发达国家氮磷钾比例1﹕0.5﹕0.5的施肥实践,确定氮磷钾三元素的环境安全阈值。【结果】目前中国农田化肥使用量平均达到480 kg.hm-2,大多数省区农田化肥投入过量。其基本趋势是东南投入高,西北投入少。2012年化肥使用强度最大、超过690 kg.hm-2的前5个省份是福建、广东、河南、湖北、江苏;化肥使用强度低于200 kg.hm-2的7个省区是西藏、青海、甘肃、黑龙江、贵州、内蒙古、山西。总化肥使用强度最大的福建（908.7 kg.hm-2）是西藏自治区（137.99 kg.hm-2）的6.6倍。氮肥使用强度的区域差异与氮磷钾总肥一致,其中氮肥使用强度最大的广东省（448.5 kg.hm-2）是西藏自治区（62.59kg.hm-2）的7.2倍;氮磷钾施肥不平衡的现象普遍存在,磷肥使用强度最大的河南省（259.8 kg.hm-2）是最小的贵州省（44.04 kg.hm-2）的6倍;钾肥使用强度最大的福建省（264.73 kg.hm-2）是最低的青海省（30.83 kg.hm-2）的8.6倍,钾肥的使用在青海、西藏、甘肃、贵州等省区明显不足。中国农业化肥使用环境污染的潜在风险较大,仅有西藏、青海、贵州、甘肃和黑龙江5个省区属于尚安全状态,河南、福建、广东和湖北属于重度风险状态,其他省区属于轻度风险和中度风险状态。近10年来,中国的化肥消费量以每年3%的速率增加不同种植模式对南方丘陵旱地土壤水分利用与作物周年生产力的影响
摘要：【目的】分析不同坡地类型条件下不同种植模式土壤水分利用与作物周年生产力的差异,探索适宜南方丘陵旱地最佳效果的种植模式。【方法】在上坡地设春玉米-饲草（SPD1）、红薯-饲草（SPD2）、红薯//春玉米-饲草（SPD3）3种模式;中坡地设春玉米-马铃薯（ZPD1）、大豆-马铃薯（ZPD2）、大豆//春玉米-马铃薯（ZPD3）3种模式;下坡地设春玉米-秋玉米-马铃薯（XPD1）、西瓜-秋玉米-马铃薯（XPD2）、西瓜//春玉米-秋玉米-马铃薯（XPD3）3种模式。连续3年测定各种植模式的土壤含水量,计算作物耗水量（WC）、水分利用效率（WUE）、作物周年生产力及间作模式的土地当量比（LER）。【结果】上坡地上,2008、2009和2010年SPD3较SPD1的土壤含水量分别增加22.8%、21.6%和24.1%,WUE分别提高9.7%、17.8%和15.6%,作物周年生产力分别增加8.3%、16.1%和14.8%,较SPD2的土壤含水量分别增加16.1%、11.0%和14.5%,WUE分别提高61.9%、60.6%和62.5%,作物周年生产力分别增加62.4%、61.6%和64.8%;中坡地上,3年中ZPD3较ZPD1的土壤含水量分别增加12.9%、13.3%和20.9%,WUE分别提高17.9%、22.5%和20.3%,作物周年生产力分别增加17.2%、21.4%和19.6%;下坡地上,3年中XPD3较XPD1的土壤含水量分别增加15.1%、17.6%和12.9%,WUE分别提高47.5%、44.6%和38.5%,作物周年生产力分别增加41.5%、43.3%和37.6%,上述差异均达显著水平（P〈0.05）。3种间作模式中,LER以XPD3模式最高,3年中较ZPD3分别增加15.70%、12.45%和13.94%,较SPD3分别增加10.32%、6.31%和5.65%,达显著差异（P〈0.05）。3种坡地类型之间,3年中的土壤含水量,XPD1分别较ZPD1增加5.5%、27.3%和17.3%,较SPD1分别增加77.3%、56.9%和50.9%,ZPD1较SPD1分别增加68.0%、23.3%和28.7%;XPD3的WUE较ZPD3分别提高105.4%、101.2%和102.3%,较SPD3分别提高238.2%、230.2%和246.2%;3年周年经济产量,XPD3较ZPD3分别增加195.9%、104.1%和101.2%,较SPD3分别增加230.6%、224食用植物性农产品质量安全研究进展
