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中国生物制品学 2010年第04期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

狂犬病病毒糖蛋白基因重组逆转录病毒的构建及其免疫效果337-340

摘要：目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白（GP）基因的重组逆转录病毒,并检测其对小鼠的免疫效果。方法酶切含狂犬病病毒SRV9株GP基因的质粒pVAX-G,将其克隆至逆转录病毒载体,构建重组质粒pLNCX-G,以脂质体介导转染包装细胞系PA317,筛选阳性细胞克隆并扩大培养。将病毒颗粒感染BHK细胞,采用PCR和RT-PCR法检测GP基因在细胞中的整合及转录,在NIH3T3细胞上测定病毒滴度。以重组逆转录病毒免疫昆明小鼠,通过荧光抗体病毒中和试验（FAVN）法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价。结果所构建的重组质粒pLNCX-G经酶切鉴定正确;狂犬病病毒GP基因已整合至BHK细胞基因组中并能正常转录;病毒滴度最高可达1.2×104CFU/ml;肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%,有效保护率分别为0和76.9%。结论已成功构建了狂犬病病毒SRV9株GP基因的重组逆转录病毒,并可诱导小鼠产生一定的中和抗体,为进一步研究奠定了基础。

肠道病毒71型P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒的构建及表达341-345

摘要：目的构建肠道病毒71型（EV71）P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,并检测3CD蛋白酶的切割作用和表达产物的抗原性。方法采用RT-PCR法从阜阳分离的EV71中扩增P1和3CD基因,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD、pShuttle-CMV-P1和pShuttle-CMV-3CD;经同源重组获得重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD,分别转染293细胞,RT-PCR法检测目的基因的转录,免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果3种重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明构建正确;RT-PCR检测表明,3个重组腺病毒均已转录目的基因mRNA;免疫荧光检测仅观察到rAd-P1-3CD表达产物具有特异性,而rAd-P1、rAd-3CD未能检测到特异性表达产物。结论已成功构建EV71P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1产物只有在被3CD蛋白酶切割后才体现抗原性。

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响346-349

摘要：目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶（PDI）对干扰素β与人血清白蛋白（IFNβ-HSA）融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白（IFNβ-HSA）基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达（22.49±3.52）mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。

表达鸡新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因的重组腺病毒对肝癌细胞HepG-2的抑制作用350-353

摘要：目的探讨表达鸡新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组腺病毒Ad-HN对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法应用Ad-HN感染HepG-2细胞,采用MTT法检测Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制作用;AnnexinV染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;AO/EB染色法和DAPI染色法对Ad-HN感染的肿瘤细胞及细胞核进行形态学观察;底物显色法检测Caspase1、Caspase3、Caspase6和Caspase8活性的变化。结果Ad-HN能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,当感染剂量为100MOI,作用时间为48h时,Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制率达峰值（17.20%～35.04%）;AnnexinV染色结果显示,Ad-HN感染48h后HepG-2细胞凋亡率为29.39%;Ad-HN感染导致HepG-2细胞呈现细胞浓缩、细胞核皱缩进而碎裂等凋亡特征;Ad-HN感染可显著上调HepG-2细胞的Caspase酶活性。结论Ad-HN能够诱导HepG-2细胞凋亡,并对HepG-2细胞产生抑制效应。

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化354-357

摘要：目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病（CML）Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a（＋）原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2（lDE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。

还原型谷胱甘肽对糖尿病心肌病大鼠心肌线粒体功能的影响358-360

摘要：目的观察还原型谷胱甘肽（GSH）对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病心肌病（DCM）大鼠心肌线粒体功能的影响。方法将SD大鼠随机分为正常对照组（C组）和糖尿病组,糖尿病组腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型。将建模成功的大鼠随机分为糖尿病心肌病模型组（DCM组）和GSH干预组（DCM＋GSH组）,DCM＋GSH组腹腔注射GSH,C组和DCM组腹腔注射生理盐水。8周后,检测各组大鼠血清及心肌组织匀浆中的抗氧化指标、Ca2＋诱导的线粒体肿胀度的变化及心肌线粒体的膜电位。结果DCM＋GSH组大鼠心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶活性较DCM组显著升高,血清中SOD活性较DCM组有升高趋势,但差异无统计学意义;DCM＋GSH组大鼠血清中丙二醛（MDA）含量较DCM组显著下降,心肌组织匀浆中MDA含量较DCM组有下降趋势,但差异无统计学意义;DCM＋GSH组大鼠心肌线粒体对高钙诱导的肿胀的敏感性较DCM组有所恢复,但仍未恢复到正常水平;DCM＋GSH组大鼠心肌线粒体膜电位较DCM组显著上升。结论GSH对STZ诱导的DCM大鼠的心脏有一定的保护作用,其可能的机制为增强心肌抗氧化能力及改善心肌组织中线粒体的功能。

