中国生物制品学杂志 北大期刊 CSCD期刊 统计源期刊

中国生物制品学 2007年第03期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12共表达质粒的构建与真核表达153-156

摘要：目的 构建能分泌表达相对分子质量为9000的人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12（mIL-12）的真核共表达质粒，并检测其蛋白表达。方法 以含有颗粒溶素eDNA序列的质粒为模板，通过PCR扩增获得相对分子质量为9000的颗粒溶素活性肽基因片段后，定向插入真核表达载体pBudCE4．1中，获得重组表达质粒pBudCE4．1-S9K，经双酶切及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。同时，将小鼠IL-12亚克隆入pBudCE4．1另一多克隆位点，构建真核共表达质粒pBudCE4．1-S9K／mIL-12。采用RT-PCR、免疫细胞化学与Dot-ELISA法，检测颗粒溶素活性肽在RAW264．7细胞的瞬时表达与分泌。ELISA检测mIL-12的表达。结果 酶切、PCR及测序鉴定证实，颗粒溶素活性肽基因插入片段正确；RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达；Dot-ELISA检测表明颗粒溶素可分泌到细胞外。ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达。结论 已成功构建真核表达质粒pBudCE4．1-S9K／mIL-12，并能体外表达，为下一步利用颗粒溶素与mIL-12基因治疗肿瘤奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定157-161

摘要：目的 构建和表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）尿素酶B亚单位（UreB）表位串联体（Uepi）与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）融合蛋白表位疫苗，并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法 设计引物，采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因，重叠延伸PCR法将两段基因拼接，T-A克隆后，构建融合基因表达质粒pET-22b（＋）-Uepi-LTB，经酶切鉴定后转化E．coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，并对表达产物进行鉴定。结果 PCR扩增出206bp和336bp的目的片段，重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b（＋）-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定，与设计序列一致。重组工程菌pET-22b（＋）-Uepi-LTB／BL21经IPTG诱导，目的蛋白表达率约25％，SDS-PAGE分析相对分子质量约20000，目的蛋白以包涵体形式表达，纯化后蛋白纯度达96％，Western blot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论 Hp UreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆，可获得高效表达，并显示出较好的免疫活性，为新一代脚疫苗的研制奠定基础。

传染性法氏囊病病毒疫苗B87株基因组B节段的克隆和序列分析162-165

摘要：目的 获得传染性法氏囊病病毒（IBDV）疫苗B87株B节段全长cDNA，并对其序列进行分析，为进一步在分子水平上研究病毒基因组的功能、抗原变异和毒力变异奠定基础。方法 使用蛋白酶K和酚／氯仿抽提法提取病毒基因组RNA，用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA，通过RT-PCR一步扩增获得B节段的全长cDNA。将其克隆到pGEM-T载体上，然后测序，并用DNAStar软件进行序列分析。结果 测序结果表明，克隆的B87株基因组B节段全长为2827bp，与超强毒参考株UK661和HK46的同源性分别为89．8％和89．3％，与强毒参考株Harbin．1和ZJ2000的同源性分别为90．2％和89．5％；与变异毒株GLS的同源性为97．8％；与弱毒参考株CEF94和Gt株的同源性均为99．8％，与P2株的同源性达100％。结论 通过对9株IBDV编码氨基酸序列进行分析、比较，推测B节段上10个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。

中国生物制品学杂志预防制品

人用狂犬病疫苗的免疫效果观察165-165

摘要：接种安全高效的狂犬病疫苗是预防狂犬病的有效手段之一。成大速达“人用狂犬病疫苗是以Vero细胞为基质。采用国家标准毒株PV-2061，利用引进的生物反应器高密度徽载体细胞培养技术，经多次纯化制备的无佐剂狂犬病疫苗，经检定各项指标均达到WHO和《中国药典》三部（2005版）的相关质量要求。本文对密切接触狂犬病患儿的医护人员，应用人用狂犬病疫苗进行接种，观察其免疫效果，现将结果报道如下。

中国生物制品学杂志基础研究

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备166-169

摘要：目的 克隆、表达人肌红蛋白基因，并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法 应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因（hMb）编码序列，克隆入原核表达载体pRSETc中，并在大肠杆菌E．coliBL21（DE3）中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，并用Westernblot检测其特异性。结果 测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank（NM203377）中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌EcoliBL21（DE3）中获得高效可溶性表达，表达产物经纯化，获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12．8％。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6．438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1：12800，Weatem blot证实其具有较好的特异性。结论 已成功克隆人肌红蛋白基因，在大肠杆菌中获得了可溶性表达，并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。

抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建170-173

摘要：目的 构建抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法 用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链（L）及重链Fd段（VH＋CH1）基因片段，将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接，重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc，再与Fd基因连接，构建重组表达载体pAC-HBs-Fc，并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后，转染昆虫细胞sf9，用免疫荧光检测IgG的表达。结果 PCR扩增的片段约650bp，与预期值一致。载体pAC-k-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染圆细胞呈阳性荧光反应，未转染细胞呈阴性荧光反应。结论 已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc，为表达抗人HBsAg的LgG全抗体奠定了基础。

非肥胖型糖尿病小鼠胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子的表达174-177

摘要：目的 研究非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子表达水平，探讨胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子在中枢免疫耐受中的作用。方法对NOD小鼠用GA-PAP试剂盒检测血糖；尿糖试纸检测尿糖；ELISA间接法检测IAA的含量；光镜观察胰岛的组织学改变情况；MTT法检测胸腺T淋巴细胞功能；ELISA夹心法检测胸腺细胞IL-4、IFN-γ分泌水平；流式细胞术检测胸腺细胞MHC-Ⅱ类分子表达水平；RT-PCR法检测胸腺异位基因的表达水平。结果 NOD小鼠血糖水平与正常BALB／c小鼠差异无显著意义，尿糖水平均为阴性；NOD小鼠自身抗体水平与正常BALB／c小鼠差异无显著意义；与对照组相比，NOD小鼠胰岛数量减少，分布稀疏，胰岛细胞数亦减少，同时有大量炎细胞浸润；NOD小鼠胸腺细胞对ConA刺激的应答水平与正常BALB／c小鼠差异无显著意义；NOD小鼠胸腺细胞IFN-γ的分泌与正常BALB／c小鼠差异无显著意义，而IL4的分泌能力明显低于正常BALB／c小鼠；NOD小鼠胸腺内Insulin水平显著减少，而GAD67和PLP水平无显著变化；NOD小鼠MHC-Ⅱ类分子的表达水平明显下降。结论 NOD小鼠在糖尿病发病前期存在着胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子表达缺陷，表明胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子在中枢免疫耐受中起着重要作用。

中国生物制品学杂志消息

2007年《中国免疫学杂志》第十届学术论文研讨会征文通知177-177

中国生物制品学杂志基础研究

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性178-180

摘要：目的 设计新型HIV复合多表位疫苗，并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法 检索抗原表位数据库，进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计，利用化学合成的方法合成多表位基因，并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24，转染BHK-21细胞，间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB／c小鼠，ELISA法检测抗体动态变化，流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果 重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析，证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论 已成功构建了重组质粒pVAXi-MEGNp24，小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。

输血传播病毒ORF2基因的克隆和原核表达181-183

摘要：目的 克隆输血传播病毒（TTV）兰州株ORF2的基因，并构建原核表达载体。方法 通过巢式PCR，从一份兰州地区无偿献血员血清中扩增TTV病毒的ORF2基因，并克隆到pGEM-T载体中，进行核苷酸序列分析。然后亚克隆到高效表达质粒pET22b（＋）中，构建表达载体ORF2-pET22，在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF2融合蛋白。用纯化的重组ORF2蛋白作为抗原，ELISA检测人血清样本中的TTV-IgG抗体。结果 ORF2基因与日本TA287株的同源性为99．3％。用TTV-PCR阳性的血清对重组蛋白进行了Western blot，结果在表达蛋白位置处出现了特异性反应条带。以ORF2蛋白为抗原的ELISA检测结果具有较好的准确性。结论 已成功克隆了ORF2基因，并在原核细胞中表达。

黑色素瘤抗原-4基因在结肠腺癌中表达的检测184-186

摘要：目的 检测黑色素瘤抗原-4（MAGE-4）基因在结肠腺癌中的表达情况。方法 采用RT-PCR方法检测44份结肠腺癌组织及15份癌旁正常组织标本中MAGE-4基因的表达。结果 44份结肠腺癌标本中，MAGE-4基因的阳性表达率为38．64％，而在15份癌旁正常组织中均不表达，两组比较差异有显著意义。对阳性标本的RT-PCR扩增产物中目的基因片段进行DNA测序，证实为MAGE-4全长编码基因。结论 MAGE-4基因在结肠腺癌组织中呈特异性表达，提示该基因可用于结肠癌疫苗的开发。

