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中国生物制品学 2017年第01期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志疫苗研究

LT70-DPC结核亚单位疫苗安全性的初步评价1-4

摘要：目的初步评价以阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bro-mide,DDA)、聚肌胞苷酸(Poly I∶C)及胆固醇复合佐剂(简称为DPC)为佐剂的结核融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)亚单位疫苗的安全性。方法急性毒性试验:分别将低剂量与高剂量(分别相当于人用剂量的10 000和40 000倍)的LT70-DPC结核亚单位疫苗经皮下、腹腔两种途径免疫小鼠,观察小鼠毒性反应、死亡情况及体重变化等,同时推算小鼠对LT70-DPC亚单位疫苗的最大耐受剂量(maximum tolerated dose,MTD);异常毒性试验:将小鼠和豚鼠分别经腹腔注射LT70-DPC结核亚单位疫苗,观察动物异常反应、死亡情况及体重变化等;全身过敏试验:豚鼠经LT70-DPC结核亚单位疫苗免疫后,经相应疫苗静脉攻击,观察豚鼠过敏反应。结果急性毒性试验:皮下及腹腔注射后14 d内均未见小鼠的异常反应和死亡,体重均增加,小鼠对该疫苗的MTD为:LT70蛋白>6 600μg/kg,DDA>166 600μg/kg,Poly I∶C>33 200μg/kg,胆固醇>50 600μg/kg;异常毒性试验:注射后7 d内,小鼠及豚鼠全部健存,均未出现异常症状,体重增加;全身过敏试验:攻击后1 h内,豚鼠均未出现过敏反应。结论 LT70-DPC结核亚单位疫苗具有良好的安全性。

水痘减毒活疫苗(SV-1细胞)的大鼠长期毒性试验5-10

摘要：目的观察SD大鼠注射水痘减毒活疫苗(SV-1细胞)后可能出现的毒性反应、毒性反应的恢复情况及可能出现的延迟性毒性反应。方法将SD大鼠随机分为8组,1~4组(主试验组)分为阴性对照组(生理盐水,2.5 ml/只)、细胞基质对照组(SV-1细胞基质,2.5 ml/只)、疫苗低剂量组(水痘减毒活疫苗1剂)和疫苗高剂量组(水痘减毒活疫苗5剂),每组30只;5~8组(卫星组)分组同1~4组,每组10只。均经大鼠颈背部皮下单点注射,每2周注射1次,连续注射3次,末次免疫后6周为恢复期。试验期间进行一般临床观察、体重、食量、体温、眼科、血细胞计数、凝血功能、血液生化、免疫指标、大体解剖观察、主要脏器称重、组织病理学等检查。结果试验期间,主试验组各组动物一般状况良好,各项指标检测均未见有毒理学意义的规律性改变,且动物脏器重量均未见与疫苗相关的明显改变,各组织脏器大体解剖观察均未见明显与给药相关的毒性病理学改变,注射局部组织未见明显与疫苗相关的刺激性反应;卫星组大鼠免疫前血清抗体均为阴性,末次免疫后2周,阴性对照组和细胞基质组抗体检测结果均为阴性,低剂量组和高剂量组抗体阳转率100%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶73.5和1∶111.4,仅有部分大鼠可检测到分泌IFNγ的T淋巴细胞。结论水痘减毒活疫苗(SV-1细胞)经大鼠长期毒性试验未见明显毒性反应,初步证实该疫苗具有良好的安全性及有效性。

甘露寡糖修饰布氏菌Rsα蛋白的生物活性11-14

摘要：目的评价甘露寡糖修饰布氏菌Rsα蛋白的生物活性。方法经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学偶联法,用4种甘露寡糖(甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖及甘露六糖)对Rsα蛋白按不同摩尔比进行寡糖修饰。FITC荧光标记4种甘露寡糖修饰Rsα蛋白后,作用于RAW264.7细胞,荧光显微镜观察细胞对荧光的吞噬情况;流式细胞术检测细胞对蛋白的吞噬率。结果甘露寡糖与蛋白投料摩尔比达1 000∶1时获得的反应产物较稳定。甘露五糖修饰的Rsα蛋白被巨噬细胞吞噬的速度最快,其细胞吞噬率最高(25.89%)。结论筛选出五糖修饰的Rsα蛋白具有较高的生物活性,为研究其作为布氏菌糖蛋白候选疫苗的可行性奠定了基础。