摘要：目前,威胁食用植物性农产品质量安全的主要污染物为农药残留、生物毒素和重金属等。从这些污染物检测技术看,在样品前处理技术、确证检测技术和快速检测技术3个方面均取得了显著进展。样品前处理技术建立并改进了固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取、基质固相分散萃取和微波辅助萃取技术等,其中免疫亲和吸附技术和QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,and Safe）技术得到了快速发展和越来越广泛的应用;确证检测技术特别是色谱-质谱联用技术,因其具有灵敏、准确、可靠等优点,特别适合用作实验室仲裁检测,得到了快速发展和应用,并已列入农产品中农药残留、生物毒素等污染物测定方法标准中;农产品污染物快速检测技术方面,中国逐步实现从技术源头创新到终端产品创制的全程创新,研制出多种类、满足不同层次需求的产品,原理上既有酶抑制法,又有免疫分析法和无损检测法,形式上既有各种试剂盒、免疫亲和柱,又有各类免疫层析试纸条,为现场筛查、定性或定量测定提供了可供选择的技术方法,与大型仪器方法形成互补。从农产品污染物风险评估研究进展看,中国农产品质量安全风险评估体系建设成效显著,建成了以国家农产品质量安全风险评估机构为龙头、专业性和区域性风险评估实验室为主体、各主产区实验站为基础、生产基地观测点为延伸的具有中国特色的农产品质量安全风险评估体系,并根据6大类危害因子,提出了4大类风险评估类型,明确了各类风险评估的性质特征和评估程序,初步建立了包括农药残留、生物毒素、重金属、外源添加物等在内的农产品质量安全风险评估技术框架体系,研究开发出各类危害因子识别技术、风险评估专用软件等技术产品。从农产品污染控制研究看,农药残留、生物毒素和重金属等污染途径、�水稻镉代谢与控制研究进展
摘要：水稻具有吸附镉的特性,使得镉成为稻米产品的主要污染物,影响粮食供给安全和食品安全。本文从水稻吸收积累镉的3个环节,即根系对镉的活化和吸收、木质部的装载和运输、经节间韧皮部富集到水稻籽粒中,综合评述了镉在水稻生长过程中的代谢规律,运转蛋白和关键基因的控制机制,环境和投入品对水稻吸收镉的影响,以及水稻镉控制的研究进展。并结合中国实际情况,从农业可持续生产、控制稻米安全角度,辨证地探讨水稻镉控制的研究方向。苹果农药残留风险评估
摘要：【目的】开展苹果农药残留风险评估研究,为苹果消费、农药残留监管和农药最大残留限量（MRLs）制修订提供科学依据。【方法】对采自主产区的200个苹果样品进行农药残留检测,分别用%ADI和%ARfD进行农药残留慢性膳食摄入风险评估和急性膳食摄入风险评估,用ADI值、大份餐和体重计算最大残留限量估计值（eMRL）,借鉴英国兽药残留委员会兽药残留风险排序矩阵进行农药和样品风险排序。【结果】⑴检测的102种农药中26种农药检出残留,检测的200个样品中189个样品检出农药残留,仅有1个样品农药残留超标（超标农药为氧乐果）;⑵检出残留的26种农药,其慢性膳食摄入风险（用%ADI表示）在0.00%—1.07%,平均值为0.13%;其急性膳食摄入风险（用%ARfD表示）在0.18%—22.41%,平均值为4.12%;⑶根据残留风险得分,检出残留的26种农药可划分为3类,即高风险农药（8种）、中风险农药（10种）、低风险农药（8种）;⑷以风险指数排序,风险高的样品仅占1.5%,风险中、低和极低的样品占98.5%;⑸在检出残留的26种农药中,灭幼脲可不制定MRL,氟硅唑等6种农药的MRLs过严,乐果等5种农药的MRLs过松,建议矮壮素、苯醚甲环唑、虫酰肼、二嗪磷、氟硅唑、甲基硫菌灵、乐果、联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、炔螨特、噻嗪酮、三氯杀螨醇、杀扑磷、戊唑醇、烯唑醇、亚胺硫磷和抑霉唑的MRLs分别设定为4、1、2、0.5、0.6、7、0.2、1、2、2、1、0.8、0.2、0.1、3、0.5、1和3 mg.kg-1。【结论】苹果农药残留检出率相对较高,但99.5%的苹果样品其农药残留量均低于MRLs。苹果农药残留慢性膳食摄入风险和急性膳食摄入风险均很低。苹果应重点关注氧乐果、磷胺、杀扑磷、毒死蜱、二嗪磷、联苯菊酯、亚胺硫磷和乐果残留。建议修订或制定苹果中矮壮素等18种农药的MRLs。农产品中黄曲霉毒素的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究
