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中国病毒学 2006年第05期杂志 文档列表

中国病毒学杂志研究报告

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用413-416

摘要：采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白，目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30％左右。通过包涵体洗涤和离子交换层析，蛋白纯度高于95％。用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条，检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性。本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础。

慢性病毒性肝炎小鼠动物模型的建立及其特征分析417-420

摘要：慢性病毒型肝炎是一种严重危害人类健康的常见病，多发病，目前尚缺乏理想的实验动物模型来阐明其具体的发病机制，从而使得对其防治的研究受到限制。本研究采用纯化的3型鼠肝炎病毒（MHV-3）经腹腔注入近交系C3H／HeJ小鼠体内，小鼠感染MHV-3后，约63％存活，存活的小鼠一般情况较正常对照组差，肝脏组织呈现持续炎性改变，血清ALT、AST升高而TP、ALB有所下降，与人类慢性病毒性肝炎的发生发展极为相似，可作为研究慢性病毒性肝炎的比较理想动物模型。

丙型肝炎病毒5’非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响421-425

摘要：在前期工作已证实HCV基因组5’UTRDNA序列具有启动子活性的基础上，分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3—5’UTR，转染HepG2细胞以及用全长的5’UTR cDNA构建质粒分别转染HepG2、He1a、HEK293、L02细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平，并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时，荧光素酶相对活性为5．91±0．65，为SV40启动子的18．7％：失去结构域I以后，荧光素酶相对活性为9．52±0．32；失去结构域Ⅰ和Ⅱ以后，荧光素酶相对活性为2．64±0．25；失去结构域Ⅲ和Ⅳ以后，荧光素酶相对活性为0．32±0．09：失去结构域Ⅳ以后，荧光素酶相对活性为2．72±0．45，逆转录聚合酶链反应结果与之相符；全长5’UTRcDNA在L02、hepG2、HEK293、He1a细胞中荧光素酶相对活性分别为0．75，0．49，0．23，0．14。结果提示结构域Ⅲ是HCV5’UTR DNA序列具备启动子活性的核心结构，结构域Ⅰ对其5’UTR DNA序列的启动子活性具有抑制效应，而结构域Ⅱ和Ⅳ可增强5’UTR DNA序列的启动子活性；HCV5’UTR cDNA的启动子功能无组织特异性，但在正常的肝细胞（L02）中表达最高。

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究426-429

摘要：本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽（Antimicrobial lipopeptide，AMI）的体外抗伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨。结果表明该抗微生物脂肽对猪肾（Porcine Kidney，PK-15）细胞的半数中毒浓度（Median Toxicosis Dose，TD50）和最大无毒浓度（TD0）分别为47．57mg／L、18．9mg／L．对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应（Cytopathic Effects，CPE）有明显的抑制作用，可使细胞存活率显著升高；但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK—152胞上的感染和复制。由此可知，该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株，从而抑制其对PK．15细胞的感染作用，其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦（Acyclovir，ACV），但由于其对PK-152胞毒性较弱，可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究。

浙江省首例人禽流感病例的病原学与分子生物学研究430-436

摘要：为确认浙江省首例疑似人禽流感病例，进行病原学分析，对患者气管吸出物进行核酸RT-PCR、荧光定量RT-PCR检测以及病毒分离，并对患者血清进行HI抗体测定。结果表明：患者气管吸出物H5N1亚型和A型流感病毒特异核酸均呈阳性，分离到禽流感病毒A／Zhejiang／16／06（H5N1）株；双份血清中禽流感病毒（H5N1）HI抗体滴度分别为1：320和1：640，从病原学和血清学上证实为人禽流感病例。分离毒株测序结果显示，A／Zhejiang／16／06（H5N1）株在HA裂解位点为多个碱性氨基酸，符合高致病性禽流感病毒特征；该毒株的HA、NA、PB2、NP、M和NS基因序列均为禽源，与2005年我国福建、安徽等地禽流感病毒分离株高度同源，而与越南、泰国以及香港1997年分离到的禽流感病毒株之间存在明显差异。

分子内二硫键对HERV囊膜蛋白融合核心结构的影响437-442

摘要：合胞素（Syncytin）是一类由人俘获的逆转录病毒囊膜蛋白，与胎盘的形态发生中细胞滋养层到合胞滋养层的分化过程十分相关。Syncytin与人免疫缺陷病毒I型（HIV-1）囊膜蛋白（Env）在结构上具有相似的特点，二者可能具有相似的膜融合机制。本文通过PCR对融合核心部位七肽重复区HRI和HR2之间linker中自然存在的一对保守的分子内二硫键进行定点突变，表达纯化该突变蛋白，并进行了相应的结构及稳定性探讨，通过与未突变蛋白的性质比较确证该分子内二硫键在蛋白结构的正确形成及稳定性上起着一定的作用。

