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中国生物制品学 2006年第02期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

含CpG基序寡核苷酸对rHBsAg免疫小鼠脾脏组织及细胞增殖的影响105-107

摘要：目的探讨合成含CpG基序的寡核苷酸（CpG ODN）与重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg）联合免疫对小鼠脾脏淋巴组织及细胞增殖的影响.方法经后腿胫骨前肌初次免疫BALB/c小鼠,2周后加强免疫1次;常规石蜡切片,H-E染色,观察脾脏组织学改变;3H-TdR掺入法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应.结果抗原＋CpG组脾脏可见明显的组织学改变.加CpG与不加CpG的2组比较,淋巴细胞增殖反应显著增强.结论CpG ODN能够有效刺激小鼠脾脏组织T细胞区淋巴细胞增生,生发中心明显增大,而且能够显著增强淋巴细胞增殖反应.

HIV-1 HXB2株蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定108-112

摘要：目的原核表达、纯化HIV-1型HXB2株蛋白酶（Protease,PR）,用于对HIV-1 Gag P2/NC蛋白酶切割位点序列随机突变的噬菌体展示文库的切割筛选.方法根据HIV-1 HXB2株PR DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体进行测序.将HIV-1 PR DNA克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE鉴定,并用HIV阳性血清进行免疫反应性的鉴定.结果合成的使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,经测序显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致.所构建的HIV-1 PR原核表达质粒pQE30-pr,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为14 000的HIV-1 PR蛋白,纯化的目的蛋白浓度为7.74 mg/ml。ELISA检测该蛋白与HIV阳性血清呈特异性反应.结论已成功合成并克隆了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,经表达及纯化的HIV-1 PR蛋白具有免疫学特性.

重组人Stathmin基因的克隆及表达113-115

摘要：目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达.方法用PCR方法从Hda细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增得到460 bp的cDN段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin（NM_203401）序列一致,经SDS-PAGE和Western blot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白.结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础.

B族链球菌C5a肽酶功能活性区域的分段表达116-119

摘要：目的表达B族链球菌C5a肽酶蛋白功能活性区域,为进一步研究及开发疫苗奠定基础.方法设计引物,从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出含有C5a肽酶蛋白不同功能区域基因的4个目的片段,分别插入T载体,再经酶切后,插入原核表达载体PET32a,进行融合表达.对表达蛋白进行免疫原性检测,并通过镍柱大量纯化.结果成功构建4个目的片段的PET表达质粒.经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白相对分子质量分别为80 000、78 000、70 000和36 000.蛋白质谱分析证实,表达的4个蛋白为B族链球菌C5a肽酶蛋白的可能性分数分别为82、152、113和79。免疫印迹证实均能与特异性抗C5a肽酶蛋白的抗体反应,纯化后的蛋白SDS-PAGE纯度达90%.结论已成功地表达了可溶性C5a肽酶蛋白4个功能活性区域,为蛋白免疫表位和毒力机制的研究以及亚单位蛋白疫苗的制备奠定了基础.

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定120-123

摘要：目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达.方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEM T-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导表达及鉴定.结果PCR扩增约770 bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31 000,纯化后鉴定为SEA蛋白.结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础.

HIV跨膜蛋白gp36和gp41的截短及融合表达124-126

摘要：目的将HIV-1的跨膜蛋白gp41和HIV-2跨膜蛋白gp36进行截短,并在大肠杆菌中进行融合表达.方法用PCR将gp41和gp36的编码基因进行截短,回收的PCR产物纯化后克隆到连接载体pGEM-T上,然后用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和SalⅠ切下目的基因,并构建到表达载体pGEX-4T-3,导入宿主细胞BL21,用IPTG诱导表达.结果酶切鉴定显示,截短的HIV-1 gp41和HIV-2 gp36跨膜蛋白基因大小与预期的一致,表达产物经SDS-PAGE分析显示在相对分子质量66 000处出现融合表达条带,Western blot分析显示,与相应抗体出现特异性反应.结论已成功对gp41和gp36跨膜蛋白进行截短,并构建表达载体进行表达,为跨膜蛋白的进一步应用研究奠定基础.

转基因枸杞表达重组HIV壳体蛋白的鉴定127-129

摘要：目的构建转基因枸杞表达系统,并表达HIV壳体蛋白.方法以重组质粒pET-3a-MA4-CA为模板,PCR扩增MA4-CA基因,克隆至pGEM-T质粒中,转化DH5α,经双酶切后重组于pCAMBIA1305.2载体中,构成pCAMBIA1305.2-MA4-CA载体,经农杆菌介导叶盘转化法转化枸杞,培育转基因枸杞植株,进行芽、根诱导.结果在植物培养箱中,转基因植株成功地进行了分化及生根的诱导.PCR扩增分析表明转基因植株内存在目的基因,并与启动子p35S相连.ELISA及Western blot实验证实在转基因枸杞叶子提取物中存在壳体蛋白.结论初步建立了表达具有免疫原性的HIV壳体蛋白的转基因枸杞表达系统.

人sΔBAFF的高效原核表达及纯化130-133

摘要：目的克隆TNF家族B细胞激活因子（B cell activating factor to the TNF family,BAFF）胞外区134～285（sBAFF134-285）氨基酸残基段缺失突变体（s△BAFF）的cDNA,并进行表达及纯化.方法以构建的重组质粒pUC19/sBAFF为模板,采用一步反向PCR法,扩增缺失编码sBAFF的142～160位氨基酸的核苷酸序列.经测序证实后,克隆入原核表达载体pQE-80L.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,Ni2＋-NTA柱层析纯化目的蛋白.结果经一步反向PCR扩增后得到401 bp的DN段,该片段序列与GenBank报道的编码人△BAFF的胞外区（s△BAFF）cDNA序列一致.含s△BAFF的表达载体在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为18 000的蛋白质并以包涵体的形式存在,经Ni2＋-NTA柱层析纯化后得到高纯度的目的蛋白.结论已成功地制备出人s△BAFF蛋白,为其功能的研究创造了条件.

