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基因组学与应用生物学 2011年第04期杂志 文档列表

基因组学与应用生物学杂志研究论文

含有融合标记基因和LoxP／FRT位点的植物表达载体构建及应用257-264

摘要：本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP／FRT（LF）位点的DN段Ⅰ，利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点，去除了pCAMBIA0390左右边界T—DNA和多克隆位点之间的序列，然后连接DN段Ⅰ和载体片段，构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后，再合成含有适合在单予叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因（Bar：：gus）和水稻actin-1启动子驱动的助抗虫蛋白基因（Cry1A6）表达元件的DN段Ⅳ，在pGM323～LF—enTP的基础上，利用5以Ⅰ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar：：gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF—ABt。利用含有pGM626-LF—ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米，以草丁膦作为抗性筛选剂，非转化细胞得到了有效抑制，快速获得了转基W植株，利用GUS组织化学检测和RT—PCR分析了转基因植株中标记基因的表达，结果表明pGM626-LF—ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。

OsUgp2和otsAB基因共转化增强水稻抗旱抗寒能力265-272

摘要：本研究通过农杆菌介导的转化技术，将水稻尿苷-2磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基N（OsUgp2）与大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶／海藻糖-6-磷酸合成酶磷脂酶融合基因（otsAB）共表达载体转化水稻愈伤组织，对获得的转基因植株分别进行干旱和寒冷处理，试图明确0sUgp2和otsAB共表达是否可以进一步提高转基因水稻植株的抗胁迫能力。表型观察结果显示0sUgp2和。拈AB共表达植株（ABu）经干旱和寒冷处理后恢复生长的能力，较otsAB和OsUgp2分别过量表达的转化植株（AB和U）均有所提高。定量PCR检测结果显示：经干旱处理后，转化植株ABU中0tsAB和OsUgp2的表达量较未处理植株分别提高1．92倍和1．67倍，与转化植株AB和I中0tsAB和OsUgp2表达的增加量相近；而寒冷处理后，转化植株ABU中otsAB和OsUgp2的表达量分别增加2．68倍和2．04倍，明显高于转化植株AB和u中otsAB和OsUgp2表达的增加量。液相色谱检测结果显示：OsUgp2和otsAB共表达和单表达均可以提高转化植株中海藻糖的生物合成量，且共转化植株ABU中海藻糖的含量在干旱和寒冷处理前后均是最高的。干旱和寒冷处理后，共转化植株ABU中蔗糖含量的增加也较明显。本研究结果表明OsUgp2和otsAB共表达可以增加转基因水稻植株中海藻糖和蔗糖分子的含量，同时转基因水稻植株的抗旱和耐冷胁迫的能力也得到了一定提高。

秋茄KcRD22基因的克隆与功能分析273-280

摘要：本文以用200mmol／LNaCl处理24h后的秋茄幼苗为材料提取秋茄叶片总RNA，利用RT-PCR方法克隆获得KcRD22基因的全长cDNA，通过构建pCAMBIA-2300-KcRD22过表达载体，利用农杆菌侵染的方式获得过表达KcRD22的烟草转基因株系，并对转基因株系的耐盐性做出初步分析。实验结果显示：KcRD22基因的ORF长1131bD，编码1个等电点为9．07、分子量为39．8kD、由375个氨基酸组成的蛋白。PCR及RT—PCR鉴定结果表明，KcRD22基因已经分别整合到8株烟草的染色体中，并在两个株系中获得表达。对转基因烟草进行光合作用测定，结果显示100mmol／LNaC1处理显著降低了野生型烟草的净光合速率，而转基因植株叶片的光合作用受到的影响较小。盐浓度达到200mmol／L时，转基因植株及野生型烟草净光合速率都明显降低，但盐胁迫解除后，转基因烟草光合作用的恢复情况明显好于野生型烟草，说明KcRD22的过表达提高了烟草的抗盐性。本文初步确定了KcRD22基因对植物耐盐性的贡献，这为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的功能奠定了良好基础。

