生物细胞分析篇（1）

红细胞又称红血球或红血细胞，是血液中最多的一种血细胞。红细胞分为两类，一是哺乳动物的红细胞；另一类是非哺乳动物（鸟类、两栖类、鱼类）的红细胞。下面着重介绍与这两个方面相关的知识内容。

1.哺乳动物的红细胞

1.1 基因突变的实例。正常人的红细胞呈双凹圆饼状，中央较薄，周缘较厚，而镰刀型细胞贫血症患者的红细胞却是弯曲的镰刀状，这种细胞形状上的改变用光学显微镜是可以观察到。究其原因，镰刀型细胞贫血症属于基因突变的结果。而基因突变是染色体的某一位点上基因的改变，这种改变在光学显微镜下是无法直接观察到的。所以讲到基因突变就经常提及镰刀型细胞贫血症。

1.2 制备细胞膜。哺乳动物成熟的红细胞，它没有细胞核和众多的具膜细胞器，即除细胞膜外无其他的膜结构，因此可以获得较纯净的细胞膜，加之取材方便。故在 “体验制备细胞膜的方法” 实验中，被认为是最理想的材料。

1.3 研究动物细胞的吸水和失水。正常状态下红细胞内的渗透压与血浆渗透压大致相等，这对保持红细胞的形态甚为重要。加之动物细胞没有细胞壁，将红细胞置于等渗溶液（NaCl/0.9%）中，它能保持正常的大小和形态；将红细胞放在低渗溶液中，水分将进入细胞，红细胞容易吸水膨胀变成球形，可至膨胀而破裂；相反，将红细胞放在高浓度溶液中，水分将逸出细胞外，红细胞将因失水而皱缩。这些变化在光学显微镜都很容易观察到。所以，它又是研究“动物细胞的吸水和失水”的好材料。

1.4 真核细胞并非都有细胞核。真核细胞与原核细胞的区别就是前者有真正的细胞核，但并不是所有的真核细胞都有细胞核。如哺乳动物成熟的红细胞就无核，这样一来，就成了除哺乳动物成熟的红细胞等少数细胞以外，真核细胞都有细胞核。

1.5 细胞只有保持完整性才能完成各项生命活动。哺乳动物成熟的红细胞无核，所以一般不能存活多久，即寿命都很短。红细胞与健康红细胞平均寿命为120天，每天都有一定数量的红细胞进行更新。原因是细胞的各个部分不是彼此孤立的，而是互相紧密联系、协调一致的，细胞只有保持完整性，才能够正常地完成各项生命活动。这也有力地说明细胞完整性的重要意义。

1.6 体细胞并非都存在等位基因。哺乳动物成熟的红细胞无核，故不含DNA（DNA主要存在细胞核中），进而也不存在染色体，当然也就不存在等位基因。

1.7 故衰老的红细胞没有核体积变化。衰老的细胞，细胞核的体积增大，核膜内折，染色质收缩、染色加深。哺乳动物成熟的红细胞无核，故衰老的红细胞没有核体积变化这个特征。

1.8 人体的细胞并非都进行有氧呼吸的。哺乳动物成熟的红细胞中没有线粒体，也就是说没有有氧呼吸的场所，所以只能进行无氧呼吸。这也说明人体的细胞并不都是进行有氧呼吸的。

1.9 红细胞跨膜运输的方式。哺乳动物成熟红细胞内无线粒体，通过无氧呼吸释放能量，因能量的利用效率较低，所以葡萄糖进入红细胞为协助扩散；而其他细胞有线粒体能进行有氧呼吸，能量的利用效率较高，故葡萄糖进入其他细胞则为主动运输。

1.10 提取血红蛋白。血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以为，约90%是血红蛋白。故用哺乳动物成熟的红细胞提取血红蛋白。

1.11 血红蛋白和血浆蛋白。红细胞的主要功能是运输O2和CO2，此外还在酸碱平衡中起一定的缓冲作用。这两项功能都是通过红细胞中的血红蛋白来实现的。如果红细胞破裂，血红蛋白释放出来，溶解于血浆中，即丧失上述功能。血红蛋白是红细胞内部的成分，不在细胞外液（相对人体外部环境来说，又称为内环境），即血红蛋白不属于人体内环境组成成分；血浆是血细胞直接生活的环境，血浆中的蛋白质称血浆蛋白，它属于人体内环境组成成分。

2.非哺乳动物的红细胞

2.1 无丝分裂。无丝分裂是最早发现的一种细胞的分裂方式，早在1841年就在鸡胚的的血细胞中看到了。因为在分裂开过程中核膜、核仁不消失，无染色体和纺锤丝的变化，所以叫无丝分裂，它是真核细胞的一种分裂方式，如蛙的红细胞分裂方式就是这样。

生物细胞分析篇（2）

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）06（a）-085-02

目前，临床上诊断肝癌的主要方法为病理、影像和血清AFP检查。这些检测手段中，病理法属于有创性检查，对患者造成组织损伤，不能作为常规检查方法；B超、CT、磁共振成像对小肝癌灶检出率较低；血清AFP检查诊断肝癌灵敏度低，因此，建立一种无损、准确、灵敏的肝癌诊断方法具有重要的临床价值。代谢组学是一种通过考察生物体系受刺激或扰动后代谢产物随时间的变化，并以此来研究生物体系代谢途径的新技术[1-2]。代谢组学作为新兴的学科，已成功应用于疾病诊断、药物作用模型的鉴别和确证、药物作用机制研究等领域[3-6]。目前代谢组学分析中常用的两种检测手段是核磁共振（NMR）技术和质谱（MS）及其联用技术。相比于NMR灵敏度低、检测动态范围窄等弱点，现代MS技术的优势是具有很高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定，现已成为生物分析中的首选方法。本研究采用LC-MS法检测肝癌患者和健康人血清中代谢物，比较分析两组血清代谢物组的差异，同时利用PCA对MS数据进行模式识别，以期建立肝癌的诊断模型。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent LC/MSD Trap XCT Plus 型质谱仪、高压二元梯度泵、二极管检测器、自动进样器、柱温箱、Chemstations化学工作站等（美国Agilent公司），日立20PR-52D型高速冷冻离心机，电热真空干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司），KQ- 250 DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），Milli-Q纯化水制备系统(Millipore公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国fisher公司）。

1.2 样品的采集

分别采集30份男性肝癌患者以及30份健康男性 （无相关病史的健康人群)受试者静脉血5 ml 至促凝管中，室温下静置1 h后在4℃、13 000 g离心10 min），置-80℃贮存备用。采血前禁食12 h。肝癌诊断标准按照2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准[8]，上清液LC-MSn分析。

1.3 LC-MS 条件

反向液相色谱（RP-LC），色谱柱：Prevail C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相A：10mM甲酸铵缓冲液（甲酸调PH 4.0）；B：0.1%甲酸乙腈，A与B梯度洗脱：0～5 min，B%10～30，5～9 min，B% 30～60，9～20 min，B%60～70，20～25 min，B%70～100；柱温：25°C；流速：0.8 ml/min；质谱条件：ESI离子源，离子源温度350℃，毛细管电压3.5 kV，雾化压力285.8 kPa，雾化压力60.0 Psi，干燥气流速11.0 L/min，质谱扫描范围75～800 m/z，正离子检出模式。

2 结果

2.1 血清样品检测总离子流图

按照以上实验方法，对血清样本进行了分析测定，图1中A、B分别是健康人和肝癌患者血清典型的LC-MS总离子流谱，图中可见，正常人血清样本的总离子流图与肝癌患者血清样本的总离子流图有明显区别。

A为健康人血清；B为肝癌患者血清

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2.2 肝癌的生物标记物

通过LC-MS检测，与正常人相比，肝癌患者血清中牛磺酸和组氨酸含量减少，而苯丙氨酸、酪氨酸含量增加。牛磺酸是重要的抗氧化物质，曾有研究报道，其在肝硬化患者血清中含量增加，而肝癌患者血清中牛磺酸含量没有改变[7]，但笔者研究发现牛磺酸在肝癌患者血清中含量减少，推测牛磺酸的含量与肝癌病情程度有关，需要进一步研究。

2.3 模式识别分析

利用PCA对正常人和肝癌患者两组血清LC-MS数据进行模式识别分析，得到相应血清标本的PCA得分图（3D PCA Scores plot)。得分图中每一个点代表了一个标本，见图2。从图2中可以直观地看出各血清标本在空间上的位置以及相互聚合程度，图2中肝癌和健康人标本显著分离，说明两者血清代谢物组确实存在显著差异。

3 讨论

为了探讨利用代谢组学技术结合模式识别分析诊断肝癌的可行性，对肝癌患者血清LC-MS数据进行PCA分析。结果表明肝癌患者可与健康人标本100%区分开来，利用基于LC-MS代谢组学技术结合PCA的模式识别方法诊断肝癌诊断结果可靠。有利于临床早期诊断、早期治疗肝癌。此外，由于代谢组学反应的是基因和蛋白表达终端的变化、是对基因组学和蛋白组学在代谢物研究上的放大，因此利用此技术诊断疾病更灵敏、快速。

[参考文献]

[1]罗和古，丁杰，岳广欣，等.大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究[J].中西医结合学报，2007，5(3):307-313.

