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中国病毒学 2006年第03期杂志 文档列表

中国病毒学杂志研究报告

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定207-212

摘要：为了明确抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性，并鉴定其识别表位，首先在E．coli中表达了人类冠状病毒229E（HCoV-229E）和OC43（HCoV-OC4）N蛋白，用Western blotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS—CoV N蛋白单克隆抗体（1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5）与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况，而后应用12种重组截短型SARS-CoVN蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位。结果显示：（1）在4株抗N蛋白单克隆抗体中，1-1C2、1-1D6和2—2E5不与HCoV—OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应，为SARS-CoV N蛋白特异性抗体；（2）2—8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS—CoVN蛋白的aa30-60，1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoV N蛋白的aa170-184。这一研究为阐明SARS-CoV N蛋白的免疫学特征，建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料。

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定213-216

摘要：本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus，HRSV）核壳体蛋白（Nucleocapsid protein，N）和磷蛋白（phosphoprotein，P）的基因序列，各设计一对特异性的引物，应用RT-PCR技术，从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和P的基因片断，克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）。获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞，72h后再用Western blot鉴定蛋白的表达。结果显示真核表达载体pcDNA3．1（＋），N和pcDNA3.1（＋），P的限制性内切酶分析结果与预期一致，基因序列分析显示没有发生无义突变，利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带。于是我们认为成功构建了含有HRSVN和P编码基因的真核表达载体，在真核细胞内能顺利表达。为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础。

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《中国病毒学》英文版稿约216-216

中国病毒学杂志研究报告

丙型肝炎病毒ns2基因的克隆及其表达217-220

摘要：以p90-HCV为模板，通过PCR分别得到全长和截短（2881-3078bp）ns2基因。将截短ns2基因克隆到pET32a原核表达载体，并在大肠杆菌中获得了Trx-His-NS2C融合蛋白的可溶性高表达。通过His树脂纯化得到融合蛋白，免疫家兔获得高效价高特异性的抗体。同时构建了含有全长ns2基因的重组腺病毒，利用该重组病毒感染HepG2和293细胞成功的表达23．2kDa的NS2蛋白。本文的研究为进一步开展NS2蛋白的结构与功能研究奠定了良好的基础。

抗HSV-I ICP22蛋白抗原多肽抗体对ICP22定位的检测分析221-225

摘要：ICP22作为单纯疱疹病毒进入细胞后最早表达的蛋白之一，对于病毒的复制具有重要的调节功能，由于抗原表位的同源性，使用完整的ICP22蛋白作为抗原难以获得特异性的抗体。通过氨基酸序列预测，ICP22蛋白1～36位氨基酸具有较强的抗原性，将ICP22蛋白1-36位氨基酸偶联于GTS蛋白作为抗原免疫小鼠，所制备抗体能够特异性识别具有正常生理构象的ICP22蛋白。抗体检测结果显示，ICP22不但定位于细胞核内，而且还能够形成特殊的点状结构。

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖226-230

摘要：本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）增殖的干扰作用。筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段，在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究。成功观测到由载体表达的小干扰RNA（siRNA）在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象。通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测，以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术，得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据。证实在真核细胞水平上，RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖。实验结果表明，依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路。

炭疽杆菌保护性抗原（PA）重组腺病毒的构建及免疫效果分析231-234

摘要：探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性。从载体pcDNA3．1-PA上PCR扩增P断，将该片断克隆入质粒pAdTrack—CMV，得到阳性克隆pAdTrack—PA。PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy—l的BJ5183感受态细胞，经同源重组后得到重组腺病毒vAd—PA。vAd—PA经Pad线性化后，脂质体介导转染293细胞，经Western—blot检测表明PA在293细胞中得到表达。重组病毒肌肉注射免疫BALB／c小鼠，用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体，抗体滴度计算几何均数为1：2800。该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础。

汉坦病毒东方田鼠分离株ZT10的M基因序列的特性分析235-237

摘要：分析东方田鼠分离汉坦病毒ZT10株M基因分子特征。提取汉坦病毒ZT10株感染细胞的总RNA，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增ZT10株M片段全基因，克隆于T载体并测序，对其进行序列分析。结果显示汉坦病毒ZT10株的基因组M片段长度为3651个核苷酸，编码1133个氨基酸。序列分析表明其为Seoul型汉坦病毒。与八株Seoul型汉坦病毒的M片段同源性为84．0％～96．3％，而与HTN型汉坦病毒的同源性则较低，与从田鼠分离的汉坦病毒（Prospect Hill virus,Tula virus,Khabarovsk virus,Isla vista virus）核苷酸同源性仅为57．5％～60．9％，且与浙江省Seoul型分离株Guo3同源性较低，表明浙江省可能存在着另一Seoul亚型的汉坦病毒。

用狂犬病毒核蛋白基因小干扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究238-243

摘要：采用RNase Ⅲ消化长片段双链RNA的方法，制备了狂犬病毒N基因、P基因和G基因小干扰RNA库（siRNA Cocktail）。将siRNA转染BSR和MNA细胞单层后，采用直接免疫荧光法观察发现，N基因siRNA Cocktail能够对RV的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用，并且通过RT-PCR在转录水平探测到mRNA产量的降低；而P基因或G基因siRNA Cocktail对RV的复制和感染不产生或仅产生弱的抑制作用。这一结果为RNA干扰在RV研究中靶基因的选择及进一步的应用提供了依据。

