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中国生物制品学 2009年第05期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化425-430

摘要：目的克隆碱性纤维素酶基因，构建酵母整合型表达质粒，在巴氏毕赤酵母中表达，并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因，克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中，构建重组表达质粒pGAPZαA—ATCC21833，并转化至巴氏毕赤酵母GSll5。通过单因素实验及正交实验，确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵，观察碳源对批式发酵的影响，并检测在4种流加方式（连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加）下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA—ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确，其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6％葡萄糖、2％硫酸铵、12g／L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS—PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重（29．8g／L）及酶活力（24U／m1）。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌，并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。

RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响431-437

摘要：目的构建核糖核酸酶抑制因子（RI）基因siRNA干扰质粒，并检测其对人膀胱癌细胞BIU．87迁移和侵袭能力的影响。方法设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体，经酶切和DNA测序鉴定后，转染BIU-87细胞，通过RT—PCR、Westernblot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性。光镜及HE染色观察细胞形态的改变，黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构。结果酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确；转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低，对照组未发生明显改变；转染干扰质粒的细胞堆叠严重，细胞黏附能力显著降低，迁移和侵袭能力显著提高，细胞骨架微丝聚集，伸展出片状伪足。结论已成功构建RI基因siRNA干扰质粒，其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力，说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点。

人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达438-442

摘要：目的对人内皮抑素（hES）基因进行定点突变，提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量。方法根据Intemet网站提供的关于hES的结构信息及其结构与功能方面的研究文献，设计突变位点；利用生物信息学的相关网站，对hES突变体进行结构预测，验证突变位点设计的合理性；采用重叠延伸PCR方法进行hES基因的定点突变，并将突变基因和未突变基因分剐亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，在大肠杆菌中进行融合表达，比较突变前后目的蛋白的可溶性表达量。结果三级结构预测结果表明突变位点设计合理，序列分析结果表明实现了hES基因的定点突变。突变基因的表达产物中，可溶性部分约占总表达量的40％，而未突变基因的表达产物几乎全部为包涵体。结论已成功对hES基因进行了定点突变，突变后的hES可溶性表达量得到了提高。

人Makorin环指蛋白1基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定443-447

摘要：目的构建人Makorin环指蛋白1（MKRNl）基因shRNA真核表达质粒，并检测其对HEK293细胞MKRNl基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRNl基因的小干扰片段，定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中，对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析，并用脂质体将其转染到HEK293细胞中，观察其对细胞MKRNl基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果经酶切鉴定和序列分析证明，3个人MKRNl基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确，转染HEK293细胞后，3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52．4％、26．2％和42．9％，在蛋白水平对细胞MKRNl基因的抑制率分别为69．1％、27．9％和50．O％。结论已成功构建了人MKRNl基因的shRNA真核表达质粒，为进一步研究MKRNl基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础。

中国生物制品学杂志消息

第十次全国生物制品学术研讨会第一轮通知（征文通知）447-447

摘要：为了促进我国生物制品事业的发展，为本专业研究人员提供交流与合作机会，根据中华预防医学会生物制品分会五届一次常委扩大会议决定，将于2009年8月在兰州召开第十次全国生物制品学术研讨会。会议由中华预防医学会生物制品分会、中国微生物学会生物制品专业委员会、中国医药生物技术协会基因工程药物多肽药物和疫苗专业委员会主办，兰州生物制品研究所承办。大会将邀请国内外著名专家作有关专题进展报告，同时面向从事医学生物制品学及相关专业的工作者征集论文。希望有关领域的工作人员踊跃投稿，积极参会交流。

中国生物制品学杂志基础研究

多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白的原核表达及其生物活性448-451

摘要：目的原核表达多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白，并检测其生物活性。方法应用PCR法扩增Arg9-VP3序列，与载体pET-43．1a连接后，转化EcoliBL21（DE3），IPTG诱导表达。表达产物经Ni^2＋-NTA纯化后，进行肠激酶裂解、超滤浓缩，并检测其生物活性。结果重组表达质粒pET43．1a-Arg9-VP3经酶切鉴定和序列分析，证明构建正确。转化EcoliBL21（DE3）后，重组蛋白获得可溶性表达。纯化的融合蛋白纯度达90％以上，可抑制HeLa细胞增殖。结论已成功地在大肠杆菌中表达了多聚精氨酸蛋白转导域一凋亡素融合蛋白，纯化的融合蛋白具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。

绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白的原核表达及纯化452-456

摘要：目的原核表达并纯化绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白，为进一步研究其生物学活性及其应用奠定基础。方法以绿色微囊藻MicrocystisviridisNIES一103基因组DNA为模板，PCR扩增MVL基因阅读框序列，并克隆至pET-30b（＋）载体中，构建重组表达质粒pET-30b-MVL，经PCR、测序鉴定后，转化感受态E.coli BL21（DE3），IPTG诱导表达。表达的蛋白采用Ni—NTA亲和柱层析纯化及复性。结果重组表达质粒pET-30b—MVL序列完整，插入的基因片段全长345bp，与GenBank中公布的MVL基因序列一致。重组菌的最佳诱导表达条件为：诱导起始浓度A600=0．5左右，IPTG浓度0．5mmol／L，诱导温度37℃，诱导时间4h，诱导培养基采用LB。以此条件诱导，在相对分子质量约20000处可见目的蛋白表达条带，表达量可占菌体总蛋白的47％，且表达蛋白主要以可溶性形式存在。纯化的重组蛋白纯度达95％以上，质谱鉴定为甘露糖结合凝集素。结论已成功地原核表达并纯化了绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白。

硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组VacA卵黄抗体的保护作用457-460

摘要：目的观察硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组细胞空泡毒素抗原（VacA）卵黄抗体（IgY）的保护作用，为制备能耐受胃酸和蛋白酶的IgY制剂奠定基础。方法诱导重组菌DH5ct—vacA—pQE30，大量表达并纯化VacA重组蛋白，免疫洛曼母鸡，制备VacAIgY，并进行纯化。在不同pH值的IgY液中加入不同浓度的硫糖铝和不同浓度的胃蛋白酶，将含不同浓度硫糖铝的IgY反复冻融7次，将含30％硫糖铝的IgY室温放置ld~4周，ELISA法测定各实验组IgY的相对抗体活性（AT／A。）。结果在pH1．5、2．0和3．0的条件下，含30％～60％硫糖铝的IgY的相对抗体活性高于不加硫糖铝的IgV；在pH1．5条件下，60％硫糖铝可使IgY的相对抗体活性保持68．7％；在pH2．0和3．0条件下，50％和40％以上的硫糖铝几乎可完全保持IgY的相对抗体活性。在pH值为2．0和3．0时，正常胃蛋白酶浓度（0．02mg／m1）下，30％以上的硫糖铝均可有效保护IgY的相对抗体活性。30％以上的硫糖铝可增强IgY的抗冻融能力。室温放置4周后，含30％硫糖铝的IgY仍能保持80％以上的相对抗体活性。结论30％以上的硫糖铝可增强VacAIgY对低pH和胃蛋白酶的耐受能力及抗冻融能力，是较理想的IgY保护剂。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定461-463

摘要：目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（ItB）基因，构建其原核表达质粒，并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ItB基因，克隆入载体pET-32a（＋）中，构建原核表达质粒pET-32a（＋）-ItB，转化EcoliBL21（DE3），IPTG诱导表达，NiZ＋-NTA树脂层析柱进行纯化，纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GMl的结合涪I生。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确，所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99．9％。重组菌诱导4h，目的蛋白表达量最高，约占菌体总蛋白的25％。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96％，具有与牛GMl特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ItB基因，并构建了其原核表达质粒，表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达464-467

摘要：目的构建胞内病原体抗性基因1（Ipr1）和绿色荧光蛋白（GFP）基因真核共表达穿梭质粒，并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法，分别从质粒pEGFP，C1-Ipr1和pEGFP—C1中扩增Ipr1和GFP基因，将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆人多启动子真核共表达载体pBudCE4．1中，构建pBud—GFP—OfiM．Ipr1穿梭质粒，脂质体法转染A549细胞，荧光显微镜观察GFP的表达，免疫组化方法检测Iprl蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明，pBud．GFP—OriM．Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后，荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达，免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达，且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒，为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。