中国生物制品学杂志基础研究

Msi2对急性髓系白血病THP-1细胞体外增殖能力的影响15-18

人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白的原核表达及其免疫原性评价19-24

摘要：目的原核表达重组人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)A型Long株截短F1融合性蛋白,并评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增HRSV截短F1蛋白基因序列,克隆至pET-28b表达载体,构建重组原核表达质粒RSV F1/pET-28b,转化大肠埃希菌Shuffle T7菌株,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;用Ni亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析。将纯化的重组截短F1蛋白免疫ICR小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的截短F1蛋白相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,纯度达90.6%。重组截短F1蛋白免疫小鼠血清抗体效价最高可达1∶4 096。结论原核表达的重组HRSV截短F1蛋白免疫原性好,为单克隆抗体的制备及检测试剂盒的研究奠定了基础。

通过自诱导方法对乙型肝炎病毒聚合酶TP区进行可溶性表达及鉴定25-28

摘要：目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(www.jcat.de/)在线优化,并在5′和3′端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行人工合成;将人工合成的TP-DNA双酶切后,插入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS进行自诱导表达。结果重组原核表达质粒pET32a(+)/POL-TP-Opt经双酶切及测序证明构建正确;在表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,相对分子质量约20 000,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,为可溶性的重组TP蛋白。结论通过自诱导培养方法,直接成功获得可溶性的重组TP蛋白,改变了长期以来依靠包涵体复性对TP蛋白相关功能进行研究的状况。

T-cadherin基因在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞DU145增殖的影响29-33

CpG ODN佐剂序列IMB-AC5的体外免疫刺激活性分析34-37

海兰褐鸡卵泡颗粒细胞微管去稳蛋白2过表达对Ras-MAPK信号通路的影响38-42

中国生物制品学杂志治疗性制剂

治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂的稳定性43-48

摘要：目的考察治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂A、B的稳定性。方法按照《中国药典》三部(2010版)方法,对治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂A、B分别进行影响因素试验、加速试验、长期试验,在不同条件下考察样品的基本性状,特别检测质粒DNA的超螺旋比例及进行细胞学转染试验和体内药效学试验。结果双质粒HBV DNA疫苗制剂在破坏性因素的影响下,于光照(4 500±500)Lx、高温(40和60℃)、反复冻融(-20℃←→4℃和-20℃←→RT)条件下5 d均不稳定;匀速振动(140和240 r/min)10 d不稳定;在(25±2)℃、相对湿度(60±10)%的条件下放置1个月不稳定;在温度2~8℃条件下放置2年保持稳定。结论双质粒HBV DNA疫苗制剂对光照、温度敏感,应避光低温保存,避免反复冻融,适合现代快速长途运输,长期保存应在2~8℃条件下,暂定二年有效期,为治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床用样品的运输和保存提供了依据。

中国生物制品学杂志消息

《中国生物制品学杂志》移动版上线了48-

中国生物制品学杂志诊断制剂

重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白残留测定试剂盒的适用性验证49-52

中国生物制品学杂志临床研究

2015年山东省烟台地区柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析53-58

摘要：目的研究2015年山东省烟台地区手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)的病原谱,并分析病原谱中柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)流行株的进化及VP1区重要氨基酸位点的变异情况。方法采用实时荧光逆转录聚合酶链反应方法,对2015年烟台地区采集于HFMD患者的696份样品进行肠道病毒(enterovirus,EV)核酸检测和分子定型。根据EV的优势血清型,选取10株CV-A16扩增VP1区,并进行核苷酸序列及系统发育分析。结果从696份标本中检出EV 412株,其中101株为CV-A16,76株为EV-A71型。10株CV-A16的核苷酸序列相似性为88.4%~99.9%,氨基酸序列相似性为98.6%~100%。10株CV-A16烟台株分别属于B基因型的B1a和B1b进化分支,其中B1b进化分支为优势株。与参考株Tainan/5079/98(AF177911)相比,10株CVA16分离株氨基酸序列的第11、23、99、145、289位氨基酸出现突变,10株分离株的这些位点也有不同,表明烟台地区的CV-A16有其独特的突变位点。结论 CV-A16是引起2015年烟台地区HFMD发病的常见病原体,本次分离到的CV-A16均属于B基因型的Bla和B1b进化分支。