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《病毒与人类疾病》243-243

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马传染性贫血病毒非编码区LTR嵌合克隆的生物学特性244-248

摘要：将已构建的马传染性贫血病毒LTR强弱毒嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12体内接种健康试验马，在150d观察期内，各组试验动物体症均未见异常。血液学分析发现，vLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与亲本弱毒疫苗株的白细胞与血红蛋白含量总体上没有明显的规律性的变化。在动物外周血中均检测到一定的病毒RNA拷贝数，但拷贝数较低。二者在诱导EIAV特异性淋巴细胞增殖功能和特异性细胞毒性杀伤反应中，亦具有相似的变化趋势和效应。本项研究为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础。

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达249-252

摘要：利用DNA重组技术将猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE—puro—E2，该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术（FACS）分析，结果表明CSFVE2基因在PK-15细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb／c小鼠，成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。

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《分子病毒学原理》252-252

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PI法和Annexin V／PI法检测蓝舌病毒HbC3诱导人肝癌细胞的凋亡253-256

摘要：利用流式细胞仪比较PI法和Annexin V／PI法检测不同时间人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC3的凋亡率分析。结果：PI法在24h、36h、48h的凋亡率分别为10．8±3．05、21．7±6．28、28．3±10．6；Annexin V/PI法的凋亡率分别为20．42±3．70、49．3±8．11、79．6±11．5。二种方法及不同时间感染病毒细胞的凋亡率之间有显著差异（P〈0．01）。证明了Annexin V／PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞，BTV-HbC3诱导Hep-3B细胞凋亡是致肿瘤细胞病变、死亡的重要表现形式之一。

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建257-260

摘要：用聚合酶链式反应（PCR）方法从真核表达载体pcDNA3．1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段，经琼脂糖凝胶电泳大小为2．4kb；将该基因片段插入马立克氏病病毒（MDV）CVI988／／Rispens的非必需区US10片段中，经SphI酶切分析获得大小为6．0和2．4kb两个片段，表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒。将质粒与CVI988／Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过免疫荧光方法筛选，结果获得了表达VP2基因的重组MDV（rMDV-VP2）。用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验（IFA）证实，rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白，这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析261-266

摘要：根据GenBank上所公布的新城疫病毒（NDV）的全基因组序列，设计了8对引物，运用RT-PCR方法获取了3株广西地方强毒株GX7／02、GX9／03和GX11／03的全基因组序列，并对其进行了比较分析。此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成，与GenBank公布的ZJ1、U．S／Largo／71、Italy／2736／00等7个毒株的全基因组序列长度相同，比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸，此6个核苷酸位于np基因的非编码区内，相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647～1648nt位。通过序列的比较分析，发现GX7／02、GX9／03和GX11／03与ZJ1毒株的同源性较高，而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低。

桃拉综合征病毒中国株ZHZC3全基因测序及分子结构预测267-272

摘要：设计8对引物分片段扩增桃拉综合征病毒中国分离株ZHZC3全基因组，病毒两末端序列采用末端快速扩增方法（RACE）获取。扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序，用DNAstar软件拼接全序列及同源性比较。结果显示ZHZC3全序列除去3’poly（A）尾，由10202个碱基组成，有两个开放阅读框，分别编码2107和1011个氨基酸的聚蛋白。与美国参考株H194相比，在编码区没有核苷酸的缺失和插入，但在5’UTR缺失3个A，两者整体核酸同源性达97．9％。ORF1中ZHZC3与HI94及巴西株（BLZ01）的核酸同源性分别为97．6％、97．7％，在ORF-2中ZHZC3与H194、BLZ01的核酸同源性则分别为98．3、97％。与国外株ORF-2的部分序列比较发现：ZHZC3和中国台湾株均与美国株H194同源性最高。克隆分析6株TSV中国大陆株主要结构蛋白CP2基因，发现其编码的氨基酸存在三个高变区，中国大陆株更有其独特的氨基酸变异模式，312（S），449（A），451（Q）和468（H）。表明该病毒的整体变异性不高，但中国的流行株已形成其自己的遗传演变特征。在此基础上，利用生物学软件对CP2蛋白功能域和三维结构进行了预测，为进一步分析CP2蛋白结构与功能关系奠定了基础。ZHZC3株是第一个测定全序列的TSV中国株。

荧光增白剂Tinopal LPW对蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效作用研究273-276

摘要：用1％TinopalLPW荧光增白剂作为蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效剂对蜀柏毒蛾2龄幼虫进行室内毒力测定，结果表明1％Tinonal LPW对Parocneria orienta NPV有较强的增效作用。使用3．6×10^11 PIB／hm^2＋1％TinopalLPW、1．8×10^11 PIB／hm^2＋1％TinopalLPW、9．0×10^10 PIB／hm^2＋1％TinopalLPW和3．6×10^11PIB／hm^2、1．8×10^11 PIB／hm^2、9．0×10^10PIB／hm^2 6种处理对林间越冬代2-3龄幼虫进行超低容量喷雾防治，结果表明除9．0×10^10PIB／hm^2＋1％TinopalLPW表现出显著的增效作用外，其余剂量有增效作用但不显著。