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒基因组的克隆与全序列分析443-448

摘要：本研究参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列，设计合成8对引物，从内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺肿瘤组织中提取总DNA为模板，对JSRV-NM株基因组分8段进行PCR扩增，产物分别为8个（531bp，888bp。949bp，944bp，1428bp，947bp，1836bp，538bp）基因片段，将其分别克隆入pMD-18T载体中进行双向测序并拼接序列，获得完整的JSRV-NM株前病毒基因组全序列。结果表明，JSRV-NM株前病毒基因组全长7430bp，有相互重叠的4个较长的开放阅读框（ORF），分别代表gag、pro、pol和env基因。与绵羊肺腺瘤病毒Ⅰ型即南非代表株（NC-001494）和绵羊肺腺瘤病毒Ⅱ型即美国代表株（AF105220）的核苷酸同源性比较分别为90．4％和90％，推导出的氨基酸同源性分别为90％和89．1％。分析JSRV-NM株基因组结构，发现在LTR的上游和下游都具有外源性exJSRV特有的ScaI酶切位点，在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氮酸一组氨酸序列”，可形成锌指结构。在env基因编码的TM区有特异性的“YXXM”基序。用地高辛标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段制成探针，原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病（OPA）的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA，结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达，说明JSRV-NM株是具有致瘤作用的外源性反转录病毒。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列。

应用改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平449-453

摘要：将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析。结果表明：对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达10个基因拷贝，可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好，所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6．9×10^4拷贝/μL；与实时SYBR Green Ⅰ染料RT-PCR技术比较，改良的实时TagMan荧光定量RT--PCR技术检测灵敏度高6．7倍。以上结果证实，改良的实时TaqMan荧光定量RT—PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性。

口蹄疫病毒P1＋2A基因在BHK-21细胞中的表达454-457

摘要：本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1＋2A基因的重组表达质粒pQE—Tri／PI＋2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21，转染后一定时间进行检测。通过SDS—PAGE、Western—blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明，FMDVPI＋2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达，表达的蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别而且具有良好的生物学活性。这一结果的取得，为进一步研制新型口蹄疫基因工疫苗及其配套诊断试剂奠定了基础。

犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究458-462

摘要：对国内分离的犬冠状病毒（CCoV）DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白（M）基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp，编码263个氨基酸，其中前17个氨基酸为信号肽。DXMV、V1和V2流行株与Insavc—1疫苗株M基因相比，核苷酸的同源性分别为92．6％、90．9％和91．6％，推导的氨基酸序列的同源性分别为92．5％、92．0％和92.3％，在M基因前1／3区域内存在变异，其中74—76、120—124和131—135三个区域变异较大。国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1—175个流行株M基因核苷酸同源性为96．6％，推导的氨基酸序列同源性为96．4％，显示出很高的保守性。基于M基因的遗传进化分析表明，目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因Ⅱ型，只有Fox3—1和Rac2—1两个毒株属于基因Ⅰ型。另外，将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中，在BL21（DE，）中实现了M蛋白的表达，表达量约占菌体蛋白的10．2％。

伪狂犬病病毒ul24基因表达蛋白的胞内定位研究463-467

摘要：根据GenBank已发表的PrVul24基因序列（NC006151），设计并合成一对引物，PCR扩增出ul24基因编码区，克隆于pEGFP—N1载体，得到重组质粒pUL24-GFP。酶切鉴定，测序及Western Blot验证重组质粒。ul24基因序列测定结果已提交GenBank，登录号DQ226544。Western blot分析结果表明UL24-GFP融合蛋白为45KD。将pUL24-GFP转染真核细胞，激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞内定位，结果表明UL24-GFP融合蛋白定位于细胞核。

Notice of Inviting Contributions for English Version of Virologica Sinica467-467

鸡传染性支气管炎病毒变异株（793／B）核蛋白基因的克隆与序列分析468-471

摘要：根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒（IBV）N全基因组序列设计引物，对IBV793／B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明，IBV793／B的Ⅳ基因由1229bp组成，与GenBank已发表的11株IBV的Ⅳ基因相比较，IBV793／B的N基因共有88处点突变，在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86．9％～91.4％，氨基酸同源性为75．8％～77．5％。表明IBV93／B的N基因存在着较大的变异性。

TaqMan—MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒472-476

摘要：建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法，用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针，筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件，用以提高方法的特异性、敏感性与准确性；并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明：引物与探针的优化浓度分别640nmol／L和480nmol／L，体系具有良好的保守性和特异性，与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝，反应，标准曲线线性范围为10^7～10^2拷贝，反应，从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右，操作简便，重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速，适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备477-480

摘要：利用PCR技术，以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因（VP1），以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后，克隆至表达载体pET-30a（＋）中，从而构建了原核表达质粒pET30-VP1。将pET30-VP1转化至感受态细胞E．coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，SDS．PAGE分析，可见约45kDa的目的蛋白获得表达。该蛋白经亲和层析纯化后，免疫6-8w的雌性Balb／c鼠，三次免疫后，采血分离血清，制得抗VP1的多克隆血清。以纯化的VP1为包被抗原，用ELISA方法检测，制备的血清效价达12800×以上。以Western blot检测，该血清可与目的蛋白发生特异性反应，证明其具有良好的免疫原性。VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验481-484

摘要：本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB，质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性。为测定该DNA疫苗的免疫效果，将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫，然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以pcDNA-gB／rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好，其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗，而细胞免疫水平则比后者高得多。上述研究结果为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用485-489

摘要：以伪狂犬病毒（PRV）保守的gE基因序列为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针，结合RotorGene检测系统，建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1．0×10^-21．0×10^7拷贝／μL，灵敏度达10^2拷贝／μLDNA，比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR，同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品，阳性42份，阳性检出率为63．6％（42／66）。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。

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《中国病毒学（英文版）》征订启事489-489