稳定表达HIV-1病毒样颗粒的293细胞系的筛选及其稳定性187-189

摘要：目的 获得高效、稳定表达含有HIV-1主要结构蛋白gag、pol和env的病毒样颗粒的293细胞系。方法 选择合适的真核细胞表达质粒与带有抗性基因的载体，共转染293真核细胞，用含有抗性的培养基筛选出稳定表达细胞株。结果 HIV-1的gag、pol和env蛋白均在293细胞中获得了表达，且不同代次的293细胞中蛋白表达情况无明显差异。结论 成功筛选了稳定表达HIV-1病毒样颗粒的293细胞系，为进一步开发艾滋病疫苗奠定了基础。

口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建190-194

摘要：目的 构建口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法 以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asial型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VPl基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因，非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因，构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游，构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果 通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5．0软件分析表明，所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求，且在真核细胞获得了正确表达。结论 已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT，并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。

Rap1GAP二聚体的形成对其在细胞内定位的影响195-197

摘要：目的 观察Rap1GAP二聚体的形成对其在细胞内定位的影响。方法 对绿色荧光蛋白标记的Rap1GAP野生体编码第90和99位氨基酸的核苷酸进行定点突变，制备绿色荧光蛋白标记的Rap1GAP二聚体缺失突变体M90和M99。将Rap1GAP野生体及二聚体缺失突变体单独或者分别与活化型Ga共转染HEK293细胞，在荧光显微镜下观察野生体和二聚体缺失突变体在细胞内的分布情况。结果 野生型Rap1GAP与二聚体缺失突变体Rap1GAP分别单独转染HEK293细胞时，野生型和突变体Rap1GAP均弥漫分布胞质内；当野生型与突变体Rap1GAP分别与活化型Ga共转染HEK293细胞时,野生型和突变体Rap1GAP均主要分布在细胞膜上。结论 Rap1GAP二聚体的形成对其在细胞内的定位没有影响。

中国生物制品学杂志消息

《微生物培养基质控与图解》新书征订启事197-197

中国生物制品学杂志预防制品

重组HBcAg与HBsAg混合抗原的免疫效果198-200

摘要：目的 观察重组HBcAg与HBsAg混合抗原免疫BALB／c小鼠后体液免疫与细胞免疫的效果。方法 配制含Al（OH）3佐剂与不含佐剂的混合抗原，分别免疫BALB／c小鼠，采用ELISA法测定抗体滴度和细胞因子水平；采用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果 HBcAg与HBsAg混合抗原免疫小鼠产生的IFN-1量明显高于二者单独免疫，CD3^＋和CD4^＋水平显著增高；含Al（OH）3佐剂的混合抗原CD8^＋水平明显高于阴性对照组；混合抗原免疫小鼠血清产生的抗-HBs抗体与2倍剂量的HBsAg单独免疫相比，差异无显著意义。含Al（OH）3佐剂与不含佐剂的疫苗免疫效果差异无显著意义。结论 重组HBcAs与HBsAg混合抗原表现出良好的体液免疫与细胞免疫效果，为治疗性乙肝疫苗的开发提供了依据。

幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的保护性研究201-203

摘要：目的 探讨幽门螺杆菌融合蛋白HCTV（HpaA-CtxB-VacA，HCTV）小鼠口服后的免疫应答。方法 以Ni^2＋-NTA柱纯化HCTV为抗原，与重组蛋白HpaA和VacA分别给小鼠灌胃免疫，ELISPOT检测小鼠胃黏膜和派伊尔小结（Peyer patches，PP）特异性抗体分泌细胞（Antibody-secretingceils，ASC），ELISA检测血清IgG和IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA。结果 ELISPOT和ELISA检测结果表明，胃黏膜和PPsIgA．ASC、IgG-ASC数量明显增加，尤以sIgA-ASC为甚，同时血清IgA和IgG、粪便sIgA、肠黏液sIgA也明显高于HpaA组、VacA组和对照组，差异均有显著意义。结论 已成功获得纯化的融合蛋白HCTV，小鼠灌胃免疫可有效诱导黏膜免疫应答，产生高水平的sIgA，可作候选坳口服疫苗。

乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布204-205

摘要：目的 研究乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布。方法 将SA14-14-2株分别经脑内和皮下途径接种小鼠，采用BHK21细胞病毒蚀斑法检测接种后不同时间病毒在小鼠不同脏器中的分布。同时以不同稀释度的强毒株SA14为对照。结果 SA14-14-2株经脑内感染小鼠后，除在脑组织中短时间检出病毒外，在其他组织中均未检出病毒；经皮下感染小鼠后，在任何组织中均未检出病毒。而强毒株SA14无论经脑内还是皮下途径感染小鼠，在各种脏器中均可检出病毒。结论 SA14-14-2株经皮下感染小鼠后，病毒不能在体内复制，证明乙型脑炎病毒减毒活疫苗具有较好的安全性。