MMP-2反义寡核苷酸对人胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响361-364

摘要：目的研究基质金属蛋白酶-2（MMP-2）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌SGC7901细胞增殖及侵袭能力的影响。方法将不同浓度的硫代磷酸化修饰的MMP-2ASODN转染入人中低分化胃腺癌SGC7901细胞株,RT-PCR法检测细胞MMP-2基因mRNA的转录水平;Transwell试验检测细胞体外迁移和侵袭能力变化;MTT法检测细胞的增殖活性。结果转染MMP-2ASODN后,SGC7901细胞中MMP-2基因mRNA的转录水平显著降低,细胞的体外迁移和侵袭能力受到抑制,且抑制作用随ASODN浓度的增加而增强;而细胞的增殖活性无明显变化。结论MMP-2ASODN可抑制胃腺癌SGC7901细胞MMP-2基因mRNA的转录水平及细胞的体外迁移和侵袭能力,但与胃癌细胞的增殖活性无明显相关性。

猪干扰素α基因的克隆与真核表达369-372

摘要：目的克隆猪干扰素α（IFNα）基因,并在毕赤酵母中进行表达。方法用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中。筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础。

中国生物制品学杂志预防制品

冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗373-377

摘要：目的采用冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗。方法将正交试验筛选的不同冻干保护剂与1型糖尿病噬菌体展示疫苗混合,优化冻干曲线进行冻干。检测冻干前后噬菌体疫苗的滴度,并通过各项指标对冻干后的疫苗进行评价。结果经筛选,最佳保护剂配方为：10.85%海藻糖＋17.37%甘氨酸（w/v）;最佳冻干曲线为：S1：-40℃4h,1.5℃/min;S2：-15℃5h,1.5℃/min;S3：25℃4h,1.5℃/min;真空度：0.02mbar。冻干后疫苗滴度下降不超过0.5pfu/ml,外观及电镜观察疫苗样品形态均较好,玻璃态转化温度能达到220℃以上,含水量小于3%。结论以海藻糖、甘氨酸为保护剂,采用冷冻干燥法制备的1型糖尿病噬菌体展示疫苗具有保护剂组成成分少、热稳定性强、含水量低、冻干曲线简化、保存时间长等特点。

中国生物制品学杂志消息

2010全国临床微生物与感染免疫学术研讨会征文通知377-377

摘要：为了交流微生物学与免疫学领域国内外最新研究进展,推动我国相关学科建设不断取得新的发展和成就,中华医学会微生物学与免疫学分会拟于2010年7月在上海召开“2010全国临床微生物与感染免疫学术研讨会”。届时将邀请知名专家作专题报告，同时欢迎从事相关科研、教学、医疗、疾病预防与控制、检验检疫、生物技术研发等工作的专家学者积极投稿，参会交流。本次会议被批准授予部级继续教育5学分。现将征文有关事宜通知如下：

中国生物制品学杂志预防制品

猪瘟疫苗免疫反应低下猪CD3^＋CD4^＋和CD4^＋CD25^＋淋巴细胞亚群分析378-381

摘要：目的分析猪瘟疫苗免疫反应低下猪CD3＋CD4＋和CD4＋CD25＋淋巴细胞亚群的分布。方法将接种过猪瘟疫苗的种母猪经ELISA和血清中和试验检测筛选出猪瘟病毒（CSFV）抗体阴性猪。从中挑选出15头作为研究对象,以15头抗体阳性猪作为对照。采集猪的抗凝血,分离外周血淋巴细胞（PBL）,流式细胞术检测30头猪PBL中CD3＋CD4＋和CD4＋CD25＋淋巴细胞亚群的分布。结果CSFV抗体阴性猪PBL中CD3＋CD4＋细胞的比例（24.09%±1.29%）明显低于CSFV抗体阳性猪（37.49%±1.60%）;CSFV抗体阴性猪PBL中CD4＋CD25＋细胞的比例（2.34%±0.20%）明显高于CSFV抗体阳性猪（1.64%±0.13%）。结论PBL中CD3＋CD4＋淋巴细胞亚群的减少及CD4＋CD25＋淋巴细胞亚群的增加,可能是导致猪瘟疫苗免疫反应低下的重要原因。

中国生物制品学杂志实验技术

鲤鱼上皮瘤细胞和草鱼性腺细胞冻存效果的比较381-381

摘要：鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）及草鱼性腺细胞（CO）可用于鱼类疱疹病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒等常见鱼类病毒的分离培养。探讨EPC及CO细胞的适宜冻存条件,

中国生物制品学杂志预防制品

猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备及免疫试验382-384

摘要：目的利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）安徽分离株制备油乳剂灭活疫苗,并进行免疫试验。方法PRRSV经Marc-145细胞传代增殖,制备油乳剂灭活疫苗;物理性状、无菌试验及安全性试验合格后,经肌肉注射免疫健康仔猪,并进行攻毒;分别检测免疫仔猪的血清抗体水平及保护力,并进行免疫程序及与市售疫苗的免疫效果的比较试验。结果制备的灭活疫苗的适宜免疫剂量为2ml/头,免疫后14d血清抗体水平可达高峰;使用同一病毒攻毒,保护率为80%（4/5）。采用灭活疫苗2次免疫及灭活疫苗与弱毒疫苗交替2次免疫,免疫效果均较好。制备的灭活疫苗免疫效果与1号市售灭活疫苗相比,差异无统计学意义,且优于2号市售灭活疫苗。结论已成功制备了PRRSV安徽分离株油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全可靠,免疫效果好,适于推广使用。

HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法的初步建立385-388

摘要：目的初步建立HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法,并对HIV疫苗进行免疫原性评价。方法选择一种HIVDNA疫苗（D）、2种重组痘苗载体HIV疫苗（M和R）,分别免疫BALB/c小鼠,6周后分离血清和脾淋巴细胞,采用ELISOPT和胞内因子染色法检测细胞因子分泌情况,MTS法检测淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测血清中抗-HIVIgG和IgA抗体水平。结果D、M和R疫苗均可诱导小鼠产生广泛的免疫应答,ELISPOT法可检出脾细胞分泌IFNγ、IL-2、IL-4和IL-6;胞内因子染色可检出IFNγ、IL-2和IL-4的分泌;D和M组脾淋巴细胞增殖试验阳性数高于R组;D、M和R组血清抗-HIVIgG抗体分别有0/5、1/5和5/5小鼠阳转,各组均未检出血清抗-HIVIgA。结论已初步建立了HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法。

注射用母牛分枝杆菌对结核菌感染小鼠细胞免疫功能的影响389-393

摘要：目的观察注射用母牛分枝杆菌（微卡）对结核菌感染小鼠细胞免疫功能的影响,并探讨其作用机制。方法C57小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37RV,建立结核菌感染小鼠模型。将模型小鼠随机分为模型组、微卡高、中、低3个剂量组和异烟肼组,同时设正常对照组。感染8周后处死小鼠,取肺、脾、肝,计算重量指数和病变总指数,测定肺脏活菌数量,并观察主要脏器的病理变化;流式细胞术测定小鼠脾脏中CD3＋T、CD4＋T、NK1.1＋T、NK、γδT细胞的比例以及CD4＋T细胞胞内IFNγ和IL-4的表达。结果微卡各剂量组能明显减轻感染小鼠的发病状况,其中微卡中剂量组的各脏器病变总指数、脾脏和肺脏重量指数、肺脏结核菌活菌数均显著低于模型组;微卡各剂量组小鼠的肺部病变主要以增殖性结节为主,而模型组则以坏死性结节和增殖性结节为主;微卡各剂量组小鼠的CD3＋T、CD4＋T细胞比例均明显升高,CD4＋IFNγ＋辅助性T细胞比例与模型组比较,差异无统计学意义;微卡低、中剂量组CD4＋IL-4＋辅助性T细胞比例明显降低,同时能显著提高小鼠天然免疫系统γδT和NK细胞的比例。结论微卡可提高结核菌感染小鼠天然和获得性细胞免疫水平,对结核菌感染小鼠具有较好的免疫干预作用。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗纯化工艺的建立394-395

摘要：目的建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）纯化工艺。方法采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63lgCCID50/ml,DNA残留量均〈100pg/ml。除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降。结论已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV。

中国生物制品学杂志治疗制品

聚乙二醇化促红细胞生成素在猕猴体内的药代动力学分析396-398

摘要：目的分析聚乙二醇（相对分子质量40000）化促红细胞生成素（PEG-EPO）在猕猴体内的药代动力学特征。方法建立检测PEG-EPO的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证。用1、3和9mg/kg3个剂量的PEG-EPO经静脉注射猕猴,给药后各时间点检测猕猴体内的血药浓度,用DAS软件获取各剂量组药代动力学参数。结果PEG-EPO在猕猴体内的代谢过程符合二室开放模型,1、3和9mg/kg3个剂量的PEG-EPO的消除半衰期（t1/2β）分别为（51.89300±5.39558）、（42.48550±3.01606）和（56.46130±6.81932）h;AUC0～144分别为（109.32±9.82）、（236.23±36.16）和（722.55±84.31）mg/L·h。结论相对分子质量为40000的PEG修饰的EPO能显著延长其在猕猴体内的半衰期。

绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38质控方法和质量标准的建立399-402

摘要：目的建立人性腺激素释放激素类似物—绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38的质控方法和质量标准。方法采用HeLa细胞/结晶紫比色法测定GP38蛋白的生物学活性,并进行精密性和回收率验证;反相高效液相色潽法（RP-HPLC）测定其纯度,用自编CPM软件进行肽图比较分析;其他检测项目按《中国药典》三部（2005版）规定进行。结果GP38蛋白生物学活性测定方法经验证,原液试验内变异系数（CV）为10%,试验间CV值为20%;成品试验内CV值为12%,试验间CV值为21%。用该法对GP38蛋白原液和成品进行检测,其生物学活性分别为（3736±483）和（1777±260）U/ml。原液经RP-HPLC分析,纯度为（97.1±0.2）%,符合其质量标准大于95.0%的规定。用自编CPM软件分析肽图结果显示,相同酶切条件重复检测的相似度大于0.99,不相同次酶切、相同条件重复检测的相似度大于0.90。其他各项检测结果均符合《中国药典》三部（2005版）的相关要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于GP38蛋白产品的常规检定。