人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化134-138

摘要：目的对人白细胞介素-24（hIL-24）进行克隆、表达和纯化.方法分离人外周血单个核细胞,Con A刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致.所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21（DE3）后,37℃诱导表达相对分子质量约为44 000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%.经纯化后,纯度达85%以上.Western blot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应.结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础.

体外培养前后脐血CD34^＋细胞差异表达基因的筛选139-142

摘要：目的筛选扩增培养前后脐血CD34^＋细胞差异表达基因.方法将新鲜分离的CD34＋细胞设为对照组,经静态和动态培养系统扩增的CD34^＋细胞设为试验组,应用基因差异显示技术（DDRT-PCR）比较两组之间的基因表达差异,对差异表达基因片段进行克隆、测序及生物信息学分析,并且通过半定量RT-PCR方法验证基因差异表达的真实性.结果应用差异显示技术筛选出5个差异表达基因,其中4个为已知功能基因,1个为未知功能基因,对其中2个基因RAN和DC24进行半定量RT-PCR检测表明,在静态和动态体系扩增培养后的CD34^＋细胞内,RAN mRNA的表达水平分别是新鲜分离细胞的1.521和3.978倍,DC24 mRNA的表达水平分别是新鲜分离CD34^＋细胞的14.275和2.374倍.结论发现了与CD34^＋细胞体外增殖相关的一些重要基因,为从基因水平调控CD34^＋细胞体外增殖提供依据.

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析143-145

摘要：目的表达鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性.方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E. coli BL21（DE3）菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Western blot检测.结果阳性重组表达质粒转化E. coli BL21（DE3）后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%.Western blot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应.结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性.

HSV-1 stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体的构建及序列分析146-149

摘要：目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体,并进行序列分析.方法PCR扩增HSV-1-gG基因的膜外区,克隆于pGEM-T载体,转化DH5α,提取质粒酶切鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,鉴定后转化GS115菌,构建酵母表达载体.对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性、抗原性及表达形式.结果获得的重组酵母表达载体pPIC9K-gG,测序结果证实为HSV-1-gG基因,序列分析其高度保守,预测蛋白相对分子质量15 870,等电点pI为4.72,包含全部膜外区分值达1.7的6个强抗原决定簇,将以可溶性形式分泌表达于胞外.结论已成功构建HSV-1 stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体.

产气荚膜梭菌β2-β1融合基因的构建及初步表达150-152

摘要：目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达.方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,回收0.73 kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21（DE3）中,进行诱导表达.结果经SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组菌株BL21（DE3）可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别.结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达.

中国生物制品学杂志更正

更正152-152

中国生物制品学杂志基础研究

真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达153-154

摘要：目的构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平.方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Western blot法,检测其在293T细胞内的表达水平.结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Vasostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达.结论已成功构建了pcDNA3.1（＋）-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白.

绿脓杆菌重组毒素分泌表达的初步研究155-158

摘要：目的分析绿脓杆菌重组毒素的分泌表达机理.方法将所构建的6种绿脓杆菌重组毒素的分泌表达质粒,即pET-20b-IL-1023-57-PE40、pET-20b-EGF-PE40、pET-20b-LHRH-PE35、pET-20b-EGF-PE38、pET-20b-MSH-PE40和pET-20b-LHRH-PE40分别转化至Rosetta（DE3）中,进行IPTG诱导表达.结果只有LHRH-PE40和LHRH-PE35能分泌表达.LHRH-PE35表达产物经Western blot检测,可被特异抗体识别.经DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对6种PE重组毒素性质进行比较分析发现,并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,其中导向部分的性质决定了PE重组毒素是否分泌表达.结论对绿脓杆菌重组毒素的分泌机理已有初步了解.

5-Fu对人结肠癌细胞凋亡过程中DNA损伤修复基因表达的影响159-161

摘要：目的探讨5-Fu对人结肠癌细胞（HCT/8）凋亡过程中DNA损伤修复相关基因表达的影响.方法通过形态学、基因组电泳、吖啶橙染色及流式细胞仪,观察大肠癌细胞凋亡情况,同时应用基因芯片分析5-Fu作用后DNA损伤修复相关基因表达的变化.结果经流式细胞仪检测发现,5-Fu作用于HCT/8细胞48 h与对照组相比,凋亡细胞数明显增加,基因组电泳出现典型的梯形条带,基因芯片分析显示,12个与DNA损伤修复相关的基因中,上调基因3个,下调基因9个.结论5-Fu作用于结肠癌细胞,导致多种DNA损伤修复基因发生改变,综合作用使细胞不能及时对损伤DNA进行修复,最终导致细胞发生凋亡.

凋亡抑制因子Survivin在小鼠内耳发育中的作用162-163

摘要：目的探讨凋亡抑制因子Survivin在小鼠内耳发育中的作用.方法应用HE染色观察小鼠内耳发育形态演变过程、免疫组织化学方法检测Survivin在小鼠12～17 d胚胎、生后14 d内乳鼠内耳的表达情况.结果Survivin在听泡上皮增殖期表达最广泛,在分化成熟期表达逐渐增强,而范围减小.结论Survivin参与小鼠内耳发育,在细胞增殖与分化、器官塑形过程中起一定的作用,为探索毛细胞再生和耳聋防治奠定基础.