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中国生物制品学 2016年第11期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志疫苗研究

W135群脑膜炎球菌结合物的制备及其在小鼠体内的免疫原性1121-1125

摘要：目的比较不同活化试剂、不同载体蛋白质及不同免疫程序对W135群脑膜炎球菌结合物在小鼠体内的免疫原性的影响。方法分别采用溴化氰（CNBr）和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶-四氟硼酸盐（CDAP）为活化试剂,以己二酸二酰肼（ADH）为连接臂制备W135群脑膜炎球菌多糖（group W135 meningococcal polysaccharide,PSW135）衍生物;以碳二亚胺（EDAC）作为缩合剂,将多糖衍生物分别与破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）、白喉类毒素（diphtheria toxoid,DT）和重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA）3种蛋白质共价结合,制备6种PSW135蛋白质结合物;比较4针免疫程序（0、2、4、8周）和3针免疫程序（0、4、8周）对结合物在小鼠体内免疫原性的影响。结果两种活化试剂均能对多糖进行有效活化,且不会破坏多糖的抗原性;制备的6种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,且具有显著的剂次加强效应;采用间隔2周的3针免疫程序和2.5μg/只的免疫剂量,不同类型的活化试剂和载体蛋白质对结合物的免疫原性无显著影响,但以DT为载体蛋白质的结合物的免疫加强效应要弱于以TT和r EPA为载体的结合物;延长免疫间隔时间可显著提高结合物在小鼠体内的免疫原性。结论初步建立了适用于W135群脑膜炎球菌结合疫苗的结合工艺,并为结合物在小鼠体内的免疫原性研究提供了一种新的候选免疫程序。

重组戊型肝炎疫苗抗原P179表征分析1126-1131

摘要：目的对重组戊型肝炎疫苗（recombinant hepatitis E virus,rHEV）抗原P179表征进行分析。方法取3批HPLC及电泳纯度均为100%的rHEV抗原P179原液,采用SDS-PAGE法检测相对分子质量及二聚体含量;OPA-FMOC全自动柱前衍生-Amino Quant氨基酸分析法测定氨基酸组分;电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（electrospray ionizationquadrupole time-of-flight-mass spectrometry,ESI-Q-TOF2-MS）法分析C-末端、Edman降解法测定N-末端氨基酸序列;HPLC法进行肽图分析;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;圆二色光谱仪分析其二级结构;透射电镜负染法观察蛋白颗粒状态;双抗体夹心ELISA法检测抗原活性。结果 3批rHEV抗原P179相对分子质量在17 500-21 300之间;二聚体占总蛋白的85%以上;氨基酸组分、C-末端氨基酸序列、N-末端氨基酸序列、肽图、等电点等均与预期相符;3批rHEV抗原P179二级结构中,α螺旋4.8%-5.6%,β折叠34.8%-36.4%,β转角20.8%-22.2%及无规卷曲37.7%-38.0%;透射电镜观察可见大小均一,粒径约20 nm的蛋白颗粒;抗原活性比值在5.0×10^5-2.0×10^6CCU/mg范围内。结论 3批r HEV抗原P179结构特征均一,与设计相符,为该疫苗的产业化奠定了基础。

喷鼻三价流感裂解疫苗在小鼠体内的免疫原性及免疫保护性1132-1136

摘要：目的评价喷鼻三价流感裂解疫苗在小鼠体内产生的免疫原性及免疫保护性。方法选用H1N1、H3N2、B型3种裂解抗原联合后,与佐剂壳聚糖季铵盐（HTCC）水凝胶等体积混合,制备三价流感裂解疫苗。经喷鼻免疫BALB/c小鼠,免疫剂量为每种单价抗原2μg/只,第0及14天各免疫1次,于末次免疫后第14天制备小鼠血清及鼻、肺、阴道灌洗液。血凝抑制法检测小鼠血清的血凝抑制抗体（HI）效价;ELISA法检测小鼠血清中Ig G及其亚型抗体效价和小鼠鼻、肺、阴道灌洗液中sIgA效价;末次免疫14 d,用H1N1流感病毒进行攻毒,观察小鼠体重变化及死亡率。结果经喷鼻免疫三价流感裂解疫苗的小鼠血清可产生较高效价的HI抗体,IgG抗体亚型以IgG1与IgG2a为主,小鼠鼻、肺、阴道灌洗液中均可检测到特异性sIgA。攻毒后小鼠体重变化较小,14 d后全部存活。结论经喷鼻免疫三价流感裂解疫苗可激发小鼠产生体液、细胞及黏膜免疫反应,具有良好的免疫保护性。