摘要：【目的】黄曲霉毒素严重污染农产品,威胁人畜生命健康,是政府重视、社会关注的一大焦点问题,因此亟需研究建立黄曲霉毒素高灵敏高快速检测方法。目前已研制出高特异性高灵敏度黄曲霉毒素单克隆抗体,本研究旨在应用该抗体,建立黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析快速检测技术,为农产品质量监管、风险评估提供技术支持。【方法】本研究通过将黄曲霉毒素抗体与乳胶铕进行偶联标记,利用自主研制的黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条进行黄曲霉毒素检测,通过检测线T信号值与质控线C信号值的比值和标准溶液浓度的自然对数值实现定量。针对花生、稻米、植物油等不同农产品,研究建立样品粉碎均质提取一体化技术。对铕标记时间分辨荧光免疫层析检测技术进行方法学考核,以花生、稻米、植物油等为例,进行实际样品检测,并与HPLC法进行结果比对。【结果】在花生、稻米、植物油等农产品实际样品检测中,本研究建立的时间分辨荧光免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B1得到检测限均为0.3μg·kg-1,线性范围分别为0.8—25、0.8—15和0.8—30μg·kg-1。上述3种农产品对应的标准曲线的线性方程分别为y=0.238x＋0.654（R2=0.992）、y=0.321x＋0.811（R2=0.990）和y=0.146x＋0.173（R 2=0.993）,标准偏差分别为0.024、0.039和0.021。该方法的批内准确度和精密度添加回收试验结果表明,添加回收率在81.0%—113.0%,变异系数在7.2%—14.2%;批间准确度和精密度试验结果显示,添加回收率在75.8%—114.9%,变异系数在7.7%—15.3%。说明该检测技术批内、批间均具有良好的准确度和精密度。该方法与HPLC法检测结果相比,相对误差小于10%,说明黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析技术与行业标准方法检测结果具有良好的一致性。【结论】时间分辨荧光免疫层析检测技术灵敏度高、线性范围�利用PCR-RFLP方法鉴别黄曲霉毒素产毒菌株
摘要：【目的】开发一种精准度高、灵敏性好、简便快捷的鉴别黄曲霉毒素产毒菌株的方法,为粮食储藏中黄曲霉毒素污染提供早期预警,为食品工业的质量安全控制提供技术保障,为黄曲霉毒素污染的生物防治提供无毒微生物来源。【方法】利用生物信息学方法分别以黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasitieus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）的黄曲霉毒素合成基因簇中的关键调控基因aflR及其启动子序列为研究对象,采用PCR-RFLP方法对黄曲霉毒素可能产生菌株进行鉴别分析研究;为进一步验证PCR-RFLP方法对产毒菌株区分结果,利用大豆培养基对上述菌株进行发酵培养,并利用HPLC方法测定了菌株产毒能力。【结果】生物信息学分析结果表明黄曲霉毒素可能产生菌株的aflR高度同源,但启动子和结构基因的部分碱基出现了规律性变异,并导致了限制性酶切图谱中的NheⅠ、PvuⅡ和HincⅡ等限制性酶切位点的改变;通过提取各菌株基因组DNA,PCR扩增得到aflR和启动子序列片段,测序得知片段长度分别为798 bp和515bp;PCR-RFLP鉴定结果表明产生黄曲霉毒素菌株的aflR启动子片段经NheⅠ酶切后得到176 bp和339 bp 2个片段,不产毒菌株无该限制性酶切位点;试验进一步对黄曲霉菌和寄生曲霉菌aflR结构基因的分析发现,利用HincⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR的结构基因,可以分别得到3个片段（387、250和161 bp）和2个片段（548、250 bp）;利用PvuⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR结构基因,可以分别得到2个片段（652、146 bp）和3个片段（413、239和146 bp）;产毒试验表明,米曲霉菌和酱油曲霉菌不产生黄曲霉毒素,PCR-RFLP分析表明不产毒的黄曲霉菌的确丧失了产生黄曲霉毒素的能力;产生黄曲霉毒素各曲霉菌株之间产毒能力差异显著,不但产生的黄曲霉毒素总�阿维菌素在黄瓜和土壤中的残留及其消解动态