[2]Jeffrey R，Idle1，Frank J，Gonzalez．Metabolomics[J].Cell Metabolism，2007， 12(6):348-350.

[3]Clayton，T.A，Lindon，J.C，Cloarec，O，et al.Pharmacometabonomic phenotyping and personalized drug treatment[J].Nature，2006，440(7087):1073-1077.

[4]黄成钢.中药研究的必然趋势—中药复方系统研究[J].中国药学杂志，2000，35(7):4331.

生物细胞分析篇（3）

1.1教学分析

教学分析包括教学内容分析和学习者分析。细胞生物学理论知识多，比较枯燥抽象，学生学习起来觉得难理解和掌握。因此在此基础上我们对知识点进行梳理和分析，根据每个知识点制作短小视频，每个视频时间为10分钟左右，视频里除了针对各个知识点讲解的录像外，还制作了动画，如细胞培养、细胞融合、细胞转染等动画，用动画演示了整个实验过程，深受学生的欢迎。

1.2创建自主学习环境，支持学生课下学习

翻转课堂中学生获取新知识的主要渠道是课下的自主学习过程，因此有必要创建自主学习的环境，帮助学生顺利完成课下的“知识获取”。（1）教师设计制作教学视频，学生只要有智能手机接入互联网，就可以根据自己的需要，实时扫描二维码观看相关教学视频，从而随时随地利用碎片时间来学习，实现指尖上的移动学习。（2）支持学生的协作学习，学生可以利用网络交流平台与教师、同伴随时展开讨论。

1.3课前学习效果评价设计

教师以教学目标为依据设计一些题目，供学生在学习视频后完成，并运用有效的技术手段对学生的学习活动过程及结果进行测量，给予评价，以检测其对知识的掌握程度。

1.4课中实施

在翻转课堂的教学模式中，由于课前经过深度预习，学生对要学习的知识有了一定的理解和掌握，因此在课堂上教师可以实行项目引领、任务驱动措施，让每一位学生都参与到项目中，在项目进展中遇到问题时，组内协作解决或咨询教师。如在微管组装中，让学生选择微管组装所需的材料和条件，教师巡视，对有问题的小组和学生及时给予指导。这种教学模式优化了课堂结构，在学生主动建构知识的过程中将课堂上的互动引向更深层次，让学生动起来、让课堂活起来，实现了知识的应用创新。

1.5学习成果交流展示

在BB平台上，教师将课堂中观察到的问题进行梳理，将在课堂中动态性生成的资源和学生的作品收集整理后与学生分享，这些内容能被长期保存，在学生遇到问题时可随时查阅。另外，因病或参加其他活动缺席的学生可以利用这些资源来补课，学习困难的学生也可通过教师提供的资源进行补救性学习。同时，设立学习成果交流展示区，学生将自己的探究结果以及在探究过程中的心得与同班同学进行交流，实现思想的碰撞。

2研究意义

通过翻转课堂可以实现知识传授和知识内化过程的颠倒安排，使学生成为学习过程的主体，促进学生自学能力的提高，使学生自己掌控学习的进度和速度，并寻求教师的个性化指导。翻转课堂所倡导的“以信息技术带动教学结构变革和学生个性化全面发展”与新课程改革的核心理念“一切为了每一位学生发展”的要义相契合。翻转课堂的教学实践已在国内外多个地区取得极大的成功，促进了教育信息化的发展。在深化教育教学改革和全面推进教育国际化的过程中，以培养大学生终身学习能力为目标，积极探索培养高素质创新型人才的途径和方法已成为当前高等教育改革与发展的主题。首都医科大学启动了第四轮教育教学改革，其主题是“以学生学习成长为核心，以提升教育教学质量水平为目标，以内涵发展为基础，推进我校人才培养综合改革”。翻转课堂作为一种新兴的教学模式，颠覆了传统的教学过程，它将知识传递过程放在课堂外，学生借助于教师制作的教学视频和开放的网络资源自主完成知识的建构，而课堂则成为他们完成作业、探讨问题或得到个性化指导的地方。因此，在翻转课堂中，学生成为整个教与学过程中的主体，所有的知识都需要学生在自主学习和动手的过程中掌握。通过翻转课堂教学模式下细胞生物学的教学设计与应用，围绕教学改革精神，创造学生自主学习的良好氛围，提高学生的学习积极性，促进了学生自主学习能力的提升。

3需要注意的问题

通过翻转课堂的实践发现，在实施过程中要注意以下一些问题。

（1）翻转课堂的教学视频是学生学习的重要资源，教学视频的制作需要教师从视频的内容、视频的设计形式、视频的长短、视频的吸引力等方面思考，这要求教师认真研究教学内容，更要求教师具有现代信息技术知识和信息技术素养。

生物细胞分析篇（4）

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潜能,是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示羊水[1]和脐血[2]可以分离出MSCs，那么这两种来源的MSCs有哪些异同呢?为此本研究将对孕中期人的羊水及新生儿的脐血进行间充质干细胞的分离与培养，并对其基本生物学特性进行了比较研究，为组织工程选取种子细胞提供基础性实验依据，现报告如下论文。

1材料与方法

1.1标本来源

羊水标本取自2008年3月至2010年3月吉林医药学院附属465医院妇产科，妊娠在15～22周的引产羊水35份;32份脐带血标本取自正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性的孕妇。取标本前均征得孕妇本人同意，研究获得吉林医药学院附属465医院道德伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器

PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，马血清(GIBCOBRL)，1.077×103g/LFicoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，细胞化学染色试剂盒(BASO公司)，CO2培养箱(FormaScientific公司)，荧光倒置显微镜(TE300,Nikon公司)。

1.3孕中期羊水MSCs的分离与培养羊水标本在室温下1500r/min离心5min，弃上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培养液，制成密度为(1～5)×105个/mL的单细胞悬液，接种到φ60mm塑料培养皿中，置饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养。第3天首次换液，去除非贴壁细胞，当类成纤维样细胞铺满平皿达80%时，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培养液制成浓度为4×104个/mL的细胞悬液，接种到新培养皿中，记为第1代(P1)。每3d用含10%FBS的PRMI1640培养液换液1次，细胞生长达到90%融合时按1∶4的比例传代。

1.4新生儿脐带血MSCs的分离与培养无菌条件下取正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血50～80mL，放于含CPDA1复合抗凝剂的采血袋中，所有样本均在采集后12h内进行分离;将脐血用等量的DHank′s液稀释制成细胞悬液,细胞悬液沿管壁缓慢加入到相对密度为1.077×103g/LFicoll人淋巴细胞分离液上层,其比例为2∶1,注意液面清晰分层，以1500r/min进行梯度离心20min，然后缓慢吸取中间交界面细胞悬液至另一离心管，获得含人MSCs的单个核细胞悬液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培养基,吹打并计数。以5×105个/mL的密度接种到φ60mm培养皿中，48h首次换液,以后每3d换液。换液用含10%FBS的PRMI1640完全培养基。在细胞80%左右融合时,用0.25%胰酶室温消化5min，适量小牛血清终止消化反应，吸管轻轻吹打，转入离心管中1500r/min离心10min，弃上清，按1∶3比例传代。

1.5MSCs的生长曲线测定将传至3、5、8代的MSCs制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL，接种于24孔培养板，每孔0.5mL;每天取3孔，消化后进行细胞计数，共8d。以时间(d)为横坐标,细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

1.6MSCs的代谢情况检测传3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接种于φ35mm的培养皿中。2d后分别对培养皿中的细胞进行POX、SB、PAS、αNAE和ALP细胞化学染色，显微镜观察、拍照。同样，新生儿脐血源性MSCs取第3代以后细胞进行细胞化学染色分析。

2结果

2.1羊水MSCs

从羊水中分离出的细胞,将之接种于PRMI1640培养基中,2～3d部分细胞开始贴壁,4～7d逐渐出现贴壁的MSCs,开始为圆形,逐渐伸出突起,呈成纤维样、梭形，最初散在分布,后逐渐在局部形成集落生长(图1)。一周以后MSCs迅速扩增(图2),约10d后可达80%～90%融合,扩增变缓,即可传代。传代后羊水MSCs5～6h即可贴壁,2～4d生长迅速,1周后即可再次传代。形态为均一的成纤维样的MSCs，呈漩涡样生长,即为羊水源性的MSCs(图3)。