内蒙古自治区2013年麻疹流行病学特征分析及麻疹疫苗的接种情况59-62

摘要：目的分析2013年内蒙古自治区麻疹流行病学特征及麻疹疫苗的接种情况。方法应用描述流行病学方法,对2013年内蒙古自治区麻疹疫情资料进行分析,评价麻疹成分疫苗(measles-containing vaccine,MCV)的接种情况及麻疹监测系统(Measles Surveillance System,MSS)的运行质量。结果内蒙古自治区2013年报告麻疹病例590例,发病率为2.37/10万,全自治区各盟市均有病例报告。麻疹发病呈季节性分布,第16~31周病例数(559例)占病例总数的94.95%;0~4岁组发病数(282例)和发病率(25.34/10万)最高,其次为30~34岁组(发病数为36例,发病率为3.81/10万);流动人口占全部报告病例的7.63%(45例),非流动人口占92.37%(545例);不满8月龄组病例98例,占病例总数的16.61%,其中免疫2剂、1剂、未免疫MCV及免疫史不详的比例分别为6.78%(40例)、7.63%(45例)、24.75%(146例)和44.23%(261例);第1剂(MCV1)实种268 182人,报告接种率为99.63%,第2剂(MCV2)实种257 466人,报告接种率为99.51%。通过MSS共报告疑似麻疹病例1 138例,99.82%(1 136例)报告了个案调查信息,48 h内个案完整调查比例为99.82%,主要基因型为H1a。结论 2013年内蒙古自治区麻疹发病率较低,MCV接种效果良好,今后应进一步提高自治区MCV接种率,将常规免疫作为核心,做好重点人群麻疹疫苗(measles vaccine,MV)的补种工作,提高MSS系统的运行效率和质量,控制麻疹传播直至消除。

甲状腺癌中CD105及内皮抑素蛋白的表达意义63-67

中国生物制品学杂志技术方法

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析68-73

摘要：目的建立无血清无动物源性培养基（virus production-serum-free medium,VP-SFM）培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率（μ）和分裂次数（Cd）;比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×106个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为（94.20±3.95）%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×105个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h-1。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义（P>0.05）;142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义（P>0.05）;140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义（P>0.05）。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。

人纤溶酶活性动态显色检测方法的建立及验证74-78

摘要：目的建立人纤溶酶(plasmin,Plm)活性的动态显色检测方法,并进行验证。方法用微量滴定板作为载体,将不同活性浓度的Plm(1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 IU/ml)分别与不同浓度的发色底物S-2251(2.0、1.0、0.66、0.33 mg/ml)混匀,连续监测10 min,测定反应体系吸光值变化率(ΔA/min),确定方法的反应参数。同时对方法的选择性、线性范围、定量下限、准确度、精密性、特异性及稳定性进行验证。采用建立的方法检测Plm纯化样品。结果确定定量上限为0.6 IU/ml,底物浓度为0.66 mg/ml;监测5 min时校正标样及质控样品回收率为92.0%~111.8%,定量下限样品回收率为96.5%~118.0%。注射用水、稀释液、尿激酶(Urokinase,UK)、6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,EACA)、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)等组分的响应低于定量下限响应的8.22%,并低于内标响应的0.86%,表明该方法具有良好的选择性;线性范围为0.05~0.6 IU/ml,校正标样回收率在96.8%~111.2%之间,R2≥0.99;定量下限为0.05 IU/ml,定量下限处准确度在115.2%~116.2%之间,CV≤5.0%;高、中、低浓度质控样品检测结果准确度在102.3%~111.8%之间;批内CV值≤7.7%,批间CV值≤5.2%;0.5μg/ml UK对Plm活性检测无影响,EACA浓度在0.05~0.2 mol/L之间及Plg浓度低于0.3 mg/ml时对Plm活性检测结果无影响;Plm质控样品复溶后在室温及2~8℃放置1 h不影响检测结果。Plm纯化样品活性回收率为91.84%。结论本方法具有良好的准确度、精密度、特异性及稳定性,可用于工艺样品中Plm活性的检测。

生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型79-81

摘要：目的利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CA16）。方法应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×105个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达最高,约7.75 TCID50/ml。结论成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础。