摘要：【目的】研究阿维菌素通过土壤穴施施药方式在黄瓜和土壤中的残留消解动态,制定阿维菌素缓释粒剂防止黄瓜根结线虫的安全间隔期。【方法】阿维菌素消解动态试验采用推荐高剂量的1.5倍（5.62 g·m-2）为施药剂量,在黄瓜移栽时通过土壤穴施方式施药1次。分别测定施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d和45 d的阿维菌素残留量的变化。阿维菌素的最终残留试验设置高低两个不同施药剂量：低剂量按推荐剂量3.75 g·m-2,高剂量按推荐剂量的1.5倍（5.62 g·m-2）,分别于黄瓜移栽时土壤穴施1次,于黄瓜成熟期采样测定阿维菌素的最终残留量。样品中阿维菌素残留量的测定采用分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）法,在10 g粉碎均质的黄瓜、植株或土壤样品加入4 g无水硫酸钠和1 g氯化钠,用10 mL乙腈提取2 min后,离心并移取上清液2 mL,通过50 mg N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）和50 mg十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）进行分散固相萃取（DSPE）净化,离心上清液过0.22μm滤膜后上机测定。【结果】本文所建立的阿维菌素残留量的分散固相萃取-液相色谱-串联质谱测定法简单快速,阿维菌素在10、50和100μg·kg-1 3个添加水平下回收率为78%—101%,相对标准偏差1.9%—9.4%;方法定量限为10.0μg·kg-1,该方法能够满足现有限量标准的要求。北京和哈尔滨两个试验点消解动态试验中,采用土壤穴施施药方式,阿维菌素在黄瓜中未检出,这表明阿维菌素是非内吸性农药;而在土壤中检出了阿维菌素,其降解动态符合一级动力学指数模型,在土壤中的半衰期为7.9—18.7 d。在黄瓜最终残留试验中,成熟期的所有黄瓜样品中均未检出阿维菌素。在土壤最终残留试验中,2012年北京试验点的3个样品检出阿维菌素,检出浓度分别为10、30和170μg·kg-1;哈尔滨试验点的2个土壤样品检出阿维菌素,�猪β_2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建
摘要：【目的】利用重组β2肾上腺素能受体（β2AR）检测β2激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β2 AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β2AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β2AR核苷酸序列（AF000134）,设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力,对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造;为使表达蛋白C端携带6×His标签,对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体,连接产物转入NovaBlue感受态细胞,经Amp抗性筛选,挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析,所提猪肝细胞总RNA的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示,在1 200 bp左右出现1条特异性条带,与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β2AR经鉴定,证实为阳性重组质粒。测序结果显示,所得猪β2AR基因cDNA序列全长1 257 bp,编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank,登录号为KF023571.1。Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46.73 kD。与已发表的猪β2AR（AF000134）相比,基因序列一致性为99.68%,4处发生碱基突变,编码的氨基酸序列一致性为99.28%,3处发生突变,�利用高密度SNP对猪血糖和糖基化血清蛋白性状的全基因组关联分析
