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中国农业科学 2017年第15期杂志 文档列表

中国农业科学杂志耕作栽培·生理生化·农业信息技术

夏闲期覆盖配施氮肥对旱地小麦土壤水分及氮素利用的影响2888-2903

摘要：【目的】针对黄土高原旱地小麦降水少且分配不均、水分和氮素利用效率低的问题,探索旱地小麦覆盖保水和氮肥施用的最佳技术途径。【方法】于2010—2013年在山西省闻喜县邱家岭村开展试验,主区为覆盖方式,设夏闲期深翻后覆盖与不覆盖2个水平,副区为施氮量,设低(纯氮75 kg·hm-2)、中(纯氮150 kg·hm-2)、高(纯氮225 kg·hm-2)3个水平,明确年际间夏闲期深翻覆盖配施氮肥对旱地麦田土壤水分、植株氮素利用、产量的影响。【结果】各生育时期土壤水分、植株氮素积累量、花前氮素转运量及其对籽粒的贡献率均以丰水年最高,欠水年最低,丰水年、平水年较欠水年分别提高产量80%、69%,提高水分利用效率7%、20%,提高氮素利用效率6%、5%。夏闲期覆盖较不覆盖,播种期0—300 cm土壤蓄水量显著提高,达50—62 mm;花前各生育时期土壤蓄水量显著提高,各生育时期植株氮素积累量提高,籽粒氮素积累量显著提高;丰水年和平水年拔节后各阶段氮素积累量显著提高,花前叶片和穗氮素转运量对籽粒贡献率提高;欠水年花前各阶段氮素积累量及其所占比例提高,花前茎秆+茎鞘氮素转运量对籽粒贡献率显著提高;产量显著提高,达23%—41%;水分利用效率提高3%—15%;丰水年和平水年氮素利用效率显著提高,达14%—26%,欠水年低氮条件下也显著提高,达10%。丰水年配施高氮,平水年和覆盖条件下的欠水年配施中氮,不覆盖条件下的欠水年配施低氮,孕穗期前土壤蓄水量、产量和水分利用效率均较高。丰水年配施高氮,花前氮素转运量和花后氮素积累量均最高,且各处理间差异显著,主要是由于促进花前叶片和穗中氮素向籽粒转运;平水年和覆盖条件下的欠水年配施中氮,花前氮素转运量和籽粒氮素积累量最高,且各处理间差异显著,平水年主要促进叶片和穗中氮素向籽粒转运,穗>叶片,覆盖条件下

休闲期深松蓄水适期播种对旱地小麦产量的影响2904-2915

摘要：【目的】解决黄土高原旱地麦区多数年份只能等雨晚播种导致产量降低等生产实际问题,研究休闲期深松蓄水和适期播种对旱地小麦产量及其构成因素的影响,以提高自然降水利用效率,构建合理群体结构,实现高产、高效。【方法】于2012—2014年度在山西省闻喜县邱家岭开展大田试验研究,以休闲期深松和当地传统耕作（对照）为主区,以9月20日（早播,T1）、10月1日（适期播种,T2）、10月10日（晚播,T3）3个播期为副区,研究休闲期深松蓄水对旱地小麦产量形成的影响及播期的调节效应。【结果】休闲期深松较对照,两试验年度播种期3 m内土壤水分分别提高59—71 mm、34—52 mm;冬前分蘖数、各生育时期植株干物质量显著提高,两试验年度分别提高穗数8%—18%、8%—15%,产量19%—36%、17%—22%,水分利用效率6%—21%、10%—12%。休闲期深松条件下,越冬至孕穗期土壤蓄水量以适期播种处理最高;冬前群体分蘖数、开花前植株干物质量以适期播种处理最高,但与早播处理差异不显著;开花后植株干物质量以晚播处理最高,但与适期播种处理差异不显著;穗数、穗粒数、产量和水分利用效率均以适期播种处理最高,且与其他处理差异显著,而千粒重随播期推迟而增加。传统耕作条件下,降水少的年份（2012—2013年度）越冬至孕穗期土壤蓄水量以早播处理最高,穗数、穗粒数、产量也均以早播处理最高。此外,3个播期休闲期深松处理,穗数、穗粒数、成熟期植株干物质量、产量与开花前各土层土壤蓄水量相关性较开花后显著,且与开花前深层土壤水分相关性极显著。休闲期深松配套适期播种,播种期土壤水分每增加1 mm,两试验年度增产分别达17 kg·hm-2、23 kg·hm-2。【结论】休闲期深松有利于蓄积休闲期降雨,提高底墒;且休闲期深松蓄水条件下,采用早播和适期播种处理均有利于形成冬