2.2新生儿脐血MSCs

脐血的单个核细胞悬液接种于φ60mm的塑料培养皿中，原代培养6d后，在倒置显微镜下可见单个或少量呈集落生长的贴壁细胞，形态大多为椭圆形或短梭形，凸出于培养皿表面。粘附于贴壁细胞之上的造血细胞和其他细胞在换液的过程中逐渐被清除，10d后就形成细小纤维状小集落，20～25d后细胞集落不断地扩大并形成融合超过80%，细胞形态大多呈短梭形。传代培养后的脐血MSCs12h即可贴壁，4～14d生长迅速,10d后即可再次传代,细胞呈短梭形生长(图4，25×)。10代左右细胞生长状态开始急剧衰退,细胞颗粒化严重，增殖速度严重放慢。

2.3MSCs的生长曲线

人羊水源性MSCs生长曲线呈“S”形，传代后第1、2天为潜伏适应期，从第3天开始细胞增殖加速并进入对数生长期，第6至7天达到高峰，以后进入平台期。通过对第3、5、8代新生儿脐血源性的MSCs细胞计数,绘制的生长曲线形状与羊水源性MSCs生长曲线形状相似，呈S形(图5);传代第1至3天为生长停滞期，第4对14天为快速增殖期，后即进入平台期。随传代次数增加,MSCs的增殖能力有所减弱。第3、5代细胞增殖能力最强,第8代细胞较第3、5代细胞增殖能力减弱较明显，但亦呈“S”形。

2.4不同源性MSCs的生物化学特征

羊水源性MSCs及脐血源性MSCs具有相同的生物化学特征，染色结果都显示：POX、SB染色为阴性，αNAE、PAS为强阳性，ALP染色有1%为弱阳性，这与文献报道的MSCs的染色特点相一致[34]。进一步证明了培养出的成纤维样细胞为MSCs。图1.4d羊水贴壁细胞图2.7d羊水贴壁细胞图3.10d羊水贴壁细胞图4.10d脐血贴壁细胞图5.羊水脐血MSCs生长曲线

3讨论

间质干细胞具有多向分化潜能，是细胞组织工程的首选种子细胞之一。然而人骨髓中的MSCs含量较少，大约104～105个骨髓单个核细胞中只含有一个MSCs[5],这显然难以满足细胞组织工程的实际需要，因此寻找MSCs的来源和如何在体外分离扩增MSCs就显得较为重要。为了更好的得到MSCs，我们分别对孕妇的羊水和新生儿脐带血进行了MSCs的分离，并对所得的MSCs生物学特性进行了比较，以期得到更好的MSCs来源。

间充质干细胞的分离,我们主要参考了Friedenstein建立的MSC分离方法并做了适当的改进，利用MSCs的粘附性来获得MSCs。本实验将羊水细胞和脐血单个核细胞接种于含10%胎牛血清PRMI1640培养基中，3d后去除未贴壁细胞，待细胞单层长满80%后，用胰酶消化传代，本法可去除一些贴壁的非间质干细胞，经过几次传代后即可得到相对较纯的MSCs。

本研究中采用孕妇的羊水和新生儿脐带血标本都可以成功地得到MSCs，这与国外报道的相一致[6]，可作为未来组织工程学的一个不可或缺的来源[7]。两者在形态和生物学特性上都非常类似，但是脐血源性的MSCs形态呈短梭形。明显不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明显要优于脐血源性MSCs,这一点可以从生长曲线与传代能力都得到较好体现。人羊水源性MSCs群体倍增时间较脐血源性MSCs倍增时间短，且人羊水源性MSCs的传代能力明显强于脐血源性MSCs。

综上所述，与脐血源性间充质干细胞增殖能力相比,羊水MSCs的获得更为可观，是组织工程种子细胞的又一可靠来源。

【参考文献】

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[2]田少奇，王丽，孙康，等.人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究[J].中国骨与关节损伤杂志，2009，24(2)：108111.

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[4]李现铎，耿红全，朱哲，等.羊水作为间充质干细胞来源的可行性研究[J].中华小儿科杂志，2006，27(9)：449452.

生物细胞分析篇（5）

中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）11-0270-02

Exploration on Experimental Teaching Reform of Cell Molecular Biology for Animal Science Major

ZHAO Jia-fu 1，2 DUAN Zhi-qiang 1，2 ZHANG Yi-yu 1，2 NI Meng-meng 1，2 RUAN Yong 1，2

（1 Key Laboratory of Animal Genetics Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang Guizhou 550025； 2 College of Animal Science，Guizhou University）

Abstract As an essential course，cell molecular biology plays an important role in the training of high-quality innovative talents in the field of life science.Along with the rapid development of life science，more and more attention to the cultivation of students′ ability to operate experiments need to be improved，especially as an agricultural subject with extensive application.In order to improve students′ interest in experiment course of molecular biology and promote the students′ ability of experiment operation，this paper discussed the reform of experiment teaching content，experiment teaching methods，teaching evaluation ways of animal science，and put forward the concrete reform plan，based on the experimental teaching experiences of cell molecular biology.In conclusion，this article has important guiding significance to the cultivation of the students′ practical ability and research quality.

Key words animal science major；cell molecular biology；experimental teaching reform；ability training

细胞分子生物学是研究细胞内核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述它们之间相互作用的关系及基因表达调控机理的学科[1]，现已广泛应用于生物医学、农林牧渔等学科领域。我国是畜牧业生产和消费大国，需要大量基础理论扎实、创新实践能力强的畜牧科技人才。因此，重视畜牧兽医类本科生细胞分子生物学的理论与实践教学工作，引导学生发现问题、分析问题、解决问题，并进一步加强其动手能力和创新能力的培养，对培养畜牧兽医领域的复合型创新人才具有重要意义。动物科学专业作为生命科学领域一门实践性较强的学科，毕业生应具备牢固的专业理论知识和较强的实践动手能力[2]。以贵州大学为例，该校动物科学专业一直以来没有分子生物学这门基础课程，然而为培养学生基本的分子生物学实验操作能力，又区别于生物学相关专业，因而学校增加了细胞分子生物学这门课程供学生选修。P者结合具体实践教学经验，从实验教学内容、教学方法、组织形式、考核方式等方面进行论述。

1 实验教学内容的改革

1.1 增加实验教学课时比例

在贵州大学2016版动物科学专业培养方案中，与分子生物学实验相关的专业课程只有动物分子遗传学和细胞分子生物学2门课程。动物分子遗传学为专业个性选修课，占2学分，共36学时，其中理论课28学时，实验课8学时；细胞分子生物学为学科大类选修课，占4学分，其中理论课72学时，实验课时。从基本的课时设置上不难看出，细胞分子生物学实验课时与理论课时比例严重失调，许多重要的实验难以开设，培养学生分子生物学实践操作能力的效果大大折扣。因此，亟须调整本校动物科学专业教学方案，增加细胞分子生物学实验课时所占比例。

1.2 编写适于动物科学专业的实验教学指导

目前，大部分高校细胞分子生物学课程均采用现成的实验教学指导，实验内容大同小异，并未体现出生物科学、生物技术、生物工程等理学类相关专业和动物科学、动物医学、水产养殖、草业科学等农学类相关专业在教学对象上的区别，均以大肠杆菌这类模式生物为实验对象，没有体现出不同专业研究对象的区别。因此，需要编写适合动物科学专业的细胞分子生物学实验教学指导，将动物组织中RNA的提取、不同组织中mRNA的表达差异检测、细胞中总蛋白的提取与分离鉴定等实用性、针对性强的实验编入教学指导。

1.3 改单个实验为综合性设计实验

根据贵州大学动物科学专业细胞分子生物学培养方案中实验课时的规定，同时为加强贵州大学动物科学专业细胞分子生物学实验课程的针对性和实用性，目前该实验课程只能安排4 个单个实验项目共时，分别是目的基因的扩增与连接、细胞的培养与冻存、细胞蛋白的提取与鉴定、细胞蛋白的免疫荧光染色。由于每节课只有2 h，所以对于许多实验项目学生只能参与其中的部分内容，有些实验的来龙去脉很多学生还没有搞清楚。为达到开设这门课程的目的，尝试将单个实验全部设计为综合性实验，每个综合性实验融合了多个单个实验[3]，如猪GH基因原核表达载体的构建及表达、猪LPL基因的亚细胞定位研究、猪MSTN基因在不同组织的表达差异研究、猪APOA1基因在HEK-293T细胞中的免疫荧光检测、HEK-293T细胞总蛋白的提取、纯化与鉴定等综合性实验，这些实验学生只要参与完成其中一个项目，就基本上掌握了分子生物学的常用实验操作技能。