基因组学与应用生物学杂志研究报告

从烟草上分离的中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征281-287

摘要：本研究从具有典型曲叶病症状的广西靖西烟草病植株上分离到病毒分离物JX-2，全基因组序列测定结果表明，JX-2DNA．A全长2738个核苷酸，共编码6个开放阅读框架（openreadingframes，ORFs），其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs，互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。BLAST结果表明，JX-2DNA—A与中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Chinavirus，ToLCCNV）各分离物的相似性在93．0％-99．7％之间，其中与ToLCCNV广西番茄分离物ToLCCNV．G32的相似性最高，达99．7％，而与其它双生病毒的同源性均在88．0％以下，表明Jx-2是ToLCCNV的一个分离物。基于Jx-2和已报道的双生病毒属代表种DNA-A全基因组核苷酸序列构建的系统进化树显示，JX-2与ToLCCNV-G32分离物的亲缘关系最近，并与ToLCCNV其它分离物形成一个分支，而与其它10种双生病毒的亲缘关系均相对较远。利用双生病毒卫星DNAβ的特异性引物β01／β02在Jx-2样品中扩增到DNAβ分子（JX-2β），全长为1341个核苷酸，其互补链编码1个ORF（即βC1），并包含一个富含A序列和一个卫星病毒保守序列。序列分析表明，JX-2β与ToLCCNV伴随的DNAβ的相似性在91．0％～96．1％之间，其中与ToLCCNV-G61DNAβ和ToLCCNV—G18DNAβ的相似性最高（96．1％），与其它卫星DNAβ的相似性均低于61．8％。基于JX-2β全基因组核苷酸序列构建的系统进化关系树显示，JX-29与ToLCCNVG61分离物伴随的DNAβ亲缘关系最近，并形成一个独立的分支，再与ToLCCNV其余两个分离物伴随的DNAβ形成一个较大的分支。这是首次报道从烟草中分离到的中国番茄曲叶病毒及其伴随卫星DNA分子的全基因组结构特征。

体内外感染PRRSV处理下仔猪脾淋巴细胞增殖活性的变化288-293

摘要：为了探讨体内或体外感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）的仔猪脾淋巴细胞在体外培养的增殖能力，本研究将PRRSV—GXA分离株经Mare-145细胞大量增殖培养，然后体内感染仔猪，接种病毒后分别于第11天、第14天和第21天从活体猪收获脾脏，分离脾淋巴细胞后用ConA和LPS于体外进行诱导增殖。研究结果显示第11天收获的T淋巴细胞增殖能力高于对照组，而B淋巴细胞增殖能力明显下降；第14天收获的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力均极显著低于对照组；第21天收获的B淋巴细胞增殖能力略高于对照组，T淋巴细胞增殖能力略低于对照组。同时，用不同滴度的PRRSV体外感染PRRSV阴性的猪脾淋巴细胞，经ConA和LPS诱导增殖后，发现病毒滴度在10^3-10^6TCID50/mL范围内，能明显提高脾淋巴细胞的体外增殖能力；而病毒滴度在10^0-10^2TCID50/mL范围时，脾淋巴细胞增殖能力低于对照组。本研究结果说明PRRSV体内或体外感染对仔猪脾淋巴细胞增殖活性均有显著的影响，将为临床上PRRS的综合防治提供理论依据。