丙型肝炎病毒3种标志物的稳定性468-469

摘要：目的观察丙型肝炎病毒3种标志物的稳定性。方法用HCV-Ab、RT-PCR及HCV—Ag检测试剂分别检测血清样品中的HCV-Ab、HCV—RNA和HCV—Ag，比较3种标志物在不同温度、不同时间下保存及冻融后的稳定性。结果在2036份血清样品中，共检出HCV-Ab阳性样品85份、HCV—Ag阳性样品51份，HCV-RNA阳性样品12份；HCV—Ab4℃保存14d、-20℃保存3年及冻融5次稳定性良好，阳性率均为100％；HCV—RNA随保存时间的延长，阳性检出率逐步下降，-20℃保存3年后下降至33．33％，冻融后下降至83．33％；HCV—Ag-20℃保存3年后，阳性率下降至68．63％，4℃保存14d和冻融对其无影响。结论3种标志物中，HCV-Ab的稳定性最好，其次是HCV—Ag，HCV—RNA最不稳定。

小鼠载脂蛋白A-I的原核表达及抗血清的制备470-473

摘要：目的原核表达小鼠载脂蛋白A—I（ApoA—I），并制备抗血清。方法应用RT-PCR方法从小鼠肝脏中扩增ApoA—I基因，亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋），转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经N—NTA柱纯化后，免疫家兔，制备抗血清。结果扩增的ApoA—I基因经测序，表明与GenBank中报道的序列（NM009692）完全相同。重组表达质粒经酶切鉴定，证明构建正确。表达的ApoA—I融合蛋白相对分子质量约为32000，表达量占菌体总蛋白的17％。纯化的融合蛋白纯度达90．7％，可与抗His·Tag单抗发生特异性反应。制备的抗血清可识别ApoA—I融合蛋白，效价可达1：10^5。结论已在大肠杆菌中表达了小鼠ApoA—I，并制备了较高效价的抗血清。

中国生物制品学杂志预防制品

四价重组A群链球菌多肽疫苗基因序列的合成及克隆474-479

摘要：目的设计针对可引起风湿热的A群链球菌M1、3、6、18四个血清型的重组多肽疫苗，合成并克隆该重组多肽疫苗的核苷酸序列。方法从美国疾病预防和控制中心（CDC）数据库获得A群链球菌1、3、6、18四个血清型M蛋白型特异性序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法，筛选每一个血清型的特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，将其按1-3—6—18型的顺序串连，在串联序列的C-端加上一个四个血清型所共有的与人体组织蛋白无交叉表位、且具有一定免疫原性的保守序列J14。对设计的多肽疫苗的氨基酸序列进行与人体组织蛋白的BlastP比对、亲水性分析、二级结构分析、空间结构分析以及B细胞表位预测。采川DNAWORK2．0在线软件设计一组寡核苷酸引物，OverlapPCR方法合成该多肽疫苗的核苷酸序列，并在5′端和3′端分别引入BamHI和HindBI的酶切位点，将该序列双酶切后克隆至pUC18载体上，并测序。结果软件分析显示，设计的多肽疫苗与人体组织蛋白无同源性，有较好的亲水性，二级结构与空间结构均与天然M蛋白相似，在每一个血清型的区段都可能存在B细胞表位。成功扩增出了该多肽疫苗的DNA序列，并获得了一个与设计序列完全一致的重组克隆载体。结论已成功设计了一种四价重组A群链球菌多肽疫苗，为其重组表达和免疫原性的研究奠定了基础。

中国生物制品学杂志消息

2009年《生物工程冻干技术（北京）高峰论坛》第一轮通知（征文通知）479-479

摘要：为提高中国冻干生物制品质量，促进中国生物制品和国际冻干生物制品行业的交流，国际冻干协会将于2009年10月，在中国举办《生物工程冻干技术（北京）高峰论坛》。论坛由中国医学装备协会与中国生物技术集团公司主办，中国医学装备协会生物工程装备技术专业委员会承办。