2 实验教学方法的改革

2.1 现有实验教学方法的弊端

一是教师课堂上讲授，学生到实验室验证，这种教学方式没有发挥学生的主观能动性，学生处于被动接受的状态，很难引起学生学习的积极性；二是教师准备好实验，学生只完成验证的那部分实验，这种方法无法培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，更难以培养学生基本实验的操作能力；三是针对部分实验，存在教师操作、学生观看的现象，如与细胞培养相关的实验，由于本科教学与研究生教学相比，参加实验人数多，易造成细胞室污染，所以很多实验都由任课教师亲自完成，学生基本上采用观摩的形式参与其中。以上教学方法上的弊端，严重影响了本专业学生实验动手能力的培养，不利于学生自身的发展。

2.2 实验教学方法改革的具体方案

“翻转课堂”是一种新型的教学理念，最早由教育学者萨尔曼・汗创造性地提出，该模式提出了混合使用技术和亲自动手活动的教学环境[4]。它把传统的“灌输式”教学完全翻转，转变成学生课前预习、提前领会知识要点的教学方式，是一种强调自主性和针对性的教学理念[5-6]，对提高实验教学水平，培养出基础知识扎实、具有应用性和开拓性的创新型人才具有重要意义。为达到培养学生实践动手能力的目的，细胞分子生物学实验课程也引进“翻转课堂”的教学理念，转变师生角色，以学生为主体，发掘学生的个人潜力，培养学生的团队协作精神。按照“翻转课堂”的教学模式，在充分发挥学生主观能动性的前提下，制定细胞分子生物学实验教学方法改革具体方案。一是教师设计好综合性实验项目名称，提前供学生选择（至少10个综合性性实验项目名称）；二是按项目分组（每组7～10人），选出组长，分工进行资料查询、方案设计和PPT制作；三是每组20 min进行PPT汇报，任课教师随堂对方案进行点评修改；四是参照实验方案开展研究，学生不必受实验课程时间的限制，在实验教师的参与下，根据各自时间安排完成整个实验项目；五是撰写实验项目报告，并写出个人体会和相关收获。

3 实验教学考核方式的改革

3.1 现有实验教学考核方式的弊端

以往的实验教学考核方式过于简单，且没有统一的标准，只注重是否来上课、是否交了实验报告、实验结果是否合理等方面，忽略了学生在发现问题、主动思考、团队协作、解决问题和语言表达等环节综合能力的考核。因此，实验教学考核方式的改革，应更重视学生综合运用所学知识分析问题和解决问题等方面能力的考察[7]。

3.2 实验教学考核方式改革的具体方案

考核标准和考核方式对教师和学生都具有指挥棒的作用。考核什么、怎么考核直接影响到教师如何教、教什么和学生怎么学、学什么的问题。本实验课本着对学生发现问题、分析问题、解决问题及实验操作等方面能力的培养，特制定如下考核方案：按百分制，其中实验方案设计和PPT报告占40%，实验技能操作和实验报告占30%，实验技术提问和团队协作占20%，考勤和纪律占10%。这样的考核标准不仅可以公正、公平地衡量学生的实验成绩，更重要的是调动了学生学习的积极性和自主性，锻炼了学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。

4 结语

通过对动物科学专业细胞分子生物学实验内容、教学方法和考核方式的改革，进一步打破了实验教学与科学研究之间的界限，使学生能够根据自己的兴趣开展实验研究，充分体现了学生作为实验教学的主体地位，不仅锻炼了学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，还锻炼了学生实验操作、文献检索、PPT制作、团队协作及语言表达等方面的能力，达到了实验教学与科研素质培养的有机结合，为其今后从事相关研究工作或进一步深造奠定了坚实基础。

5 参考文献

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生物细胞分析篇（6）

中图分类号 S183 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）03-0225-03

Abstract Plant suspension cultured cells are good model for studying abiotic stress-responsive mechanism in single cells with dedifferentiation/redifferentiation ability.In this paper，the stress-responsive proteomic data in suspension cultured cells from several plant species（e.g.，Arabidopsis thaliana，Silybum marianum L.，Boesenbergia rotunda L.，Oryza sativa L.，Nitraria sphaerocarpa L.）were analyzed，providing new clues for further investigating the abiotic stress-responsive mechanism in suspension cultured cells.

Key words suspension cultured cells；abiotic stress；response；proteomics

悬浮细胞是由未分化的多个单细胞组成的细胞团，具有脱分化和再分化能力，是研究植物发育与逆境应答的良好模式系统。由于在植物体内很难获得大量的游离单细胞，悬浮培养细胞成为进行植物单细胞蛋白质组学研究的良好材料，已被广泛应用于植物非生物胁迫应答机制的研究。目前，人们已经得到了模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）[1-5]、水飞蓟（Silybum marianum L.）[6]、凹唇姜（Boesenbergia rotunda L.）[7]、水稻（Oryza sativa L.）[4，8]、泡泡刺（Nitraria sphae-rocarpa L.）[9]悬浮培养细胞应答非生物胁迫（NaCl、苯丙氨酸、磷、低温、水杨酸、ATP、脱落酸、茉莉酸甲酯、甲基环糊精）的蛋白质表达谱。

本文整合分析了悬浮培养细胞应答非生物胁迫的蛋白质表达特征，为深入研究植物非生物胁迫应答的网络调控分子机制提供了重要信息。

1 通过G蛋白偶联受体介导的信号转导通路和可逆磷酸化过程应答胁迫信号

当细胞受到胁迫刺激时，一些受体会感知环境信号，并对环境信号进行传递。蛋白质组学研究发现，当悬浮培养细胞受到外源胁迫后，会引发G蛋白和小G蛋白的表达发生变化。在NaCl胁迫条件下，植物悬浮培养细胞中异源三聚体G蛋白的上调表达[9]表明胞外受体接收信号转移至胞内效应分子的信号转导过程被激活[10]。

此外，与细胞运输过程相关的2种小G蛋白，Ran蛋白[7]和Rab[2，6]蛋白在苯丙氨酸、茉莉酸甲酯、甲基环糊精胁迫条件下也都上调表达。它们上调表达暗示着植物悬浮培养细胞的G蛋白、小G蛋白介导的信号通路受外界胁迫诱导，并且由于信号途径的参与可能引发生物合成、核酸转运、细胞周期调控、囊泡运输、分泌等过程来应对胁迫[10-12]。G蛋白介导的信号转导也可以通过磷脂酰肌醇信号通路，其信号转导是通过效应酶磷脂酶C完成的，NaCl胁迫下磷脂酶C表达与活性的提高[9]有助于传递胁迫信号。

蛋白质可逆磷酸化调节多种生物学过程，蛋白激酶和磷酸酶分别催化蛋白质磷酸化与去磷酸化过程。在NaCl、苯丙氨酸、脱落酸处理条件下，细胞壁相关蛋白激酶4蛋白及细胞壁相关受体激酶4蛋白同工型[9]、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[2，7]、钙依赖蛋白激酶[2，9]、核苷二磷酸激酶都上调表达。这表明，植物细胞通过增强蛋白激酶表达丰度来识别细胞外刺激并对信号进行传递[13]。

2 利用活性氧（ROS）清除机制抵御胁迫

在胁迫条件下，悬浮细胞内的正常稳态受到扰乱，形成活性氧簇（ROS）。ROS能造成蛋白、DNA和脂类的氧化破坏[14]。胁迫增强了ROS的产生，造成ROS相关损伤，同时ROS清除机制在保护植物胁迫过程中显示出重要的作用[15]。

在磷、水杨酸和ATP胁迫条件下，悬浮培养细胞的超氧化物歧化酶[5]和过氧化物酶[3，5]都上调表达，它们可以直接清除H2O2。细胞还可以通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环对植物提供保护，抵御由胁迫带来的氧化胁迫[16]。在苯丙氨酸、磷、NaCl胁迫条件下，抗坏血酸过氧化物酶[4，7]、脱氢抗坏血酸还原酶[5]、谷胱甘肽过氧化物酶[7]、谷胱甘肽还原酶[4]均为上调表达。

此外，谷胱甘肽硫转移酶能够催化H2O2的还原反应，它的上调表达[5，9]在缓解ROS对植物造成的氧化损伤过程中发挥重要作用[17]。但是，在NaCl处理条件下，脱氢抗坏血酸还原酶[8]、谷胱甘肽硫转移酶[8]下调表达。胁迫条件下，ROS清除对于植物悬浮培养细胞重建体内稳态并维持正常的代谢活动具有重要意义，并且相关酶的表达丰度在不同物种和不同处理条件下表现出多样性。蛋白质组学研究同样鉴定到了在NaCl、苯丙氨酸、脱落酸胁迫条件下，硫氧还蛋白[8-9]、谷氧还蛋白[8]、非共生血红蛋白[7]、氧化还原酶[9]、脱水蛋白[1，9]的表达发生变化，它们对植物抵御氧化胁迫都具有重要意义。