氮肥后移对绿洲灌区玉米干物质积累和产量构成的调控效应2916-2927

摘要：【目的】针对绿洲灌区传统施氮技术下,全膜覆盖玉米生育后期土壤氮肥供应不足、早衰和减产等问题,探讨氮肥后移对玉米干物质积累和产量构成的影响,以期为优化试区氮肥管理提供理论依据。【方法】2012—2015年,于河西绿洲灌区进行大田试验,在总施氮量相同且基肥和大喇叭口期追肥分别占总施氮量20%和40%条件下,设3个施氮处理:氮肥后移20%（拔节肥10%+花粒肥30%,M1）、氮肥后移10%（拔节肥20%+花粒肥20%,M2）和传统施氮（拔节肥30%+花粒肥10%,M3）,研究不同氮肥追施制度对玉米干物质积累动态和产量构成的调控效应。【结果】氮肥后移增大了玉米干物质最大增长速率和干物质平均增长速率,提前了干物质最大增长速度出现的天数。在氮肥后移20%施氮制度下,玉米干物质最大增长速率和干物质平均增长速率分别较传统施氮处理提高15.6%和6.6%,玉米干物质最大增长速率出现的天数较传统施氮提前2.9 d。施氮制度对玉米生物产量、籽粒产量、收获指数、有效穗数、穗粒数和千粒重均有显著影响。氮肥后移20%施氮制度下,玉米生物产量较传统施氮处理高6.6%,但氮肥后移10%处理生物产量与传统施氮处理差异不显著;氮肥后移20%和10%处理玉米的籽粒产量分别较传统施氮处理提高14.1%和5.1%;氮肥后移20%施氮处理收获指数较传统施氮处理高7.5%,但氮肥后移10%施氮处理与传统施氮处理差异不显著;氮肥后移20%施氮处理下,玉米有效穗数、穗粒数和千粒重分别较传统施氮处理高8.9%、12.9%、5.8%,但氮肥后移10%处理的千粒重与传统施氮处理差异不显著。通径分析表明,氮肥后移主要通过提高有效穗数,进一步提高穗粒数和千粒重,从而提高产量。说明氮肥后移20%施氮处理通过优化玉米有效穗数、穗粒数和千粒重对产量产生了调控作用。【结论】在河西绿洲灌区,总施氮量450 kg·hm

STK1对玉米大斑病菌附着胞发育过程中糖原和脂肪积累的影响2928-2935

摘要：【目的】通过研究STK1与附着胞发育的关系,明确附着胞发育过程中STK1对糖原和脂肪合成的调控作用,为阐明玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)附着胞发育的分子机制打下基础。【方法】以玻璃平板为疏水基质表面,通过“插片分离菌丝”法使菌丝附着于载玻平板表面,然后将附着有菌丝的玻璃平板置于保湿培养皿中22℃、14 h光照和10 h黑暗交替培养,诱导野生型菌株(WT)和STK1基因敲除突变体(ΔSTK1)的菌丝形成附着胞,每隔12 h显微观测附着胞的形态和发育过程;分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板浸没在I2/KI染色液中静置染色48 h,显微观察附着胞发育过程中糖原的变化;分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板置于-70℃的超低温冰箱中冷冻处理30 min,然后将玻璃平板置于Oil-red O染色液中静置染色24 h,显微观察附着胞发育过程中脂肪的代谢变化;利用real-time PCR技术检测附着胞发育过程中糖原和脂肪合成关键酶基因的表达情况。【结果】玉米大斑病菌WT菌株和ΔSTK1菌株利用菌丝尖端在玻璃平板的疏水表面均能够产生附着胞,但ΔSTK1菌株的附着胞发育与WT菌株显著不同,WT菌株48 h内为单胞附着胞,诱导48 h后少数附着胞形成了多细胞附着胞,而ΔSTK1菌株在诱导24 h后即出现了扭曲附着胞的异形附着胞形态,48 h后还出现了双杈、多杈和O型等多种异常的附着胞类型;WT菌株和ΔSTK1菌株的菌丝和附着胞进行糖原和脂肪的染色后,发现WT菌株的菌丝和附着胞都有均匀分布的糖原和脂肪,而ΔSTK1菌株的附着胞内几乎没有糖原和脂肪的积累,与WT菌丝的结果不同,在ΔSTK1菌株的菌丝内糖原沉积减少,脂肪主要分布于菌隔部位;附着胞诱导48 h后,WT菌株糖原合酶(glycogen synthase,GS)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglyc

番茄SYTA的克隆及表达分析2936-2945

摘要：【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根>叶>茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均�

西瓜细菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析2946-2956

摘要：【目的】西瓜细菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一种严重的世界性病害。细菌的鞭毛通常被认为是细菌的运动器官,在细菌的侵染过程中也起重要作用,已有报道表明这种作用可受鞭毛蛋白基因fliS的调控,目前西瓜细菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其调控机理尚不清楚,本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用。【方法】以果斑病菌野生型致病菌株1号基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增敲除基因fliS的上下游片段,通过回收、酶切、连接、转化等步骤构建敲除载体和互补载体,然后采用三亲杂交法,根据同源重组的原理,构建fliS基因缺失突变菌株及其互补菌株,并对其鞭毛的形态特征、致病性、过敏反应、游动性、群体感应、菌膜、生长速率、菌落形态等生物学特性进行测定;进一步提取细菌总RNA,以谷氨酰胺合成酶基因glnA为参照来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,比较野生菌株、敲除菌株和互补菌株部分鞭毛蛋白基因flh D、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表达量差异。【结果】通过抗性基因Gm的筛选和PCR验证,成功构建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突变菌株1-fliS及其互补菌株1-fliShb,并对所得菌株的生物学特性和鞭毛进行观察,结果表明,与野生菌株相比,鞭毛蛋白基因缺失突变菌株的游动性、菌膜形成能力减弱,互补后游动性、菌膜形成能力基本恢复;缺失突变菌株对甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果实的致病性降低,互补后对西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果实的致病力完全恢复。电镜测试显示,突变菌株鞭毛变短,长度约为野生菌株的1/3—1/4,互补后鞭毛合成能力基本恢复,鞭毛长度约为野生菌的4/5;光学显微镜下,可观察到在NA平板上的野生菌株菌落周围有明显的由细菌颤泳形成的特殊�

不同施氮处理对水稻油菜轮作土壤氮素供应与作物产量的影响2957-2968

摘要：【目的】探究不同施氮处理对水稻油菜轮作区土壤氮素养分及作物产量的影响,并重点分析不同处理在水稻油菜轮作间的差异及原因。【方法】2014—2015年在成都市典型水稻油菜轮作区进行连续两年小区定位试验,试验处理包括不施氮（CK）、单施尿素（UR）、40%控释氮肥+60%尿素（40%CRU）和单施控释氮肥（CRU）。研究不同处理对水稻油菜轮作条件下土壤无机氮、酶活性、作物产量及氮素利用率的影响。【结果】（1）相较UR处理,40%CRU处理能显著提高水稻生育中后期土壤无机氮含量;油菜蕾薹期到成熟期,土壤无机氮含量随控释氮肥添加量的增加而增大,40%CRU、CRU处理间无显著差异。（2）各施氮处理相比,在作物生育前期UR处理土壤脲酶和蛋白酶活性最高。随生育期推进,添加控释氮肥处理土壤酶活性均高于UR处理,但40%CRU、CRU处理间差异较小。两季作物相比,水稻季土壤脲酶和蛋白酶活性整体均呈升高-降低的趋势,孕穗期出现峰值;而油菜季土壤脲酶活性随生育期发展逐渐降低,添加控释氮肥处理蛋白酶活性先升高后降低。（3）水稻油菜产量均以40%CRU处理最大,两年水稻产量分别较UR处理增产597.04 kg·hm-2（2014年）和582.61 kg·hm-2（2015年）,提高了7.50%—7.83%;油菜增产391.19 kg·hm-2（2014年）和378.49 kg·hm-2（2015年）,提高了15.39%—16.70%。产量与构成因子的回归方程显示,水稻穗粒数和结实率与产量呈显著正相关,40%CRU处理穗粒数较UR处理提高15.17%（2014年）和17.72%（2015年）,结实率提高4.49%（2014年）和4.44%（2015年）。油菜产量与每角粒数和总角果数相关性显著,40%CRU处理每角粒数最多,总角果数较UR处理两年分别增加8.98%（2014年）和13.80%（2015年）。（4）施氮显著提高水稻油菜成熟期地上部分氮积累量,且均以40%CRU处理最大。相较其余施氮处理,40%CRU处理的水稻成熟期