不同精子处理对应用ICSI—Tr技术生产转基因水牛胚胎效率的影响294-299

摘要：本文主要探讨了不同精子处理对应用显微授精介导（intracytoplasmic sperm injection-mediatedtrans-genesis，ICSI-Tr）生产转基因水牛胚胎效率的影响。本试验以p18T—BCN5．2-IFN-1．1pA—EGFP为载体，比较了精子的不同处理方式（NaOH和冻融）、NaOH处理精子不同时间（5min，10min，20min，30min和60minl以及不同外源DNA浓度（5ng／μL，10ng／μL，25ng／μL和50ng／μL）对ICSI-Tr转基因效率的影响。结果显示：NaOH处理组的囊胚EGFP表达率（46．1％），与冻融精子处理组（47．1％1差异不显著，但发育率显著高于冻融处理精子组（28．3％VS16．7％，P〈0．05）。处理60min组和30min组的分裂率分别为78．9％和77．5％，显著高于20min、10min和5min组的64．0％、60．0％和64．0％（P〈0．05），其中30min处理组的囊胚EGFP表达率高达44．4％，显著高于其它处理组（P〈0．05）。25ng／μL组和50ng／μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著（41．3％VS42．5％），但显著高于5ng／肚组和10ng／μL组（22．5％和35．5％），25ng／μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其它组（P〈0．05）。本研究优化了应用ICSI-Tr生产转基因水牛胚胎技术体系，为获得ICSI-Tr转基因水牛奠定了良好的工作基础。

乙肝病毒RNA复制子疫苗与DNA疫苗对小鼠免疫效率的比较300-304

摘要：为建立并获取更有效的乙肝疫苗，本实验通过将所构建的HBVRNA复制子疫苗和DNA疫苗分别免疫小鼠，检测细胞免疫与体液免疫的效果。结果表明，以pSFV为基础构建的疫苗载体免疫小鼠后采集的血清中抗体效价不随免疫剂量的增加而提高，在较低剂量免疫的时候，RNA复制子疫苗所产生的抗体效价优于DNA疫苗。并且RNA复制子疫苗在以较低剂量免疫后脾细胞CTL活性高于DNA疫苗。本研究证明HBVRNA疫苗比DNA疫苗表达效果更好，安全性更高，更具有应用前景。

肠道沙门菌O：4（B）菌群脉冲场凝胶电泳分子分型305-310

摘要：为了明确2010年食源性疾病监测中分离的肠道沙门菌O：4（B）菌群的PFGE分子型别，探讨其多态性及其与分子流行病学关系，我们将分离获得的29株O：4（B）血清型沙门菌进一步鉴定培养，挑取单个菌落增菌，供试菌株基因组DNA用限制性内切酶xbaI消化酶切后进行脉冲场凝胶电泳分型，所得结果用Bionumerics5．1软件进行聚类分析。实验结果表明，根据电泳指纹图谱，可将29株肠道沙门菌O：4（B）菌群分为24个PFGE型别，菌株间的相似值在56.31％～100％之间，同一血清型别的沙门菌有多个PFGE型别。脉冲场凝胶电泳对O：4（B）群沙门菌有较高的分型能力，可有效的应用于食物中沙门菌溯源分析及分子流行病学研有。

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达311-315

摘要：亲环蛋白（cyclophilin，CyP）是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白，是刚地弓形虫（Toxoplasmngondii）速殖子的主要成分，能够诱导产生IL-12和IFN-γ，在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用。本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列，设计并合成一对包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物，以cDNA为模板，应用PCR技术扩增TgCyP基因。PCR产物连接到pMD18-T克隆载体。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切克隆载体，将TgCyP目的基因克隆到载体pVAXI，构建真核表达质粒pVAXl-TgCyP。将真核表达质粒转染Hela细胞，利用问接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况。结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列（U04633．1）的一致性达100％，构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达，其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性。本研究表明Tg-CyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原，将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础。

镜鲤体重的QTL定位316-324

摘要：本研究利用217个微卫星标记和336个SNPs标记对德国镜鲤F2代68个个体基因组DNA进行基因型检测。其中507个标记共组成62个连锁群，覆盖基因组总长度为2805．85cM，标记问平均距离为6-31cM；利用软件MapQTL4．0采用区间作图法对体重性状进行QTL定位分析。研究结果共检测到14个与体重性状有关的QTLs，分布于9个连锁群。其中BIV-5-J有最大的LOD值，为4．46；BIV—I-1的LOD值最小，为2．25。单个QTL平均解释表型变异介于14．10％～45．50％之间，其中贡献率大于20％的主效QTLs有9个。通过BLASTX与斑马鱼蛋白质序列数据库进行序列比对，找到了与斑马鱼酰基辅酶A脱氢酶蛋白、胰淀粉酶仅2蛋白、Apoebprotein和甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白同源的分子标记。本研究结果对分子标记辅助育种具有重要应用价值。