3 基础代谢与能量平衡为细胞应对胁迫所必需

糖类与能量代谢过程（糖酵解途径、三羧酸循环等）对于植物生长发育和逆境应答具有重要作用。在苯丙氨酸、NaCl、茉莉酸甲酯、甲基环糊精、磷胁迫条件下，参与糖酵解途径的蛋白酶表现为积极响应。在糖酵解途径中果糖二磷酸醛缩酶[7-8]、磷酸丙糖异构酶[8]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶[6]、磷酸甘油酸变位酶和烯醇酶[5]、磷酸烯醇式丙酮酸[7-8]、磷酸葡萄糖变位酶[4]、蔗糖合成酶[4]、丙酮酸脱氢酶[7]、乙醇脱氢酶[6，8]均为上调表达，但是在脱落酸胁迫条件下磷酸果糖激酶[2]下调表达。

此外，还发现二氢硫辛酸脱氢酶也表现为上调表达[2，7]，该酶位于丙酮酸乙酰辅酶A的反应，在糖酵解途径中调节和维持乙酰辅酶A的生产。这些结果表明，胁迫条件下植物悬浮培养细胞通过调节体内糖酵解途径来保持基础物质的供应。

线粒体中三羧酸循环是产生能量的关键过程[18]。在苯丙氨酸、NaCl、茉莉酸甲酯、甲基环糊精胁迫条件下，顺乌头酸酶[7]、苹果酸脱氢酶前体[9]、苹果酸脱氢酶[6]的表达也都发生显著变化。蛋白质组学还鉴定到了在苯丙氨酸、低温、脱落酸胁迫条件下，能量相关蛋白腺苷激酶[7]、ATP合成酶催化亚基A[7]、ATP合成酶β亚基[8]、ATP合成酶CF1α亚基和ATP合成酶CF1β亚基[2]也都上调表达。这些结果表明，胁迫条件下植物悬浮培养细胞通过调节体内能量代谢途径来保证能量的供应。

在大多数情况下，高水平的氨基酸代谢与逆境应答相关，具有保护作用[19]。蛋白质组学研究发现，在苯丙氨酸、NaCl、脱落酸胁迫条件下，磷酸甘油酸脱氢酶[7]、5-甲基四氢化蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶[7-8]、S-腺苷甲硫氨酸合成酶[8]、天冬氨酸氨基转移酶[8]、谷氨酸脱氢酶[1，8-9]以及甲硫氨酸合成酶[9]的表达都发生变化。由于氨基酸参与多种代谢过程，胁迫导致上述酶表达丰度的改变暗示着氨基酸代谢在蛋白质合成、碳骨架形成、渗透保护等过程中起重要作用。

植物悬浮培养细胞受到苯丙氨酸、磷胁迫后，核酸代谢表现出积极的响应。蛋白质组学研究表明，组氨酸乙酰转移酶[7]上调可以调节核内染色质重塑和植物发育相关基因的表达[20]，而核糖核酸酶A的上调表达[5]利于调控细胞内RNA的种类与数量分布。胁迫导致核酸代谢加强，积极参与核内染色质重塑、核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程，以抵御外界胁迫，维持自身稳态。

植物次生代谢过程也受到调节。萜类化合物生物合成在苯丙氨酸、NaCl、脱落酸处理条件下的悬浮培养细胞中受到影响。2种涉及萜类化合物生物合成的蛋白质，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶和1-羟基-2-甲基-丁烯基-4-二磷酸还原酶都上调表达[7]。这些蛋白质在植物质体中参与非甲羟戊酸途径，从而产生类异戊二烯化合物和萜类化合物。

苯丙氨酸解氨酶是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶。苯丙氨酸解氨酶上调表达[9]对于细胞生长、抗病、抗逆反应具有重要作用[21]。此外，蛋白质组学研究还发现芥子油苷代谢相关蛋白腈水解酶1、腈水解酶2和丁腈特异蛋白5上调表达[1]，这将促进芥子油苷代谢，应对环境胁迫。

无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能为植物体所吸收和利用。蛋白质组学研究发现，在苯丙氨酸胁迫条件下，谷氨酰胺合成酶上调表达[7]能够平衡胞内的氮水平[22]，植物亚硝酸盐还原酶上调表达[7]有助于在铁氧还蛋白或甲基紫精还原形式作为电子供体的情况下催化亚硝酸盐还原成氨[23-24]。可见，植物悬浮培养细胞的氮代谢过程在胁迫下表现出积极应答。

蛋白质组学研究还发现在水杨酸和ATP胁迫条件下，细胞外基质蛋白酶表达发生改变，如：黄瓜素类似丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌酶和天冬氨酰蛋白酶[3]，它们涉及细胞程序性死亡过程中细胞与细胞信号转导的复杂蛋白酶网络。此外，短链脱氢酶已被证明是NAD（P）（H）-依赖的还原酶[7]，在苯丙氨酸胁迫下，它的上调表达反映了其参与调控细胞程序性死亡、植物生长激素的生物合成、营养信号的过程[25]。悬浮培养细胞在苯丙氨酸胁迫下，脂代谢中GDSL也产生了应答[7]，GDSL脂肪酶的上调表达有利于细胞形态建成、油脂代谢。

4 蛋白质合成与降解调节蛋白质表达模式

蛋白质组学研究发现，NaCl、茉莉酸甲酯、甲基环糊精胁迫导致悬浮培养细胞中参与蛋白质合成的蛋白质表达改变。核糖体蛋白L12的上调表达[9]表明新合成的多肽链起始过程受到促进。在胁迫条件下，蛋白质正确折叠与加工也发挥重要作用。HSP70[6，9]、HSP70相互作用蛋白、HSP60、ATP酶HSP90活化子[9]上调表达，能够防止蛋白质错误折叠、并能维持蛋白质前体的伸展构象和防止其聚集变性和降解[26]，催化蛋白质折叠[27-28]，sHSP上调表达[9]能防止热诱导的蛋白质聚集，促进变性蛋白质复性，降解受损伤的蛋白质[29]。

参与蛋白质降解过程的蛋白质也受到胁迫的影响。在苯丙氨酸胁迫条件下，蛋白酶体亚基β3和蛋白酶体β6上调表达[7]。蛋白酶体是ATP依赖的蛋白酶，能够降解细胞内错误折叠和短命蛋白[30]。在植物响应环境胁迫过程中，泛素介导的蛋白质降解有助于调节信号转导与转录[31]。

泛素/26S蛋白酶体途径是目前已知的最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径[32]。在NaCl、脱落酸、水杨酸和ATP胁迫条件下，此途径中的泛素结合酶E2[8]、F-box家族-相关蛋白、F-box家族蛋白[9]、20S蛋白酶体α亚基G[1，9]、泛素特异性蛋白酶[9]的表达丰度都发生变化。此外，氨肽酶C[8]、枯草杆菌类似丝氨酸蛋白酶[3，5]上调表达。降解过程上调可能为细胞生存提供更多的原材料。

5 细胞结构重塑应对胁迫

细胞壁具有维持细胞形状、参与物质运输、参与细胞防御等功能。在低温、脱落酸、NaCl、磷胁迫条件下，细胞壁相关蛋白的表达发生改变。成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白[2]、葡聚糖内切-1，3-β-葡萄糖苷酶[2]、单铜氧类似蛋白[5]、木葡聚糖糖基转移酶6[5]、可逆糖基化多肽[5]等蛋白质上调表达，这利用增加细胞壁的完整性，积极抵御外界病原体侵袭。此外，α-半乳糖苷酶的下调表达[9]显示了细胞壁水解过程的减弱。

蛋白质组学研究发现细胞骨架相关蛋白质参与响应NaCl和苯丙氨酸胁迫过程。胁迫条件引起细胞大小和形态发生改变，细胞骨架相关蛋白质在此过程中发挥重要作用。微管蛋白β链[9]和γ-微管蛋白相互作用蛋白[9]等参与维持细胞形态的蛋白质下调表达，而肌动蛋白、肌动蛋白样蛋白[7]、肌动蛋白结合蛋白[9]、肌动蛋白丝-衣壳蛋白原肌球蛋白[9]等细胞骨架蛋白质上调表达。这表明，胁迫应答过程中细胞骨架蛋白对于维持细胞形态和胞内物质运输具有重要调节作用。

6 细胞跨膜转运与细胞周期相关蛋白质参与胁迫应答

植物悬浮培养细胞受到甲基环糊精、茉莉酸甲酯、脱落酸、低温胁迫之后，物质吸收和转运状态也发生了改变。蛋白质组学结果表明，ABC转运蛋白家族中的ABCG2[6]、ABC转运子家族蛋白[2]、N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体[2]都显示出上调表达的趋势。此外，病原体相关蛋白10上调表达可能利于储存或运输代谢产物[6]。由此可见，细胞通过加强物质吸收与转运来维持代谢活动所需物质，应对胁迫。