基于Landsat OLI的绿洲灌区土壤盐度最优预测尺度分析2969-2982

摘要：【目的】基于遥感提取的多尺度遥感指示因子和土壤实测电导率数据,借助统计分析,试图探寻适合干旱区典型绿洲灌区土壤盐度变异的最佳观测尺度和指征变量,为快速评估绿洲土壤盐渍化提供备选方案。【方法】以新疆渭干河-库车河绿洲为研究区,以野外采集的土壤盐度数据(采集0—10、10—20、20—40和40—60 cm土层土样,制备土壤饱和溶液并测试电导率(ms·cm-1))并将其作为预测对象(n=87),借助Landsat OLI遥感影像数据,利用栅格重采样(30—1 000 m)和领域滤波(原始分辨率为30、60、90、120、150、180、210 m,滤波尺度为3×3至31×31)两种方式,生成多个尺度若干种指示因子(主成分分析、缨帽变化、植被指数、湿度指数),共计获得1 078个(其中,栅格重采样生成352个,领域滤波生成726个)环境变量。在此基础之上,利用线性和非线性曲线模型分别拟合上述两种模式下土壤盐度和环境变量之间的相关性,进而找出最优环境因子和预测尺度。【结果】栅格重采样模式下能够较好响应各层土壤变异性的皆为非线性模式。其次,该模式下,拟合精度随着空间分辨率的降低而降低。此模式下最佳推理尺度为30 m,该尺度下最佳响应变量除了40—60 cm处为三波段差分指数(Three-band Maximal Gradient Difference,TGDVI)外,其余深度皆为扩展的归一化指数(Extended Normalized Difference Vegetation Index,ENDVI)。领域滤波模式下的最佳推理尺度为180 m(滤波尺度3×3),同时,各层最佳拟合变量皆为扩展的增强型植被指数(Extented Enhanced Vegetation Index,EEVI)。相比较栅格重采样模式,该模式下的拟合精度全面优于前者,各层依次提高14.60%、34.40%、32.10%和21.70%。【结论】基于领域滤波模式下,像元分辨率为180 m,窗口大小为3×3的ENDVI指数更适合预测本研究区土壤盐度的空间变异性。

基于无人机载LiDAR数据的玉米涝灾灾情评估2983-2992

摘要：【目的】基于无人机平台的遥感技术是目前研究的热点,也是推动现代化农业快速发展的主要力量之一。笔者欲通过分析涝灾研究区激光雷达点云数据反演的玉米冠层高度,快速准确实现玉米涝灾受灾范围监测和灾情评估,为防灾减灾、高产稳产、农业保险理赔等提供依据。拓展无人机载LiDAR数据在农业领域的应用价值,为农业等相关部门快速有效掌握农情信息提供保障。【方法】2016年7月19—20日,以因大暴雨导致涝灾的北京市昌平区一块玉米大田作为研究区,基于无人机平台获取研究区激光雷达数据。通过冠层高度模型(canopy height model,CHM)反演出玉米冠层高度,采用正态统计理论的双阈值划分策略确定阈值,构建基于玉米冠层高度差异的涝灾灾情遥感监测模型,评价玉米涝灾灾情严重程度,并基于地面实测数据进行精度评价。【结果】涝灾发生后,玉米长势存在一定差异,最明显的差异体现在玉米植株高度。基于正态统计理论和野外测量,最终确定严重涝灾玉米冠层高度为0.30—0.84 m,中度涝灾玉米冠层高度为0.84—1.70 m,冠层高度1.70 m以上为轻度受灾区域。通过野外实测样本对无人机载LiDAR数据估算结果进行混淆矩阵分析,总体分类精度达到72.15%,Kappa系数为0.44。结合数码影像做进一步验证,结果表明研究区玉米涝灾遥感空间制图结果与数码影像结果基本一致。【结论】通过无人机载LiDAR数据能实现玉米冠层高度反演,结合涝灾后玉米植株高度差异特征能有效反映不同涝灾程度,实现区域尺度下玉米涝灾受灾范围监测和灾情等级评估,有利于便捷高效获取灾情灾害信息。

