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中国生物制品学 2011年第04期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

丙型肝炎病毒JFH1 NS5A基因对HC-J4病毒复制和感染性的影响373-378

摘要：目的探讨丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）2a FL-J6JFH NS5A基因置换对1b型HC-J4复制和感染性的影响,为建立HCV 1b细胞模型奠定基础。方法将JFH1 NS5A置换至HC-J4基因组内,构建嵌合全长基因组HC-J4/JFHNS-5A。体外制备野生型HC-J4、嵌合体及FL-J6JFH的RNA转录体,脂质体介导转染Huh-7.5细胞,采用间接免疫荧光法（IFA）检测转染细胞内的蛋白表达,HCV负链RNA特异性RT-PCR法和荧光定量PCR方法（FQ-PCR）检测基因复制情况。转染后不同时间收集转染细胞上清,感染naive Huh-7.5细胞,观察其感染性。结果 IFA未观察到野生型HC-J4和嵌合体转染细胞内HCV蛋白的表达,但在转染后18 d内的各个时间点,均检测到HCV负链RNA,表明嵌合体和野生型HC-J4在转染细胞内呈低水平复制。转染后第9天和12天,FQ-PCR检测表明,嵌合体转染细胞内HCV RNA水平明显高于野生型转染的细胞（P〈0.05）。不同时间点转染细胞上清感染naive Huh-7.5细胞后,IFA均未观察到表达HCV蛋白的阳性细胞。结论 JFH1 NS5A蛋白虽然在一定程度上可提高1b型HC-J4株在体外培养细胞中的复制能力,但还不足以产生能够检测到的感染性病毒颗粒。HCV 1b细胞模型的建立尚受其他因素的影响。

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立379-383

摘要：目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒（A/PR/8/34）全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT（pDF）中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法（IFA）和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。

中国生物制品学杂志消息

征稿383-383

摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和中国生物技术集团公司长春生物制品研究所主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。

中国生物制品学杂志基础研究

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D胞外区片段在哺乳动物细胞中的表达及其免疫活性384-388

摘要：目的在哺乳动物细胞中表达单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes simplex virus type-2,HSV-2）糖蛋白D（GlycoproteinD,gD）胞外区片段,并分析其免疫活性。方法化学合成HSV-2 G株gD蛋白胞外区片断的基因序列gDt,以pCEP4作为表达载体,构建N-末端带His标签的重组表达质粒pCEP4-gDt,转染至HEK293细胞进行表达。表达的蛋白采用镍离子柱亲和层析纯化,ELISA法检测目的蛋白的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA法检测效价。结果重组表达质粒经PCR、双酶切和DNA测序证实构建正确;表达产物经Western blot分析,在相对分子质量约46 000处可见目的蛋白条带;纯化的重组蛋白浓度约为45μg/ml,经ELISA检测证实具有良好的抗原性,免疫小鼠5周后,血清中特异性抗体效价达5×103。结论已在哺乳动物细胞中表达了HSV-2 gD胞外区片段,其具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV基因重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。

中国生物制品学杂志消息

来自ATCC的基因靶向工具388-388

摘要：ATCC三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4 MEF（ATCC誖SCRC-1045TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-1049TM）是一个克隆,来自于具有G418抗性和鼠类LIF高表达的STO细胞系。SNLP 76/7-4（SCRC-1050TM）是一株带有嘌呤霉素抗性的克隆,来自于SNL 76/7。要了解更多信息,请访问www.atcc.org/MEF6。

中国生物制品学杂志基础研究

重组融合蛋白BoNT-LH（N）-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性389-393

摘要：目的利用毕赤酵母表达系统表达BoNT-LH（N）-Elafin融合蛋白,并检测其生物学活性。方法构建pPIC9K-BoNT-LH（N）-Elafin重组真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达,取上清,经阳离子交换层析纯化融合蛋白,并检测其反应原性、抗弹性蛋白酶活性及对SNARE蛋白复合体的裂解作用。结果重组表达质粒pPIC9K-BoNT-LH（N）-Elafin经双酶切及测序证实构建正确;表达的BoNT-LH（N）-Elafin融合蛋白相对分子质量约为110 000,纯化的融合蛋白纯度达92%,浓度为54 mg/L,反应原性良好,具有抗弹性蛋白酶活性及裂解SNARE蛋白复合体的作用。结论已在毕赤酵母GS115中成功表达了重组融合蛋白BoNT-LH（N）-Elafin,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究其抑制气道黏液高分泌的机制奠定了基础。

