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中国生物制品学 2008年第12期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性1033-1038

摘要：目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157：H7（EHEC O157：H7）Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位（Stx2A1）的融合蛋白，并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因，利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因，T-A克隆后插入表达载体pET-28a（＋），构建原核表达质粒pET-28a（＋）．espA-stx2A1，转化大肠杆菌BL21（DE3），分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白，免疫小鼠，检测其免疫原性及抗血清的反应原性，并以天然Stx2毒素攻击，观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段，重组表达质粒构建正确；目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃，约占菌体总蛋白的40％。两种温度下，目的蛋白均主要以包涵体形式存在；纯化后蛋白纯度可达90％。Westernblot结果证实，融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157：H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击，保护率达95％。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白，纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果，为研制EHECO157：H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。

Th17及IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力发病过程的相关性1039-1042

摘要：目的探讨Th17及其相关因子IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）发病过程的相关性。方法建立EAMG大鼠模型及CFA对照组，分别于两发病时相（早期发病高峰和晚期发病高峰），采用ELISA法检测血清以及淋巴细胞培养上清中IL-17的含量；流式细胞仪检测CD4qL-17＋淋巴细胞含量；^3H增殖试验检测淋巴细胞的增殖能力；B-ELISPOT法检测B细胞的抗体分泌情况。结果与CFA组相比，EAMG组大鼠血清、淋巴细胞培养上清中IL-17的表达以及CD4＋IL-17＋巴细胞含量在早期发病时相差异均无统计学意义；而在晚期发病时相则均明显增多。与非刺激组相比，IL-17的刺激对CFA和EAMG组淋巴细胞的增殖能力及B细胞抗体分泌水平，在早期发病时相均无明显影响；而在晚期发病时相，EAMG组均明显升高。结论Th17及其相关因子IL-17参与大鼠EAMG的晚期发病时相，并促进疾病的发展。

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达1043-1046

摘要：目的构建人颗粒溶素（GLS）活性肽（9ku-GLS）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因的真核表达载体，并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因，插入质粒pBudCE4．1中，经酶切及测序鉴定正确后，亚克隆至质粒pEGFP-C1中，将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1／S9K转染B16细胞，采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP—C1／S9K经双酶切鉴定证明构建正确，转染B16细胞24h后，荧光显微镜下可观察到绿色荧光，且经RT—PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku—GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒，且在B16细胞中表达了融合蛋白。

中国生物制品学杂志临床观察

7例被狂犬咬伤者接种狂犬病疫苗的效果观察1046-1046

摘要：2008年2月7日，浙江省松阳县裕溪乡裕溪村一条本地犬咬人后自毙，其脑组织被送至丽水市疾病预防控制中心检测。犬伤者孝某某，女，80岁，右脚面被咬伤，属二级暴露，于被咬当日在当地防保站接种狂犬病疫苗（辽宁成大生物股份有限公司产品，批号20070902—5），按照0、4、7、14、28的程序进行全程接种，未接种狂犬病免疫球蛋白。

中国生物制品学杂志基础研究

以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA1047-1050

摘要：目的以长链PCR（Long-PCR）技术为基础，应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒（JEV）全长基因组。方法根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物，分别扩增JEVSA14-14-2株的5′和3′半长分子，在5′端上游引物中引入17启动子核心序列。利用细胞培养增殖病毒，提取病毒RNA，逆转录后采用LongPCR方法得到JEV的5′和3′两个半长分子，在此基础上进行融合PCR，得到JEV全长cDNA分子，克隆入pGEMT-easy载体，酶切鉴定并测序。结果扩增出均6000bp的JEV的5′和3′两个半长分子及约11000bp的全长cDN段，其二级结构丰富的非编码区未发生缺失。JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性最高达99％，其氨基酸序列同源性最高达96．3％。其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较，核苷酸序列同源性高达98％～99％，氨基酸序列也未出现较大差异。结论已获得了乙型脑炎病毒SA14—14—2株全长基因组，为进一步构建感染性克隆奠定了基础。