中国生物制品学杂志消息

全球健康促进大会将首次在中国举行1136-1136

摘要：第九届全球健康促进大会将于2016年11月21日-24日在中国上海举行。全球健康促进大会是健康促进领域最高级别的会议。本届大会由国家卫生计生委和世界卫生组织共同主办,上海市人民政府承办。来自世界卫生组织各成员国负责健康促进工作的代表,联合国有关机构负责人。

中国生物制品学杂志基础研究

水痘-带状疱疹病毒84-7株基因特征分析1137-1140

摘要：目的分析水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）84-7株的基因特征。方法利用PCR法分别扩增VZV84-7株ORF38（PstⅠ）、ORF54（BglⅠ）、ORF62（SmaⅠ、Bss HⅡ、NaeⅠ）共5个酶切位点片段,运用生物信息学软件对5个酶切位点进行分析;PCR扩增病毒复制起点,分析VZV84-7株复制起点特征;PCR扩增VZV84-7株g E基因,对该基因进行序列分析。结果 VZV84-7株的酶切位点特征为：PstⅠ＋BglⅠ＋SmaⅠ-Bss HⅡ-NaeⅠ-;复制起点区域包含1个13TA＋19GA结构;g E基因序列与Oka株相比,在第1 170位存在1个碱基差异,为C→A,属于无义突变,但编码区氨基酸序列同源性为100%。结论 VZV84-7株的酶切位点和复制起点均有特异性,同时VZV84-7株与Oka株的g E基因仅有1个碱基突变,氨基酸序列同源性为100%。

重组腺病毒载体pAd-4-hMASP-2的构建1141-1145

摘要：目的利用p Yr-adshuttle-4质粒构建重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2。方法应用PCR技术扩增甘露糖凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2（human mannan-binding lectin associated serine protease-2,h MASP-2）基因,经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后与p Yr-adshuttle-4质粒连接,构建穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2,在LR酶作用下与腺病毒骨架载体p Ad/PL-DEST进行体外同源重组,获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒r Adh MASP-2,应用酶切、PCR扩增及基因测序进行鉴定,并测定病毒滴度。将r Ad-h MASP-2感染小鼠,实时荧光定量PCR法检测h MASP-2基因m RNA在小鼠肺组织中的表达。结果重组穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2经双酶切及测序证实构建正确,通过同源重组获得了重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,扩增出滴度为1.5×10^9 PFU/ml的重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,其能在小鼠肺组织中表达。结论成功获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2和重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,为体内外研究h MASP-2的活性提供了有效的转基因载体。

细丝蛋白A shRNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的检测1146-1149

摘要：目的构建细丝蛋白A（filamin A,FLNa）shRNA慢病毒载体,并检测其在肝癌细胞Hep G2和Huh7中的干扰效率。方法通过合成干扰基因片段,插入至shRNA慢病毒载体GV298中,构建FLNa shRNA慢病毒载体shRNAFilamin1和shRNA-Filamin2,转染Hep G2和Huh7细胞,荧光显微镜下观察红色荧光表达,Western blot法检测Filamin A干扰效率。结果构建的FLNa shRNA慢病毒载体经测序证明构建正确;转染24 h后,Hep G2和Huh7细胞可见红色荧光;转染48 h后,shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2的干扰效率在Hep G2细胞中分别约为45.4%和63.7%,在Huh7细胞中分别约为76.5%和78.3%。结论成功构建FLNa shRNA慢病毒载体,在Hep G2和Huh7细胞中干扰效率较高;可与多种病毒的受体蛋白相互作用,从而参与病毒的复制周期,为今后病毒复制及其致病机理的研究提供了新的思路。