胁迫导致细胞周期改变，进而影响细胞分裂和分化[33]。蛋白质组学研究表明苯丙氨酸和NaCl胁迫引起细胞周期蛋白[7]、细胞周期蛋白c[9]、细胞分裂周期蛋白48[9]上调表达，上述酶表达丰度的改变能够启动细胞周期，促进DNA合成，介导减数分裂。这表明，悬浮培养细胞改变细胞周期以应对胁迫对造成的伤害。

7 参考文献

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生物细胞分析篇（7）

新课程标准实施以来，教材和课堂教学改革倍受关注，但是人们对于作业系统的研究却很少，因此，深入研究作业系统对于推进课程改革的效应是不容忽视的。下面选取了人民教育出版社(简称“人教版”)和北京师范大学出版社(简称“北师大版”)高中生物实验教材《分子与细胞》的作业系统进行比较分析，总结了新课程背景下生物作业系统的特点。

1　作业系统结构层次比较分析

1.1作业的类型和分布情况

两版教材作业的分布和类型见表1。从表1看出，两个版本的教科书作业系统题型丰富多样，不仅出现在课后，还贯穿在正文。正文中作业系统的各个栏目涉及到实验设计、解释数据、解读图表、类比推理、提出假设、得出结论等多方面的技能训练，既突出了重点，且分散了难点。但这些都是目前学生解题的弱势，通过这方面的训练，有利于提高学生的解题能力，学会对知识的迁移应用，增强学生学习的信心。

人教版题型比北师大版更为丰富，同时人教版在每章小结之后增设了“自我检测”，题目基本上考查了本章的核心知识和重要概念，有助于学生在练习的过程中通整巩固，填漏补缺。值得一提的是人教版章后的“画概念图”这种题型，它是概念系统化常用并且行之有效的方法，是一种促进建构性学习与教学的有效策略。运用概念图能诊断学生的前概念、促进知识的整合、改变学生的认识方式、促进对话与合作。

1.2作业的呈现层次比较分析

人教版教科书作业系统课后练习分为基础题和拓展题两个部分，前者主要考查学生对基础知识、基本技能的掌握情况，而后者有一点难度，既有思维拓展，也有知识应用，还有某些科学探究技能的训练等。章后“自我检测”分为概念检测、知识迁移、技能应用和思维拓展四个部分，考查的能力层次比较清晰，符合从简单到复杂，从易到难的学习策略。学生可以通过自主检测，了解自己的水平，发现问题，促进反思，进一步提高。北师大版教科书作业系统课后习题同样也按照题目的难易程度不同进行了排序。

在正文中，人教版和北师大版都能利用思考题或讨论题引导学生掌握知识，解决生活中实际问题，有效的巩固知识点。在探究性活动题中，两版教科书均采用先安排简单的观察、比较、测量、计算等，后安排需要较多逻辑思维的分析实验结果、解读实验数据、推理等。

2　作业系统内容选取方面比较分析

2.1注重生物科学史的学习

人教版对生物科学史教育的实施策略主要体现在作业系统中，如资料分析《细胞学说建立的过程》以及《关于酶本质的探索》等，以作业的形式让学生在阅读材料中置身情境的学习，激发学生的学习动机，透过新的科学表征的建构和传达，使学生能够深刻体会科学家如何发现科学理论、如何提出问题以及解决问题，进而让学生了解科学家在认知过程中所运用的思考模式和认知能力。北师大版则在每一章的开头以“科学发展历程”的形式介绍生物科学史，让学生了解本章所学内容的发展历史，但在作业系统中则没有体现。

生物细胞分析篇（8）

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC 。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor， SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31； MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能； MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常； MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论： MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。

【关键词】 间充质干细胞; 多发性骨髓瘤; 细胞因子

Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow of Patients with Multiple Myeloma

AbstractThe study was purposed to explore the role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the pathogenesis of bone disease particularly observed in multiple myeloma (MM)， the biological features of marrow derived MSCs from patients with MM have been investigated. Marrow aspirates were harvested from 11 newly diagnosed patients with MM and 5 normal adults and MSCs were isolated and culture-expanded by the cell properties of adherence to plastic flasks， The phenotype was analyzed by flow cytometric technique. The proliferation of MSCs was observed by MTT assay and their differentiation capacities into osteoblasts and adipoblasts were assessed with lineage-specific histochemical staining. The concentrations of IL-6 and SCF in the culture supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MSC culture supernatants were collected and MTT assay was performed to evaluate their support on the proliferation of an MM cell line SKO007 cells. The results showed that bone marrow-derived MSCs from MM patients were homogenously positive for CD29， CD73， CD166 and HLA-ABC and negative for hematopoietic cell marker CD45 and endothelial cell marker CD31， the phenotype of which was similar to that of marrow counterparts from normal adults. MTT assay indicated that MSCs from MM patients or normal adults proliferated at similar rates. MSCs from MM patients occupied in vitro osteogenic and adipogenic capacity as those from normal adults. The levels of IL-6 and SCF in culture supernatant were greatly up-regulated in MM patients by ELISA assay. Furthermore， MSC culture supernatants from MM bone marrow displayed enhanced activity to promote the proliferation of SKO007 cells. It is concluded that marrow-derived MSCs from bone marrow of MM patients are normal in their proliferation and differentiation capacities， and myeloma bone disease may not be ascribed to the differentiation of MSCs while the elevated secretion of IL-6 and SCF may provide necessary cues for the survival of malignant myeloma cells.

Key wordsmesenchymal stem cell; multiple myeloma; cytokine

多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）患者呈现特征性的骨质破坏。这种骨质损伤与破骨细胞数量增加，成骨细胞数减少，从而导致骨吸收与成骨之间失平衡有关［1］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）是存在于骨髓的结缔组织干细胞，不但可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，而且是骨髓基质细胞的前体细胞［2］。骨髓基质细胞为骨髓瘤细胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促进破骨细胞的增殖分化，导致溶骨性损伤［3］；而骨髓瘤细胞可通过细胞因子分泌和(或)细胞间的直接接触，引起成骨细胞的凋亡［4］。但是，以上这些病理改变是否涉及MSC本身，抑或MSC的某些改变促进了疾病进程尚不清楚。为此，我们对骨髓瘤MSC的特性进行了研究。

材料和方法

材料来源

11例MM均为初治患者，男7例，女4例，平均年龄59.4岁; IgG型6例， IgA型3例， κ轻链型2例。对照骨髓来源于骨髓象和血象检查正常的健康人，共5例，其中男3例，女2例，平均年龄51.7岁。SKO007 MM细胞株为本研究所传代的细胞株。

骨髓MSC的分离和培养

按参考文献［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM稀释2倍后Percoll梯度密度离心收获单个核细胞。将细胞接种于含10%人骨髓MSC专用培养血清的α-MEM中（血清为Stem Cells公司产品），培养48小时后去除非贴壁细胞，继续培养至贴壁细胞约80%融合，收集培养上清于-70℃冻存备用。0.05%胰蛋白酶消化传代培养。第3代细胞用于以下实验。

细胞免疫表型分析

胰蛋白酶消化收集MSC，加入FITC或PE标志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR单克隆抗体（eBioscience公司产品），室温下避光反应30分钟。用PBS洗涤2次后，FACSCalibur (Becton Dickinson， USA)收集细胞参数，用流式细胞仪检测，WinMDI 2.9软件分析结果。

增殖能力的MTT法测定

收集MSC，按750个细胞/孔接种于含MSC完全培养液的96孔培养板中，每组6孔；将SKO007细胞按1000/孔接种于不含血清的RPMI 1640 培养液的96孔培养板中，培养体系中分别加入10%、20%和40%的MSC培养上清，每组4孔。细胞培养72小时后加入10 μl MTT（1 g/L），继续培养4小时。离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，以未加MTT孔为本底，570 nm波长下测定OD值。

多系分化的鉴定

成骨分化将细胞按5×104/孔接种于6孔培养板，或1×104/孔接种于24孔培养板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、维生素C（50 mg/L）和β-磷酸甘油（10 μmol/L），培养12天，期间换液2次。应用白细胞ALP染色试剂（Sigma公司产品）进行碱性磷酸酶原位染色。

成脂肪分化将细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）和消炎痛（10 μmol/L），连续培养7天后去除培养基，用PBS洗涤2次后多聚甲醛室温固定1小时，1%油红O染色，光学显微镜下观察。