EGF＋61基因多态性与乙型肝炎肝细胞癌的相关性1051-1053

摘要：目的探讨表皮生长因子（EGF）G61A位点（EGF＋61）多态性与慢性乙型肝炎肝细胞癌的相关性。方法运用多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，检测中国人群中215例慢性乙型肝炎肝细胞癌患者和104例正常对照者EGF＋61位点的基因型，分析基因型及等位基因的分布频率。结果EGF＋61位点基因型及等位基因在乙型肝炎肝细胞癌患者及对照者的分布频率差异均无统计学意义。TNMⅠ、Ⅱ及TNMⅢ、Ⅳ两组的基因型及等位基因的分布频率差异也无统计学意义。结论在中国人群中，EGF＋61位点的基因多态性与乙型肝炎肝细胞癌的发生和进展程度无密切关系。

人3型副流感病毒HN基因的克隆、表达及其免疫原性1054-1057

摘要：目的克隆人3型副流感病毒（HPIV-3）HN基因，构建原核表达质粒，并检测表达蛋白的免疫原性。方法从呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中提取HPIV-3RNA，用套式RT—PCR扩增HN基因，克隆至pGEM-T载体上，进行核苷酸序列分析，并用生物信息软件分析HN蛋白的二级结构，构建截短的HN基因原核表达载体pET-28a-HN，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Westernblot检测后，进行纯化和复性。并以此蛋白免疫昆明小鼠，检测小鼠血清中HN抗体效价。结果扩增出的HPIV-3的HN基因核苷酸序列与参考序列的同源性为95％，氨基酸序列同源性为97％，有16处发生了突变。截短的HN基因的原核表达载体经酶切鉴定及测序，证明构建正确。重组HN蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％以上，且具有良好的反应原性。复性的重组HN蛋白免疫的小鼠可产生高效价的抗HN抗体。结论原核表达的截短的HN蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠产生较高水平的抗体应答。

声明1057-1057

百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用1058-1061

摘要：目的表达并纯化百日咳毒素（PT）S1亚单位截短片段S146，以其制备抗体，初步建立检测肼的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因，亚克隆至载体pUC18，鉴定正确后，插入表达载体pET16b，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Westernblot鉴定后，用镍离子亲和层析柱纯化，复性后的蛋白免疫家兔，制备抗血清，纯化后作为包被抗体，建立检测PT的双抗体夹心ELISA法，并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000，主要存在于破菌沉淀中，表达量占菌体总蛋白的44％；纯化后蛋白纯度为94．5％；家兔抗血清可特异性识别天然PTSI；建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146，并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体，初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法，为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。

多拷贝脑钠肽基因表达质粒的构建及其表达1062-1065

摘要：目的构建多拷贝脑钠肽（BNP）基因重组表达质粒，并探讨BNP基因的拷贝数与其表达水平的相关性。方法通过人工合成和PCR技术扩增BNP基因，将其克隆至载体pCW111中，构建表达质粒pBNP11，并通过亚克隆构建含有不同数量表达盒的正向串联表达质粒，分别转化大肠杆菌DH5a和BL21（DE3），经温度诱导表达，SDS-PAGE分析，并经激光扫描测定目的蛋白的表达量。结果测序及酶切鉴定证明1—3拷贝BNP重组表达质粒构建正确，重组蛋白在大肠杆菌DH5a和BL21（DE3）中均可获得表达，表达量分别为菌体总蛋白的8．12％、9．94％、和9．18％。结论已构建了多拷贝BNP的重组表达质粒，BNP的表达水平随BNP拷贝数的增加而升高，但并未成倍增加。

中国生物制品学杂志消息

欢迎登录《中国生物制品学杂志》网站1065-1065

中国生物制品学杂志基础研究

骨桥蛋白反义基因对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤生长及肺转移的影响1066-1069

摘要：目的探讨骨桥蛋白反义基因（ANOPN）对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤生长及肺转移的影响。方法构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3．1-ANOPN，将质粒pcDNA3．1-ANOPN、空载体pcDNA3．1（＋）和等量的脂质体分别转染人乳腺癌细胞系MDA-MA．231，将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA，接种至裸鼠，观察肿瘤的生长、转移情况，并用免疫组化法检测肿瘤组织切片中OPN的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-ANOPN经酶切、PCR及测序，证明构建正确。MDA-ANOPN组裸鼠出瘤时间、肿瘤体积及重量较MDA-vect和MDA组均显著降低，肿瘤肺转移灶数量减少，OPN表达较低。结论ANOPN可抑制裸鼠移植瘤的生长及肺转移。