硫酸乙酰肝素与氢氧化锌联合佐剂对HBsAg诱导小鼠免疫应答的影响394-397

摘要：目的探讨硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）与氢氧化锌联合佐剂对HBsAg诱导的小鼠体液免疫和细胞免疫应答的影响。方法将HS与氢氧化锌按不同剂量组合,与HBsAg（2μg）混合,免疫ICR小鼠,并设阴性对照、抗原对照、铝佐剂对照、单一HS及单一氢氧化锌对照组,共23组。分别于末次免疫后4、8、12、16、20、24周采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAg抗体水平;选择体液免疫效果最佳的组免疫BALB/c小鼠,于免疫后8周,采用乳酸脱氢酶法检测细胞杀伤活性。结果阴性对照组在各时间点均未检测到IgG抗体,其余各组的抗体滴度均在末次免疫后第8周达峰值,随着时间的延长,抗体水平呈下降趋势。其中第23组（100μg HS＋1.0 mg氢氧化锌,免疫2针）抗体水平最高,且持续时间较长,末次免疫后8周,其对HBsAg的体液免疫增强效应显著优于铝佐剂和HS单一佐剂（P〈0.05）,优于氢氧化锌单一佐剂,但差异无统计学意义（P〉0.05）。联合佐剂能诱导产生特异性的CTL细胞免疫效应。结论 HS和氢氧化锌联合佐剂既能有效增强HBsAg诱导的小鼠特异性体液免疫应答,又能显著诱导CTL细胞免疫应答。

RNA干扰P115基因对胃癌细胞巨噬细胞移动抑制因子表达的抑制作用404-409

摘要：目的构建高尔基体转运蛋白P115基因shRNA表达载体,探讨P115基因沉默对胃癌细胞株BGC-823中巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）表达的影响。方法设计4对针对P115基因的shRNA序列,构建重组表达质粒,转染高表达P115的胃癌细胞株BGC-823。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测P115及MIF的mRNA和蛋白的表达。结果 4个P115基因shRNA质粒经单酶切和测序证实构建正确;转染BGC-823细胞后,均能抑制P115基因的表达,其中以pGPU6/GFP/Neo-shP115-2的沉默效果最好,其对P115基因mRNA表达的抑制率为75.07%,对P115蛋白表达的抑制率为70.97%;转染pGPU6/GFP/Neo-shP115-2后,MIF基因的mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P〈0.05）。结论 P115基因沉默后,BGC-823细胞MIF的表达明显降低,提示P115可能参与调节胃癌细胞MIF的表达,P115基因可作为研究胃癌发生发展分子机理的新靶点。

中国生物制品学杂志消息

第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会征文通知409-409

摘要：为促进我国免疫诊断与疫苗技术的发展,加强有关学科的经验交流和沟通,中华医学会微生物学与免疫学分会和中国医药生物技术协会生物诊断技术分会决定于2011年7月中旬在银川召开＂第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会＂。

中国生物制品学杂志基础研究

PPE68/Ipr1真核共表达质粒的构建及鉴定410-413

摘要：目的构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠胞内病原体抗性基因1（Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1）的真核共表达质粒,并在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆至含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1,转染RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western blot法检测PPE68和Ipr1基因的转录和表达。结果重组表达质粒pBud68-Ipr1经PCR、双酶切及测序证实,插入的PPE68和Ipr1基因片段序列正确;质粒转染RAW264.7细胞后,PPE68和Ipr1基因进行了转录和表达,基因编码产物相对分子质量分别为37 000和50 000。结论已成功构建了真核共表达质粒pBud68-Ipr1,并在RAW264.7细胞中获得表达,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础。

b型流感嗜血杆菌D蛋白的原核表达及纯化418-420

摘要：目的克隆b型流感嗜血杆菌（Haemophlilus influenza type b,Hib）D蛋白（hpd）基因,原核表达并纯化重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定基础。方法从Hib CMCC株基因组DNA中PCR扩增hpd基因片段,克隆入载体pET-30a（＋）,构建重组原核表达质粒pET-30a-hpd,转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6 mol/L尿素变性、DEAE阴离子交换柱纯化、透析复性后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组表达质粒pET-30a-hpd经PCR及测序证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;经一步过柱纯化可得到纯度达95%左右的重组蛋白;纯化的重组蛋白可与Hib免疫小鼠制备的抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了Hib hpd基因,并在大肠杆菌中表达了重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定了基础。