黄瓜光合特征及水分利用效率对土壤含水量的响应2993-3005

利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与梨矮生性状相关的DNA分子标记3006-3012

摘要：【目的】果树的矮生性状是一种重要的农艺性状,对果树的集约化栽培具有重要意义。来自西洋梨实生变异品种‘Le Nain Vert’的矮生性状受控于一个单显性基因Pc Dw,目前关于该基因的序列信息等还不清楚。本研究的目的是开发与其紧密连锁的DNA分子标记,为鉴定该基因提供依据。【方法】根据分离群体分组分析的原理,以‘矮生梨’ב茌梨’和‘2-3’ב绿宝石’2个F1杂交分离群体为试材,应用IIB型限制性内切酶的RAD技术(Restriction association site DNA,2b-RAD)对2对矮生型/普通型对比基因池进行基因组测序分析,在对比基因池间筛选出单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,从中筛查出位于Pc Dw定位染色体上的SNPs,用高分辨率熔解曲线分析技术(High-resolution melting analysis,HRM)在群体上进一步检测验证,以确定其与Pc Dw位点的连锁关系。【结果】对4个样本(即4个对比基因池)的2b-RAD标签测序文库的测序结果共产生67 186 260条reads,平均每个样本测序reads数为16 796 565。将原始reads进行质量过滤后的统计结果表明,每个样本获得平均unique标签数目为86 810,平均测序深度为77×,该测序深度能够达到准确分型的标准。SOAP软件定位结果表明,4个测序文库中含有酶切位点的高质量reads占测序原始reads的70%以上,表明测序质量较好。在来自2个不同群体的矮生型基因池与普通型基因池间进行对比分析,初步筛选出SNP位点1 317个,其中有8个位于PcDw的定位染色体scaffold00074上。用HRM技术对这8个SNP标记在群体上的进一步检测结果表明,在‘矮生梨’ב茌梨’群体上有2个SNP标记、在‘2-3’ב绿宝石’群体上有4个SNP标记表现出与Pc Dw位点共分离的特性,根据其扩增子的熔解曲线形状差异,可有效区分矮生型和普通型表型。在来自‘矮生梨’ב茌梨’群体的215个杂种后代和来自‘2-3’�

羟基自由基氧化对牛血清白蛋白结构及水合特性的影响3013-3023

海南特种野公猪不同世代膻味物质含量及相关性分析3024-3032

猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择3033-3041

摘要：【目的】采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对基因表达进行分析时,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中,表达稳定的蛋白编码内参基因和micro RNA(miRNA)内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因,为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期(E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM)的猪睾丸组织为材料,采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA,利用Nan Drop ND-2000分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的5个编码内参基因(GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M)以及5个miRNA内参基因(U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103)的特异性引物序列,逆转录得到cDNA模板后,按1:10梯度稀释为7个浓度梯度进行qRT-PCR反应以构建标准曲线。并对10个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测,采用Ge Norm法对定量结果进行综合分析,最后根据内参基因稳定性值(M值)的大小筛选出最稳定的参考基因;M值越小,表明内参基因的稳定性越好,反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、β-actin、SDHA、B2M、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10个候选内参基因的熔解曲线进行分析发现,均无非特异扩增及引物二聚体,说明各内参基因特异性良好,qRT-PCR反应的专一性高;以Ct值为纵坐标,相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知,各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线性关系;通过对10个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现,蛋白编码基因中,最稳定的为TBP,最不稳定的是GAPDH;miRNA候选内参中,最稳定的为U6,最不稳定的是ssc-miR-26a。【结论】成功筛选出猪睾丸组织基因表达�

基于GC/MS技术的产后卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析3042-3051

中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位3052-3062

摘要：【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位,明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至p ET-32a（+）载体并转入BL21（DE3）感受态细菌中,挑取单克隆菌落接种于LB培养基,培养过夜后按1%（V/V）进行转接,继续培养至OD600≈0.4左右时,加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清,再加入细菌裂解液超声破碎,离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化,再经PBS透析液透析后,最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm,测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用,用Scatchard方程计算其解离常数,再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbra A6晶体结构（PDB代码:1n8v）为模板,通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式,根据Mol Dock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析,获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况,以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体,并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片,然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位,以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白,利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K1-NPN为2.1μmol·L-1,结合位点数n为0.99,表明结合时基本以1:1结合,线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中,CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯（HOB）和9-羰基-2癸烯酸（9-ODA）,和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力,其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC50]和解离常数KD分别达到10.1和7.68