风疹病毒松叶株E2基因的遗传特征1070-1073

摘要：目的研究风疹疫苗病毒松叶株（Matsuba）传代病毒E2基因的遗传特征及其基因稳定性。方法将Matsuba株毒种RV14在原代兔肾细胞上连续传代至第23代，取第14、16、17、18和23代病毒，利用RT-PCR方法扩增其E2蛋白基因，并与pUC18质粒连接后测序，对各代病毒及参考株的E2基因序列进行比对分析。结果Matsuba株E2基因全长846bp，传至23代时仍有很高的同源性，第14、16、17、18和23代与一致序列的核苷酸同源性分别为100％、100％、99．8％、99．8％和99．6％，氨基酸同源性分别为100％、100％、100％、99．3％和99．2％。Matsuba株E2基因与参考株核苷酸序列同源性为91．0～98．7％。Matsuba株各代病毒核苷酸、氨基酸序列高度保守，各关键功能区未发生变异。结论风疹病毒Matsuba疫苗株E2基因遗传特性稳定，为在分子水平保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据。

轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究1074-1077

摘要：目的研究轮状病毒（RV）LLR疫苗株VP7基因的遗传特征，为疫苗的质量控制和发展提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代。提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增VP7基因片段，将其克隆入质粒pGEM-T中，进行序列测定与分析。结果LLR株VP7基因全长1062bp，含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架（ORF）。各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致，与GenBanK中LLR参考株（L11602）同源性分别为99．9％和99．7％。与14株GIO血清型RV毒株之间，核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84．3％。87．4％和92．7％～94．9％；与不同血清型RV代表株间，VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62．2％。76．8％和72．9％．83．1％；在A、B、C3个重要抗原表位，LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97．5％，而与不同血清型仅为42．5％～62．5％。结论轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性，与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异，在遗传上密切相关，从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的。

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性1078-1079

摘要：目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性，以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0．01、0．05和0．1MOI接种于Vero细胞，观察细胞病变（CPE）情况，并检测病毒的感染性滴度，确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后，各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0．05时，接种病毒后出现CPE及收获时间均较早，病毒的感染性滴度最高，确定接种病毒的最适MOI为0．05。连续传15代，病毒滴度随传代次数的增加而上升，各代次病毒的基因组核酸带型基本一致，且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后，可在Vero细胞上稳定传代15代。

中国生物制品学杂志预防制品

噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子的稳定性1080-1082

摘要：目的观察在不同温度保存条件下噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子的稳定性。方法将噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子样品分为两组，一组添加等体积的80％甘油，另一组不添加甘油，分别于不同温度条件下存放不同时间后取样，用噬斑法检测滴度。结果在37％和25℃条件下保存，噬菌体疫苗种子滴度下降较快，在4℃和-20℃条件下保存噬菌体疫苗种子滴度下降相对较慢；37℃、25℃及4℃条件下保存，添加甘油并无明显的保护作用，而在-20℃条件下保存，添加甘油有明显的保护作用。结论噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子可在4℃条件下短期保存，-20℃条件下长期保存，并可添加甘油作为保护剂。

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒1083-1084

摘要：目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞，每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒，观察细胞病变，并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养（灌流培养法）、二级细胞培养（循环培养法）和三级细胞培养（批培养法）的平均细胞密度分别为2．79×10^6、2．38×10^6和1．04×10^6个／ml，一级培养的细胞倍增数最高；病毒培养体积达350L，病毒收获液滴度大于7．625lgCCID50／ml。结论通过三级放大工艺，可大规模培养脊髓灰质炎病毒。

篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗1085-1086

摘要：目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7．5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞，接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种，根据葡萄糖的消耗量，分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度，每24h取样，检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后，制备乙脑灭活疫苗，检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h，葡萄糖消耗量达高峰，细胞密度达峰值；接种病毒后72h，葡萄糖消耗量达高峰，灌流量为7L／d，连续收获7，9d，共可收获（40±5）L病毒液；96h病毒滴度达高峰，为10．0LgLD50／ml；制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部（2005版）要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。