YKL-40转染对前列腺癌LNcap细胞增殖及侵袭活性的影响426-430

摘要：目的探讨外源性YKL-40基因转染对前列腺癌LNcap细胞增殖、侵袭、迁移及黏附活性的影响。方法 RT-PCR法检测前列腺癌细胞LNcap、PC-3、DU-145 YKL-40基因内源性表达情况;用pcDNA3.1-YKL-40质粒转染LNcap细胞,分别经MTT法、Boyden小室法及黏附试验检测转染前后细胞增殖、侵袭、迁移及黏附活性,并进行体外药敏试验。结果仅DU-145细胞可内源性表达YKL-40基因;pcDNA3.1-YKL-40转染的LNcap细胞在第2～5天的A490值均显著高于对照组（P〈0.05）,其侵袭（75.11±4.40）和迁移穿膜细胞数（133.00±5.07）及黏附率（107.57%）均显著高于对照组（P〈0.05）,对5-FU、顺铂和依托泊苷的IC50值分别为（31.15±0.43）、（4.15±0.13）和（55.22±0.57）μmol/L,均显著高于对照组（P〈0.05）。结论 YKL-40基因能促进LNcap细胞增殖,提高细胞侵袭、迁移及黏附活性,并使其对5-FU、顺铂和依托泊苷具有一定的耐药性。

大鼠活化STAT蛋白抑制剂1基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定431-434

摘要：目的构建大鼠活化STAT蛋白抑制剂1（Protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1）基因重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法应用RT-PCR法从大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞株中扩增全长PIAS1基因,经T-A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pDC316中,利用同源重组将腺病毒骨架质粒Nad5/F35和穿梭质粒pDC316-PIAS1共转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1,经包装和扩增后,获得重组腺病毒。RT-PCR检测PIAS1基因的表达;荧光显微镜观察病毒感染情况;Western blot检测PIAS1蛋白的表达;并计算重组腺病毒的滴度。结果从AR42J细胞中扩增出1 956 bp的PIAS1基因片段,重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1经双酶切鉴定证明构建正确。RT-PCR及Western blot分析显示,PIAS1基因和蛋白已在293细胞中表达;荧光显微镜观察显示,重组腺病毒的感染率达90%;病毒滴度为4.45×1010 PFU/ml。结论已成功构建了大鼠PIAS1基因重组腺病毒质粒,为进一步研究PIAS1基因在相关疾病中的作用及其临床应用奠定了基础。

IL-27p28基因多态性与中国朝鲜族人群哮喘的相关性435-438

摘要：目的探讨IL-27p28基因启动子区g.-964 T〉C、第2外显子区g.2905T〉G和第4外显子区g.4730T〉C 3个位点的多态性与中国朝鲜族人群哮喘的相关性。方法选取32例中国朝鲜族哮喘患者（病例组）和93名中国朝鲜族正常人（对照组）作为观察对象,采用PCR法扩增IL-27p28基因g.-964 T〉C、g.2905T〉G和g.4730T〉C位点基因片段,单碱基延伸法进行基因分型,分析病例组和对照组的基因型频率及等位基因频率。结果病例组和对照组的基因型分布均符合Hardy-weinberg平衡定律（P〉0.05）。g.-964位点的基因型频率及等位基因频率在病例组和对照组之间的分布差异有统计学意义（P〈0.001）;g.2905和g.4730位点的基因频率及等位基因频率在病例组和对照组之间的分布差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 IL-27p28基因多态位点g.-964 T〉C可能与朝鲜族人群哮喘易感性相关,g.2905T〉G和g.4730T〉C多态性与朝鲜族人群哮喘未发现有相关性。

毕赤酵母X-33糖基化突变菌株的生理特性439-442

摘要：目的研究毕赤酵母X-33野生型菌株（wX-33）和X-33α-1,6甘露糖基转移酶（Och1p）突变株（och1 mX-33）的生理特性,为och1mX-33株进一步糖基化的研究奠定基础。方法绘制wX-33和och1 mX-33菌株的生长曲线,进行温度敏感性及刚果红敏感性试验,美蓝染色观察其形态变化,并检测细胞的存活率。结果与wX-33株比较,och1 mX-33株生长缓慢,生物量减少;对温度、刚果红敏感性增强;存在细胞壁分裂缺陷;在不适温度下,细胞存活率降低。结论糖基化突变可影响毕赤酵母X-33对温度、刚果红的敏感性,使其细胞壁层甘露糖含量降低,并可使och1 mX-33株的生理特性发生很大变化。