中国生物制品学杂志预防制品

喷雾干燥法制备1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗480-482

摘要：目的制备1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗，并观察其热稳定性。方法采用水溶性壳聚糖、海藻糖、甘氨酸作为保护剂，通过喷雾干燥技术制备1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗，扫描电镜下观察其形态及粒径大小，并检测入口温度及海藻糖浓度对壳聚糖微球疫苗活性的影响。将喷雾干燥样品置37℃放置6d，检测其热稳定性。结果通过喷雾干燥法制备的1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗电镜下呈不规则的球形，粒径大小为20μm左右。喷雾干燥后样品的滴度与喷雾干燥前的疫苗原液相比均降低，且随着入口温度的升高而先升高后降低；喷雾干燥后的样品随着海藻糖浓度的增加，滴度也相应升高。与喷雾干燥前的疫苗原液相比，壳聚糖微球疫苗具有更好的热稳定性。结论已成功制备了1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗，其具有良好的热稳定性。

重组人干扰素γ联合弓形虫STAg鼻内免疫小鼠的免疫保护作用483-485

摘要：目的观察重组人干扰素γ（IFNγ）联合可溶性速殖子抗原（STAg）鼻内免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓形虫感染作用。方法将BALB／c小鼠随机分为STAg组、STAg＋IFM组和对照组，分别用20μgSTAg、20μgSTAg＋1000U IFNy和20μl PBS鼻内免疫2次，间隔14d。末次免疫后第10天，用RH株弓形虫速殖子灌胃攻击（4×104个／只），观察小鼠存活情况，并计算存活率，攻击后第43天处死全部小鼠，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子虫荷，分离并计数肠上皮淋巴细胞（iIELs）、派伊尔氏结（PP）和脾淋巴细胞，ELISA法检测小鼠粪便弓形虫特异性sIgA和血清IgG水平。结果IFNl联合STAg鼻内免疫能保护小鼠抵抗弓形虫攻击，小鼠存活率（93％）明显高于STAg组（60％）和对照组（47％）；小鼠ilELs（1．81×10^5）、PP（3．21×10^7）和脾（3．01×10^7）淋巴细胞均显著增生，明显高于STAg组和对照组；粪便中slgA水平（A492=0．435）显著高于对照组（A492=0．047），血清IgG水平（A492=0．233）显著高于STAg组（A492=0．193）和对照组（A492=0．115）；肝、脑组织内弓形虫速殖子虫荷显著减少，分别比对照组减少80．90％和64．50％。结论IFNy联合STAg鼻内免疫效果优于单独STAg免疫，IFNy能协同STAg有效诱导黏膜和系统免疫应答，提高弓形虫攻击小鼠的存活率，降低肝、脑组织内虫荷。

中国生物制品学杂志治疗制品

集成干扰素突变体的构建、表达及纯化486-489

摘要：目的构建高效且可供单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-MAL）定点修饰的集成干扰素突变体（1ivNm108），并进行表达、纯化及鉴定。方法采用同源序列对比、空间结构模拟并结合α干扰素与受体结合的特点设计突变位点。用重叠延伸PCR法，扩增IIFNm108基因，与pET-23b载体连接，构建重组表达质粒pET-23b-IIFNm108转化EcoliBL21（DE3），IPTG诱导表达，所得包涵体经变性、复性、DEAE阴离子交换及凝胶过滤两步层析纯化后，进行各项鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确。目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％以上，主要以包涵体形式存在。纯化的IIFNm108蛋白纯度大于95％，比活性约为（2．084-0．17）×10^8IU／mg，N-端、C-端氨基酸序列与理论一致，相对分子质量为19500，可与mPEG—MAL成功交联。结论已获得一种高效且可供mPEG-MAL定点修饰的集成干扰素突变体IIFNm108

中国生物制品学杂志诊断制品

卵清蛋白国家定量参考品的建立490-492

摘要：目的建立卵清蛋白国家定量参考品。方法用德国试剂盒测定不同厂家、不同级别卵清蛋白的含量，筛选与试剂盒标准卵清蛋白含量符合率最高的样品作为参考品原料，并对参考品保护剂进行验证。将参考品贮存母液系列稀释后，经3个实验室协作标定，确定其标示量。结果选取SigmaGⅡ作为参考品原料；参考品保护剂对卵清蛋白测定结果无影响，并可显著提高参考品的稳定性；经协作标定，确定浓度为15、10、5和2．5ng／ml系列参考品的标示量分别为（17．96±1．00）、（12．25±1．51）、（6．79±1．14）和（3．11±0．31）ng／ml。结论已建立了含量准确，重复性和线性较好的卵清蛋白国家定量参考品。