摘要：【目的】测定苏太猪和白色杜洛克×二花脸F2资源家系240 d血糖（glucose,GLU）和糖基化血清蛋白（glycosylated serum proteins,GSP）浓度,采用全基因组关联分析定位影响GLU和GSP的染色体位点,为最终鉴别影响该性状的因果基因奠定基础,同时为人类低血糖症和糖尿病的遗传学研究提供参考。【方法】分别将435头苏太猪和760头白色杜洛克×二花脸F2资源家系F2个体在相同条件下饲养至240日龄进行统一屠宰,收集血液后分离血清,利用全自动生化分析仪测定GLU和GSP浓度。采集猪只耳组织提取DNA并测定DNA浓度。将质检合格的DNA样品利用Illumina porcine 60K SNP芯片判定基因型。运用PLINK软件对SNP判型结果进行质控,将合格的SNP标记用于后续的关联性分析,利用广义混合线性模型及R语言GenABEL软件包进行全基因组关联分析,定位影响苏太猪和白色杜洛克×二花脸F2资源家系240 d血清GLU和GSP含量的染色体位点。根据全基因组关联分析结果从Ensembl或NCBI网站上分析可能的位置候选基因。【结果】全基因组关联分析共检测到5个与血清GLU和GSP达染色体显著水平相关的SNP位点。其中白色杜洛克×二花脸F2资源群体在10号染色体（SSC10）24.67Mb处定位到与血清GSP含量显著相关的SNP（ALGA0057739,P=1.58×10-5）,解释表型变异为3.72%。苏太猪群体共检测到2个与血清GSP显著相关的SNP（ALGA0108699和DRGA0017552,P=1.45×10-5）,解释表型变异均为3.72%。使用猪参考基因组序列（10.2版本）,无法定位到具体的染色体位置。通过人、猪比较基因组分析,这两个SNP都位于SSC8,距STPG2基因3’端约180.0—193.0 kb。将两个群体进行Meta分析,未发现新的与GSP显著相关的SNP;在1号染色体250.32Mb处（DRGA0002016,P=2.48×10-5）和14号染色体43.97Mb处（ASGA0062984,P=1.29×10-5）,定位到与血清GLU显著相关的SNP。通过搜寻显著相关SNP所在染色体区域内的注�不同水平玉米赤霉烯酮对断奶仔猪血清代谢产物和肝肾组织病理学影响
摘要：【目的】玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是由谷物及其产品滋生禾谷镰刀菌产生的一种具有雌激素活性的真菌毒素。试验研究不同水平玉米赤霉烯酮污染日粮对断奶仔猪血清代谢产物、肝肾组织病理学和肝脏超微结构的影响。【方法】将20头健康三元（斯格×长×大）杂交断奶母猪（10.36±1.21）kg按照体重随机分为4个处理,仔猪采用试验笼单独饲养。对照组饲喂基础日粮,试验1、2和3组分别在基础日粮的基础上添加ZEA 1.1、2.0和3.2 mg.kg-1。预饲期7 d,正式期18 d。试验结束后,对仔猪禁食12 h后进行前腔静脉空腹采血,分离血清,待测血清代谢产物含量。采血后,仔猪电击致死放血屠宰,切取肝脏和肾脏组织块迅速固定于10%的福尔马林溶液,待做组织切片检测。切取0.5 mm3大小的肝脏组织块,迅速用2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液固定,待做电镜切片进行超微结构观察。【结果】与对照组相比,3.2 mg.kg-1ZEA处理组仔猪血清胆红素显著高于对照仔猪（P〈0.05）,而血清球蛋白和甘油三酯则显著低于对照组（P〈0.05）。随日粮ZEA水平的增加,血清球蛋白和甘油三酯呈一次线性降低（P〈0.05）。与对照组相比,1.1、2.0和3.2 mg.kg-1ZEA处理组肝细胞肿胀,颗粒变性。与对照组相比,2.0和3.2 mg.kg-1ZEA处理组肾小管上皮细胞颗粒变性,管腔变窄,有些管腔内充满大量透明底状物或蛋白尿。2.0和3.2 mg.kg-1ZEA处理组肝细胞膜上可见自噬体和嗜中性白细胞。【结论】2.0 mg.kg-1的ZEA足以诱导仔猪的肝肾毒性,此结果对人类健康和指导动物生产具有重要的借鉴意义。GnIH对母猪生殖调控的研究
摘要：【目的】研究促性腺激素抑制激素（GnIH）mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH（10-6、10-8、10-10和10-12 mol·L-1）对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素（雌二醇,孕酮）的合成、细胞增殖相关蛋白（cyclin B1,PCNA）表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10-6和10-10 mol·L-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌（P〈0.01）,但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达（P〈0.01）。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。