尖锐湿疣患者角质形成细胞的培养及其生物学特性鉴定1150-1153

摘要：目的对尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）患者皮损处角质形成细胞进行培养及鉴定,测定β-catenin m RNA表达情况,分析细胞周期的变化。方法采用两步消化法对皮损细胞进行消化,获得原代角质形成细胞后,进行体外无血清培养基培养。镜下观察细胞形态,并进行免疫组化染色鉴定;绘制细胞生长曲线;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞周期。结果镜下可见细胞为多角形或不规则形,呈铺路石状,细胞生长旺盛,轮廓清晰,折光性好,胞浆均被染成红色,为角蛋白阳性,于第3天开始进入对数生长期,第7、8天进入平台期。获得的角质形成细胞可稳定增殖,在CA的发病过程中,β-catenin m RNA的表达异常,细胞周期发生改变。结论 CA的发病过程中β-catenin m RNA的表达异常及细胞周期的改变可为CA的临床治疗提供了理论依据。

锦鲤疱疹病毒保存方法的筛选及比较1154-1158

摘要：目的筛选并比较锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）的保存方法。方法将患锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）的患病鱼组织分别采用-80℃超低温保存法、液氮超低温保存法、50%磷酸甘油缓冲液保存法、乙醇保存法及异丙醇保存法保存90 d,进行PCR鉴定,同时检测不同方法保存的患病组织对感染健康鱼及CCB细胞的影响。用KHV感染CCB细胞后,收集病毒液,分别于4、-20、-80℃及液氮中存放90 d,检测病毒感染力（TCID50）。结果 5种方法保存的患病鱼组织经PCR检测均为KHV阳性。于50%磷酸甘油缓冲液、乙醇及异丙醇中保存的患病鱼组织失去了感染健康鱼的能力,而于-80℃及液氮中保存的患病鱼组织均可使健康锦鲤感染KHV;仅保存于50%磷酸甘油缓冲液中的患病鱼组织可感染CCB细胞。于4及-20℃保存的CCB细胞病毒液的病毒感染力分别下降61%和50%,而于-80℃及液氮中保存的CCB细胞病毒液的病毒感染力仅下降7%。结论利用-80℃及液氮超低温保存法可长期保存患病组织病料和细胞病毒液,于50%磷酸甘油缓冲液保存的组织病料有利于进行病毒的细胞分离。

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E胞外区的真核表达及鉴定1159-1161

摘要：目的真核表达水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）糖蛋白E胞外区（gE537）,并进行鉴定。方法用Oka株VZV（VZV-Oka）感染人二倍体细胞（2BS株）,提取基因组DNA,以其为模板,PCR扩增gE537目的片段,克隆至载体pCI-neo,构建重组真核表达质粒p CI-neo-g E537-His。大量扩增后提取质粒,转染293FT细胞,瞬时表达,经镍柱纯化,获得目的蛋白gE537-His,Western blot和ELISA法进行鉴定。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒pCIneo-g E537-His构建成功。200 mmol/L咪唑洗脱液为洗脱目的蛋白的最佳咪唑浓度。纯化产物可与鼠抗gE糖蛋白单抗于相对分子质量约90 000处发生特异性结合,且可与mAb-10、mAb-12抗gE单抗发生反应。结论利用293FT细胞成功表达了gE537,为其免疫原性等相关研究奠定了基础。

中国生物制品学杂志治疗性制剂

靶向人表皮生长因子受体3治疗性单克隆抗体的制备及筛选1162-1168

摘要：目的制备并筛选靶向人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3,Her3）的单克隆抗体。方法用CHO系统克隆表达Her3的胞外区,获得重组蛋白h GH-Her3-ECD,用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,并经常规细胞融合杂交瘤技术制备单克隆抗体。对制备的单克隆抗体进行抑制Her3与其配体HRG的结合试验、亲和力测定、亚型鉴定、结合抗原结构域的确定、识别肿瘤细胞表面Her3抗原的FACS分析及对A431细胞增殖抑制分析。结果获得100多株靶向Her3的单克隆抗体,其中927、1002、1050、993、1044、1056株具有较强的抑制Her3与HRG结合活性,均为Ig G1型,亲和力较好。927、1002、1050株与Her3第Ⅰ结构域结合,993、1044、1056株与Her3第Ⅲ结构域结合,均能结合A431和Bx Pc3表面的Her3分子,可明显抑制A431细胞的增殖。结论获得的靶向Her3单克隆抗体基本满足开发治疗性单抗的要求,具有成为治疗性单克隆抗体的潜在条件。