MSC的细胞因子分泌功能测定

消化传代细胞培养至贴壁层致密时，更换无血清的α-MEM，培养48小时后收集培养上清，于-70℃冻存备用。按照试剂盒（Bio-Rad产品）操作说明，应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定，依据由重组人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor， SCF）（Peprotech产品）所作的标准曲线，测定培养上清IL-6和SCF浓度。

统计学处理

试验数据以平均值±标准差（±SD）表示，以t检验进行数据分析，P值

结果

MM患者与正常人骨髓MSC免疫表型的比较

体外培养的MM患者和正常人骨髓MSC均一地表达间充质细胞标志CD73和CD166，表达黏附分子CD29，不表达造血细胞标志CD45和内皮细胞标志CD31。此外，细胞表达HLA-I类分子(HLA-ABC)，不表达HLA-DRII类分子。MM骨髓MSC表型与正常人来源MSC相似， MM患者骨髓MSC表型无改变（图1）。

MM患者骨髓MSC增殖能力分析

利用MTT法检测第3代细胞增殖速率。MM患者骨髓MSC与正常人骨髓MSC组比较没有显著差异，OD值分别为0.46±0.11与0.39±0.08 (P>0.10) ，MM患者骨髓MSC增殖能力正常（图2）。

MM患者与正常人骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力比较

MM患者和正常人骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，细胞形态均发生了明显的变化，部分细胞由纺锤形转变为多边形或不规则形状；12天后经NBT-BCIP染色显示细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，MM患者骨髓与正常人骨髓组细胞显色强度比较无明显差别（图3A、B），显示MM患者骨髓MSC成骨能力并没有减低。应用成脂肪诱导体系作用7天，油红O染色显示两组细胞体外成脂肪性能未见明显差别，MM患者骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力正常（图3C、D）。

MM患者与正常人骨髓MSC的IL-6和SCF表达量比较

1×106 MM患者骨髓MSC细胞48小时分泌的IL-6总量显著高于正常人骨髓MSC，分别为(9.36±2.11)ng 和(4.72±1.64)ng（P

MSC培养上清对SKO007细胞的增殖支持作用

将SKO007细胞用无血清体系培养，加入不同浓度的MSC培养上清，72小时后MTT法测定细胞活力。结果表明：未加条件培养液组大部分细胞死亡；加入10%和20%条件培养液后，两组细胞增殖能力无差别；浓度升至40%时，MM患者骨髓MSC培养上清明显促进SKO007细胞增殖，两组比较差异有统计学意义（P

讨论

MM是B细胞克隆性疾病，肿瘤细胞刺激骨吸收，促进血管形成，导致溶骨性骨损伤，即使化疗成功实施后，骨损伤仍然存在，提示骨髓中成骨细胞的干细胞—MSC可能存在本质的异常。MSC是存在于骨髓的结缔组织干细胞，是骨髓基质细胞的前体细胞。骨髓基质细胞与骨髓瘤细胞相互影响，促进破骨细胞的增殖分化和成骨细胞凋亡。为此，我们分离培养了初治MM骨髓MSC，并与来自年龄相近正常人骨髓的MSC比较，观察MM患者骨髓MSC是否存在生物学特性的异常。结果表明，体外培养的这两种来源MSC表型一致，均不表达造血细胞和内皮细胞的标志，提示MM血管形成可能与MSC向内皮细胞的分化无关。MM患者骨髓MSC不表达HLA-DR，提示MM病人骨髓微环境中炎性因子或相关的调控因素使MSC维系了固有的表型。MSC具有很强的体外增殖和多向分化能力。MM病人骨髓中成骨细胞数量减少［4］，可能与 MM骨髓MSC的增殖分化能力有关。本研究采用MTT法检测MSC细胞增殖速率，结果显示MM骨髓源MSC增殖能力与正常骨髓源MSC比较没有显著差异，提示MM病人的MSC增殖能力正常。在体外，MM骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，具有正常的体外成骨能力，且与正常人骨髓MSC相似; MSC体外成脂肪能力与正常骨髓MSC亦相当。本研究表明，MM病人MSC体外增殖分化能力维持在正常水平，骨髓瘤细胞没有改变MSC固有的自我更新和多向分化能力。然而研究已发现，骨髓瘤细胞与成骨细胞系共培养后成骨细胞株Runx-2基因表达下调，从而抑制成骨细胞向骨细胞分化成熟［5-7］。因此，骨髓瘤骨疾病涉及的病理改变可能发生于成骨细胞阶段，而与MSC分化能力无关。研究已经表明，MSC和骨髓基质细胞可分泌G-CSF、GM-CSF、VEGF、SCF及IL-6等多种细胞因子［3，8， 9］，这些因子相互影响，形成网络调节骨髓瘤细胞的生物学特性［10］，促进骨髓瘤细胞增殖和存活。人骨髓瘤细胞也表达成骨细胞特异性转录因子Runx2，并分泌骨桥蛋白（osteopontin， OPN）［7］。研究发现OPN也与胃癌的侵袭转移有关［11］。骨髓基质细胞分泌IL-6等细胞因子，促进骨髓瘤细胞分泌与成骨发育相关的因子，以抑制成骨新生，促进骨溶性损伤［3，12］。骨髓瘤细胞是骨髓中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）的主要来源。bFGF促进骨髓组织新生血管形成、刺激基质细胞分泌IL-6［13］。人骨髓MSC也表达bFGF受体。骨髓瘤病人MSC细胞分泌异常可能与体内异常细胞因子网络调节有关。本研究发现，在体外，MM患者骨髓MSC分泌的IL-6和SCF量明显高于正常人骨髓MSC，而细胞培养上清促进骨髓瘤细胞SKO007增殖。MM患者骨髓MSC表型和增殖分化功能与正常MSC相当，这提示骨髓MSC在MM病人体内受到骨髓瘤细胞的直接刺激作用后，高表达IL-6和SCF，并以旁分泌的形式维系瘤细胞的恶性表征，从而间接影响成骨和骨吸收过程，这可能是骨髓瘤并发骨疾病的原因之一。

总之，多发性骨髓瘤病人骨髓MSC生物学性状与正常骨髓MSC比较无明显变化，而其高表达IL-6与SCF可能与骨髓瘤细胞的直接作用有关。本实验研究了骨髓瘤MSC的表型、增殖分化、功能等特征，其结果为MM骨损伤的发生机制及其干预治疗等的研究提供了重要信息。

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11 张东涛，袁静，杨力等. 骨桥蛋白在胃癌中的表达及与胃癌侵袭转移的关系. 中华肿瘤杂志，2005; 27:167-169

生物细胞分析篇（9）

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）27-0171-03

细胞生物学是生命科学中的前沿和枢纽学科，生命科学的各个分支学科在细胞层次上进行交汇。细胞生物学同时作为一门重要的基础学科，是本科院校生命科学、医学、农业等专业的重要专业核心主干课程。近年来细胞生物学新的知识内容和研究方法层出不穷，发展迅猛。要使教学内容紧跟细胞生物学发展的前沿；要使学生能了解细胞生物学最新研究成果，培养学生自主获取新知识的能力；传统的教师为主体的课堂教学模式已无法满足要求[1]。在有限的课内教学学时内提高课程教学效果，必须对现有的教学手段和教学方法进行改进，摸索出一种新的课堂教学模式。

传统的教师为主体的教学忽视了学生自主学习、自主探究能力的培养，抑制了学生的研究兴趣与创造性，与对创新人才的强烈需求形成尖锐矛盾[2]。细胞生物学教学根据课程的特点和培养目标，构建课内互动教学结合课外自主学习的“研究型”课堂课教学模式。在研究型教学中，学生是教学过程的主体，学生要在研究中学习和成长，培养学习的主动性和独立性；教师在整个教学过程中起组织者、指导者、帮助者和促进者的作用。课内教学中教师发挥主导作用：对细胞生物学中的经典部分进行讲解；突出学生主体地位：通过案例、专题知识等环节采用启发引导、讨论互动的教学方式，通过科学研究式的学习激发学生学习兴趣，提高教学效果，使学生掌握细胞生物学中的前沿部分。因细胞生物学课内教学学时有限，研究型课堂教学强调课外学生的自主学习。课外自主学习通过教师每次课后推荐的相关文献、视频等资料进行拓展学习，同时结合文献阅读撰写小论文和自主学习小组研讨活动开展，课外学习效果纳入过程性考核成绩。

细胞生物学研究型课堂教学模式从杭州师范大学生命与环境科学学院生物技术专业2009级学生开始，连续实施了四届。为了解学生对细胞生物学研究型课堂教学模式实施的意见和效果评价，以期在今后的实施过程中进一步完善，对2016年6月授课结束的2013级生物科学（非师范）专业学生进行了课程的问卷调查。

一、调查对象与方法

（一）调查对象

杭州师范大学2016年完成学习细胞生物学课程的2013级生物科学（非师范）专业的学生。

（二）调查方法[3-4]