中国生物制品学杂志临床观察

一犬咬伤15人接种狂犬病疫苗的效果观察442-442

摘要：2009年10月,北京市昌平区某镇发生一起1只藏獒咬伤多人事件,共有17人致伤,其中15人于全程接种狂犬病疫苗后采集静脉血,检测抗狂犬病病毒中和抗体,现将结果报道如下。

中国生物制品学杂志基础研究

PLCε调节肾细胞癌血管生成的作用机制443-448

摘要：目的探讨血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在PLCε-NF-κB信号通路中影响肿瘤血管生成的作用机制。方法将PLCε-shRNA表达质粒pGenesil-PLCε转染人肾透明细胞癌786-0细胞株,沉默磷脂酶Cε（Phos-pholipase C epsilon,PLCε）基因的表达,采用RT-PCR及Western blot检测转染细胞中PLCε、NF-κB和VEGF基因mRNA及蛋白水平表达的变化;应用NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082处理细胞后,采用MTT法检测BAY11-7082对786-0细胞增殖的抑制作用,RT-PCR和Westernblot检测VEGF基因mRNA和蛋白水平表达的变化。结果重组质粒pGenesil-PLCε可明显抑制PLCε基因mRNA和蛋白水平的表达,抑制率分别为71.43%和50.01%,并明显下调NF-κB和VEGF基因mRNA和蛋白水平的表达;BAY11-7082可明显抑制786-0细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性;应用BAY11-7082后,VEGF基因mRNA和蛋白的表达均被明显抑制。结论 PLCε可能通过抑制NF-κB基因的表达,从而抑制NF-κB依赖性基因VEGF的表达,进而影响肾细胞癌血管生成。

中国生物制品学杂志治疗制品

可溶性白细胞介素-5与白细胞介素-13受体联合应用对哮喘小鼠气道高反应性及气道炎症的影响452-455

摘要：目的观察可溶性白细胞介素-5受体α（Soluble interleukin 5 receptorα,sIL-5Rα）与可溶性白细胞介素-13受体α2（sIL-13Rα2）联合应用对哮喘小鼠气道高反应性（Airway hyperresponsiveness,AHR）及气道炎症的影响。方法将40只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘组、sIL-5Rα组、sIL-13Rα2组和sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组,除正常对照组外,其余各组以鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）致敏和激发,建立哮喘模型,sIL-5Rα、sIL-13Rα2和sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组每次激发前30 min分别经腹腔注射sIL-5Rα100μg、sIL-13Rα2 100μg和sIL-5Rα100μg＋sIL-13Rα2 100μg,正常对照组及哮喘组则用生理盐水替代。末次激发24 h后,检测各组小鼠经不同浓度氯化乙酰胆碱激发后的肺阻力,对支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavagefluid,BALF）进行细胞计数,HE染色观察肺组织的病理变化,ELISA法检测BALF中IL-5和IL-13水平。结果与正常对照组相比,经氯化乙酰胆碱激发后,哮喘组肺阻力显著增加（P〈0.01）;与哮喘组相比,sIL-13Rα2和sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组肺阻力显著降低（P均〈0.01）,sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组降低更明显（P〈0.01）。与正常对照组相比,哮喘组BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞（Eosinophil,EOS）数均显著增加（P均〈0.01）,肺组织损害明显;与哮喘组相比,3个治疗组BALF中白细胞总数和EOS数均显著降低（P均〈0.01）;与sIL-5Rα和sIL-13Rα2组相比,sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组BALF中白细胞总数和EOS数进一步降低（P均〈0.01）;3个治疗组炎症细胞浸润明显减轻,炎症反应轻微,其中sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组病理变化进一步减轻。与正常对照组比较,哮喘组小鼠BALF中IL-5和IL-13水平显著升高（P〈0.01）;与哮喘组相比,sIL-5Rα＋sIL-13Rα2组小鼠IL-5和IL-13水平均显著降低（P〈0.01）。结论 sIL-5Rα与sIL-13Rα2联合应用可明显降低哮喘小鼠AHR,减轻气道炎症。