中国生物制品学杂志诊断制剂

戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品的建立1169-1171

摘要：目的制备戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品。方法从我国多省血液中心、采浆站收集血清、血浆样品300份,应用国内外5家HEV IgG抗体诊断试剂进行筛选,制备HEV IgG国家参考品,并对参考品的稳定性及适用性进行检测。结果制备了HEV IgG国家参考品,其中阴性参考品30份;阳性参考品10份;灵敏度参考品1份,依据HEV IgG国际标准品进行标化,定量为3 U/ml;精密性参考品1份。参考品经4℃及室温放置10 d,37℃放置7 d,以及反复冻融3次后,测定结果与-20℃放置参考品检测结果一致,稳定性良好。5个厂家试剂对参考品的检测结果显示该参考品具有较好的适用性。结论制备了戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品,为提高诊断试剂的质量奠定了基础。

中国生物制品学杂志临床研究

胃肠道间质瘤C-kit及PDGFRA基因突变检测及分析1172-1178

摘要：目的检测胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors,GIST）患者中酪氨酸激酶受体基因C-kit及血小板源性生长因子受体A（platelet derived growth factor receptor A,PDGFRA）基因突变情况,探讨其与GIST发病的相关性。方法从武汉大学人民医院及武汉大学中南医院收集的102例GIST患者石蜡肿瘤切片样本中提取DNA,采用PCR技术扩增特异性目的片段,并直接进行序列测定,分析样本中C-kit及PDGFRA基因突变情况。结果在102份石蜡肿瘤切片样本中共检出C-kit基因突变76例,其中大多数突变发生于第11号外显子上,共65例,包括缺失突变43例,占66.15%（43/65）,点突变12例,占18.46%（12/65）,插入突变4例,占6.15%（4/65）,点突变伴随缺失突变6例,占9.23%（6/65）;7例样本存在第9号外显子突变;3例样本存在第13号外显子突变;2例样本检测出第17号外显子突变。共检出PDGFRA基因突变4例,其中第12号外显子突变的有3例,第18号外显子突变仅检出1例。结论大多数GIST患者中存在C-kit基因的突变,且主要突变位置在第11号外显子;PDGFRA基因突变存在于C-kit未突变患者中。

我国部分地区儿童b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体水平的调查1179-1182

摘要：目的调查我国部分地区儿童b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）荚膜多糖的组分多聚核糖基-核糖醇-磷酸盐（polyribosylribitol phosphate,PRP）的抗体（抗-PRP）水平。方法采用ELISA法对2007-2014年间来自我国广西壮族自治区、江苏省、河南省的13 799份2月龄-5岁健康儿童的血清标本进行抗-PRP自然抗体水平的检测。结果 2007-2014年间我国2月龄-5岁儿童抗-PRP自然抗体阳性率、抗体浓度达到长期保护水平的比例及抗体几何平均浓度（GMC）呈逐年升高的趋势,其中2-11月龄儿童的抗-PRP自然抗体阳性率较低;不同地区儿童抗-PRP自然抗体水平差异不大,且不同性别间抗体水平分布较均衡。结论我国2-11月龄儿童仍是Hib的易感人群,是需进行Hib结合疫苗预防接种的重点人群。

重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）上市后安全性的临床观察1183-1186

摘要：目的观察重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）上市后大规模应用于新生儿的安全性。方法采用观察性队列研究方法,对2015年4月1日-8月30日期间在江苏省南通市辖区内新生儿按国家儿童免疫规划程序,常规接种重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）,分别通过《江苏省儿童预防接种个案信息管理系统》和《疑似预防接种异常反应（AEFI）信息管理系统》收集接种信息及接种后安全性数据,评价该疫苗应用于新生儿的安全性。结果 2015年4月1日-8月30日期间报告发生AEFI共37例,发生率为40.93/10万,无严重不良事件和严重非预期不良事件报告。37例AEFI病例中一般反应32例,异常反应5例,无偶合症与心因性反应报告;一般反应以接种后发热居多,占一般反应的67.57%,第3针接种后发热的发生率达69.84/10万;异常反应中过敏性皮疹2例,荨麻疹及热性惊厥各1例。37例AEFI病例不良反应主要出现在接种后30 min-24 h内,预后均良好。结论重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）上市后在新生儿中具有良好的安全性。