采用问卷调查的方法，共发放调查问卷36份，收回有效问卷34份，有效回收率为94.44%。调查问卷由学生独立填写，当场回收。

二、调查内容

调查内容主要涉及：研究型课堂教学模式对细胞生物学课程内容学习的影响；对本专业学习的影响；对学生综合能力的影响；学生对研究型教学模式适应性评价；学生对研究型教学模式课堂效果的评价和建议。

三、调查结果分析

（一）研究型课堂教学模式对课程内容学习的影响

研究型课堂教学模式对课程内容学习的影响见表1，在被调查的34名学生中，选择研究型课堂教学模式能促进理解掌握每次细胞生物学课堂教学内容的学生为32人，占调查对象的94.12%；31名，占调查对象91.18%的学生认为新的教学模式能更系统地掌握细胞生物学整门课程的知识；85.29%的学生认为新教学模式能帮助了解细胞生物学课程的前沿内容。

（二）研究型课堂教学模式对本专业学习的影响

研究型课堂教学模式对本专业学习的影响见表2，在被调查的34名学生中，选择通过研究型课堂教学模式的学习获得的能力能帮助本专业其他课程学习的学生为25人，占调查对象的73.53%；79.41%的学生认为能激发其学习本专业的兴趣；91.18%的学生认为能拓宽本专业知识面。

（三）研究型课堂教学模式对学生综合能力的影响

研究型课堂教学模式对学生综合能力的影响见表3，在被调查的34名学生中，选择通过研究型课堂教学模式的学习提高了文献检索查阅能力的学生为29人，占调查对象的85.29%，其中20.59%的学生认为有明显提高；58.82%的学生认为能增加解决问题的能力；67.65%的学生认为能增强团队协作意识；64.71%的学生认为能增强与他人交流的能力。

（四）学生对研究型教学模式适应性的情况

学生对研究型教学模式适应性的情况见表4，在被调查的34名学生中，选择对授课教师满意34人，占调查对象的100%；61.76%的学生认为与传统的教学模式相比能适应研究型的教学模式；67.75%的学生课程考核方式合理；76.47%的学生认为新的教学模式占用的课余时间比较合理。

（五）学生对研究型教学模式课堂效果的评价

学生对研究型教学模式课堂效果的评价情况见表5，在被调查的34名学生中，23名学生更喜欢教师采用研究型教学模式进行授课，占调查对象的67.65%；82.35%的学生认为能够提升学习积极性；79.41%的学生认为课程的教学互动和课堂氛围好；91.18%的学生建议学弟学妹们继续采用研究型教学模式。

四、讨论

细胞生物学的发展迅猛，课程内容难以用教材来全部涵盖，也无法仅靠课内有限学时来更好地提高教学效果。因此必须发挥学生的自主性，引导其开展研究性的学习，以获取新的知识[5]。自推动《细胞生物学》课程新教学模式以来，受益学生的实践能力普遍有明显提升，受到实习学校和用人单位的一致好评。学生的科研创新能力明显提高，学生以第一作者发表科研论文4篇，获8项的科研立项，6项的科研竞赛获奖。

通过本次细胞生物学研究型课堂教学模式效果调查结果显示，通过研究型课堂教学，大多数的学生认为能帮助对细胞生物学课程系统性的学习，更好地能了解细胞生物学课程的前沿内容。同时通过新教学模式的学习能增强文献检索查阅能力、解决问题能力；通过新模式中的自主学习小组研讨活动增强了团队协作意识和交流能力。获得的能力能帮助专业其他课程的学习，从而激发学习本专业的兴趣，拓宽专业的知识面。大部分的学生认为能较好地适应新的教学模式。因为新的教学模式除了课内的学习还有较多的课外自主学习，大多数的学生认为占用的课余时间比较合理。91.18%的W生建议继续推行研究型教学模式。

以上{查结果表明，细胞生物学初步建立的研究型教学模式提高学生综合能力和提高课堂积极性上取得了较好的效果。但同时调查问卷中学生对新的教学模式的建议环节中也显示在具体的某些教学环节衔接，课后的自主学习环节互动上还需要调整和完善。

高校应用专业的人才培养目标，不仅是掌握基本的专业知识、熟悉实际的工作方法和技能，而且是能将理论成果转化成技术产品的高级应用研究型人才。有效的课程教学模式和方法作为培养环节中重要的因素，成为众多应用性质专业的关注的热点，通过此次调查发现问题、解决问题，为后续更好地实施研究型教学模式提供参考。

参考文献：

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生物细胞分析篇（10）

在研究分析中发现，药物性间质性肾炎是由于药物等多种原因共同对肾脏产生损害的一种疾病，且累及间质与肾小管[1]。这种疾病发展速度非常快，是引起急性肾衰竭的一种重要因素。在药物药理性作用中，促红细胞生成素对促进红细胞增生分化和成熟具有显著的功效，同时还具有保护细胞、抗血管痉挛、抗感染以及抗凋亡等效果[2]。本研究分析了促红细胞生成素联合甲泼尼龙治疗急性药物性间质性肾炎的临床效果。

1资料与方法

1.1一般资料 选取2012年3月～2015年3月收治的急性药物间质性肾炎患者88例，其中男性52例，女性36例，患者年龄为35～79岁，平均年龄为（42.5±5.1）岁。经检查，排除非药物性病因引起间质性肾炎、高血压、糖尿病等肾炎损害患者。同时尿路感染或尿检异常的患者也排除在外。患者均出现不同程度的发热、皮疹以及少尿等。致病因素主要有质子泵抑制剂、造影剂、混合药物以及抗生素。本次研究活动均在患者知情且同意的基础上展开。根据统计学原理将所有患者分为例数均等的对照组和观察组。两组患者基础性资料并无显著差异，具有可对比性。

1.2方法 所有患者治疗前均停止服用有可能引发病症的药物，同时采取纠正酸中毒、维持水电解质平衡等常规性的治疗方法。对照组患者每天给予500mg甲泼尼龙静脉滴注，1次/d，治疗1w后改为口服，口服剂量为0.5mg/kg・d，在病情好转后，可逐渐减少药物的剂量。观察组患者在对照组治疗的基础上联合使用促红细胞生成素。患者经皮下注射3000U促红细胞生成素，3次/w。对于病情比较严重的患者还应接受血液透析治疗。

1.3观察指标 观察两组患者疗效、血肌酐（Scr）、尿氮素（BUN）、尿酸（UA）以及24h尿蛋白水平，同时记录两组患者少尿期、蛋白尿、血尿以及肾功能恢复时间。

治愈：患者血尿、白细胞尿、蛋白尿均恢复正常，且肾功能也正常，各项临床症状和体征完全消失；有效：患者血尿、蛋白尿以及白细胞尿水平均有所降低，肾功能有明显改善，各项临床表现明显减轻；无效：治疗前后患者的各项体征、表现以及指标并无明显的变化，甚至有加重的情形。

1.4统计学分析 本次实验活动期间所需数据都利用SPSS17.0进行处理，且在数据处理后使用t检验原理对比数据，资料比中产生的数据使用χ2来验证，验证数据P

2结果

2.1两组患者疗效比较 观察组患者治疗有效率为95.5%，对照组患者治疗有效率为81.8%，数据符合统计学差异（P

2.2两组患者临床指标恢复时间比较 在治疗期间，观察组患者少尿期、血尿和蛋白尿、多尿期以及肾功能恢复时间均短于对照组，数据符合统计学差异（P

3讨论

实践表明，药物的肾毒性或过敏性反应非常容易引起急性间质性肾炎。这种疾病在临床上并无明显的表现，容易产生误诊，贻误治疗[3]。促红细胞生成素是一种分子量可达7万的糖蛋白，能够产生激素的作用，同时还可促进红细胞的生成。而甲泼尼龙是一种糖皮质激素，能够产生抗炎、抗过敏、抗休克的作用，同时还能效够发挥免疫制剂的作用。本研究结果见前文详述，提示两种药物同时作用，有利于改善患者肾脏功能[4]。甲泼尼龙所产生抗感染与免疫制剂作用，对改善肾小球基底膜具有显著的效果，同时促红细胞生成素能够抑制肾小管上皮细胞凋亡，能够诱导肾小管上皮细胞再生，促进肾脏修复。同时此类患者会有较多肾损害的临床表现，严重时可引起肾衰竭。本研究中观察组患者少尿期、血尿和蛋白尿、多尿期以及肾功能恢复时间均短于对照组，P

综上所述，急性药物性间质性肾炎患者在治疗的过程中，采用促红细胞生成素联合甲泼尼龙的方法治疗，两种药物的协同作用可明显提高临床治疗效率，有利于改善患者临床症状，还可促进患者肾功能恢复，可推广应用。

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