Call for papers--Legume Genomics and Genetics （ISSN 1925-1580）324-324

人胰高血糖素样肽1在转基因番茄中的表达325-330

摘要：人胰高血糖素样肽1（GLP1）是一种短肽激素，对Ⅱ型糖尿病具有很好的疗效。本研究在设计合成GLP1基因并构建植物表达载体的基础上，通过农杆菌介导将GLP1基因导入番茄基因组中，经过PCR扩增和Southern Blot分析，证实GLP1基因已整合进入9个株系的番茄基因组中。Western Blot检测表明，其中4个株系转基因番茄的叶片能够检测到hGLP1融合蛋白的表达。通过Ni—NTA亲和层析分离纯化转基因番茄表达的hGLP1融合蛋白，动物实验表明该融合蛋白具有显著的降血糖生物活性。本研究结果将为转基因番茄作为生物反应器表达药用蛋白提供重要的理论和技术支持，并将为培育具有糖尿病治疗功能的番茄新品种奠定基础。

植物乳杆菌C88胞外多糖生物合成基因的克隆及序列比对331-337

摘要：乳酸菌胞外多糖能显著改善发酵乳制品及食品的流变学和质构特性。为进一步了解乳酸菌胞外多糖的生物合成途径及调控机制，本研究对参与植物乳杆菌C88胞外多糖生物合成基因簇的部分序列进行了克隆和鉴定。根据GenBank中己报道植物乳杆菌基因序列的保守区域设计特异性引物，扩增出植物乳杆菌C88生物合成蛋白基因（cps4A）序列，并通过染色体步移方法克隆了植物乳杆菌C88参与胞外多糖合成基因簇的部分序列（4．9kb）。利用生物信息学方法预测基因簇中6个阅读框的结构和功能，结果表明该序列与己报道的乳酸杆菌胞外多糖生物合成基因具有高度的同源性（〉96％）；对各阅读框功能预测分析发现，这6个基因主要编码参与胞外多糖合成中的多糖合成蛋白、糖链长度检测蛋白、UDP-葡萄糖-4-异构酶和糖基转移酶。本研究将为利用基因工程方法调控多糖的合成和产量提供理论依据。

番茄钙依赖性蛋白激酶基因LeCPK2在热（光）胁迫中的功能鉴定338-345

摘要：钙依赖性蛋白激酶（calcium—dependent protein kinases，CDPKsorCPKs）作为一类钙感知蛋白在植物的生长发育和胁迫应答中起着重要的作用。LeCPK2（Gen Bankaccession No．：GQ205414）是我们从番茄中分离的第3个CDPK基因，前期研究表明LeCPK2可能在植物热胁迫应答中发挥作用。为了进一步研究其在热胁迫中的功能，我们通过电子克隆的方法分离了LeCPK2的启动子序列，并通过LeCPK2过表达烟草分析其在高温胁迫中的潜在的功能。生物信息学分析显示，LeCPK2启动子中包含5个热响应元件，和前期试验结果一致。野生型植株在受到热胁迫后，对光更为敏感，强光照下植株叶片发生萎蔫，而强光本身不会对未受热胁迫的健康植株造成伤害。LeCPK2转基因植株热、光胁迫后不会出现受害表型。以上研究表明，LeCPK2在植物的热胁迫应答中发挥重要作用，能够有效保护植株免受高温胁迫的损害，是一个优秀的耐热（光）基因。本研究将为揭示番茄LeCPK2遗传功能及对其开发利用奠定基础。