吉林省2009～2014年乙型肝炎疫苗疑似预防接种异常反应监测分析1187-1190

摘要：目的分析吉林省2009-2014年乙型肝炎疫苗（hepatitis B vaccines,Hep B）疑似预防接种异常反应（adverse events following immunization,AEFI）的发生特征,评价Hep B安全性及吉林省AEFI监测工作。方法通过全国AEFI监测信息管理系统,收集吉林省2009-2014年报告Hep B AEFI数据,采用描述性流行病学方法对相关数据进行分析。结果吉林省2009-2014年共报告Hep B AEFI 897例,报告发生率为159.11/100万剂次;男女性别比为1.09∶1;〈1岁婴儿占88.85%;一般反应报告发生率为154.50/100万剂次,异常反应报告发生率为3.37/100万剂次;Hep B AEFI主要集中在接种后≤1 d。结论 Hep B具有较好的安全性,AEFI以一般反应和过敏反应为主。

中国生物制品学杂志技术方法

Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液蛋白成分分析1191-1195

摘要：目的对本公司研发的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液进行蛋白成分分析及鉴定。方法按照疫苗生产工艺,应用NBS篮式生物反应器生产单价脊髓灰质炎病毒原液,经超滤浓缩及分子筛和阴离子交换两步柱层析纯化方法,收集并灭活蛋白峰。透射电镜下观察病毒形态及大小;ELISA方法检测宿主细胞蛋白（host cell protein,HCP）及残留牛血清白蛋白含量;HPLC法分析单价灭活病毒纯化液纯度;液相色谱（liquid chromatography,LC）与电喷雾电离质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）相结合的技术鉴定样品中所含蛋白成分。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液中可见球形病毒颗粒,直径25-30 nm;HCP、残余牛血清白蛋白含量分别低于50 ng/ml、2.5μg/ml;纯度大于95%;单价脊髓灰质炎病毒样品中含有相应血清型的脊髓灰质炎病毒基因组编码蛋白,且相应病毒蛋白成分数据库匹配相对分值在所含蛋白组分中均最高。结论Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒液经纯化后,有效去除了杂质蛋白保留了病毒蛋白组分,单价病毒纯化液病毒蛋白成分明确,纯度较高,为后续该疫苗的研发与生产提供了参考。

水痘-带状疱疹病毒在Vero细胞中的传代培养及抗水痘血清的制备1196-1199

摘要：目的在Vero细胞中传代培养水痘-带状疱疹病毒（varicella-herpes zoster virus,VZV）,并制备抗水痘血清。方法将VZV（北京株VZV84-2）在Vero细胞中传代培养,待细胞病变（CPE）稳定后制备抗原,分别免疫家兔（分为1组和2组）和豚鼠（仅1组）,均免疫4次,每次间隔14 d,其中除家兔1组第3、4次免疫经耳静脉注射不含佐剂的免疫原外,其他均经背部皮下免疫含弗氏完全佐剂的免疫原。于末次免疫后2周经颈动脉采血,分离血清,进行无菌试验、中和抗体效价检测及特异性干扰试验。结果 VZV（北京株84-2）在Vero细胞中传至第5代时,CPE可达80%~90%,传至第10代时,CPE稳定。用含兔及豚鼠血清培养基制备的免疫原的蛋白含量分别为2.1和1.7 mg/ml。抗血清无菌检测合格;家兔1组、豚鼠组、家兔2组的血清中和抗体效价分别为1∶128、1∶256、1∶64;抗水痘血清对麻疹（沪191株）、腮腺炎（S79株）、风疹（BRDⅡ株）疫苗的滴定无干扰。结论成功将VZV在Vero细胞中进行传代培养,并制备了抗水痘血清,但效价较低,有待进一步提高。