水稻钾离子通道基因OsKAT1．17的克隆、表达载体的构建及其电生理功能346-351

摘要：K^＋通道是植物高效吸收和体内运输K^＋的载体，对保证植物的钾素营养和增强抗逆性具有重要意义。水稻生长在淹水环境中，其U通道在长期适应物种立地条件的进化过程中可能形成了有别于拟南芥等模式植物的独特功能特征和作用机制。本研究克隆了一个水稻KAT型科通道基因OsKAT1．1，并利用电生理技术探讨其电生理功能。研究结果表明，通过一系列亚克隆过程，我们成功构建了适用于双电极电压钳和膜片钳电生理研究的表达载体pCI．OsKAT1．1和pTracer．CMV3-OsKAT1．1。进一步的电生理试验结果验证了构建过程的准确性，并表明水稻OsKAT1．1是一个由膜电位控制的吸收型艮通道。

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离352-358

摘要：由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一，水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况，本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA，构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明，克隆的外源DNA随机性良好，克隆的最小片段为27．7kb，最大为58．5kb，平均大小为39．9kb，文库克隆容量约为2．8×10^3Mb，该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针，通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析，得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在，有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量，为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。

陆地棉GhSUMO基因的克隆与黄萎病菌诱导表达分析359-364

摘要：SUMO化修饰与植物抗病防御、信号转导和耐旱等有着直接的关系。本文以抑制差减杂交（sup—pression subtractive hybridization．SSH）技术获得SUMO的EST为信息探针，对棉花EST数据库进行同源搜索和电子克隆，获得了全长为396bp的SUMO基因编码区cDNA全长，我们将该基因命名为GhSUMO，推测该基因编码95个氨基酸。分别以抗黄萎病陆地棉品种豫棉21号的cDNA和DNA为模板，对该基因进行了PCR扩增验证，测序结果表明，GhSUMO基因序列与电子克隆序列一致，且没有内含子。蛋白序列分析表明，该蛋白具有保守泛素结构域和C端双Gly的断裂／连接位点，以及保守的疏水表面和Ulpl—Smt3互作位点。系统进化分析表明，该蛋白与蓖麻的同源序列表现了最高的相似性，与其它双子叶植物同源序列次之，而与单子叶植物的相似性较低。棉苗接菌后实时定量PCR结果显示，该基因表达量在接黄萎病菌的量48h后明显上调，96h达到未接菌对照的5倍以上。GhsSUMO基因可受黄萎病菌诱导表达，表明该基因在陆地棉抗黄萎病的机制中可能发挥重要作用。

3种接种方法对十字花科黑腐病菌Xcc8004菌株在拟南芥Col-0上致病力的影响365-370

摘要：十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar carnpestris，Xcc）是引起十字花科植物黑腐病的病原菌，也是研究寄主与病原微生物相互作用分子机理的模式菌之一。Xcc可以感染白菜、萝卜和甘蓝等十字花科农作物，也可以感染重要的模式植物拟南芥（AroJoidopsisthaliana）。由于拟南芥的全基因组测序已经完成，因此，拟南芥是研究寄主植物对Xcc浸染的防卫反应的分子机理的最理想的寄主材料。但是，到现在为止，一套完善的在拟南芥上进行xcc致病检测的实验系统还没有建立。为此，本研究比较了“叶片压渗法”、“剪叶法”和“叶片中脉穿刺法”这3种常用的病原细菌接种方法对Xcc的实验室菌株8004f以下简称Xcc8004）在哥伦比亚生态型拟南芥似．thanlianaecoype Colombia0，Col-0）上的致病力的影响。结果发现，在拟南芥Col-0叶片上用“叶片压渗法”接种Xcc8004可以引起明显致病症状，而用“剪叶法”和“叶片中脉穿刺法”接种均不能引起病症。这一结果说明，不同的接种方法的对Xcc在拟南芥上的致病力有很大的影响。因此，要在拟南芥Col-0上进行Xcc8004的致病力检测，本研究建议采用“叶片压渗法”而不用“剪叶法’和“叶片中脉穿刺法”。此外，本研究还建立了一套简易的拟南芥试验用苗的栽培方法。