单细胞生物起源篇（1）

单倍体的和卵细胞通过受精作用可以恢复为二倍体。减数分裂过程中四分体中的非姐妹染色单体的部分片段发生交换、非同源染色体自由组合，使得配子的遗传多样化，增加了后代的适应性，因此减数分裂不仅是保证生物种染色体数目稳定的机制，同且也是物种适应环境变化不断进化的机制。

有丝分裂和减数分裂既有区别又有联系，怎样使学生在这里既能把握联系又能区分不同呢？结合课堂教学实践，应该从以下方面入手：

1 如何快速根据图像判定有丝分裂和减数分裂的时期

1.1 根据染色体行为判断细胞分裂时期

首先，如果发现染色体无规律分布，则为前期。

其次，如果发现染色体排列在中央，则为中期。

最后，如果发现染色体移向两极，则为后期。

1.2 根据染色体数目判断细胞分裂方式

首先看染色体的数目：奇数的话一定是减数第二次分裂（但是减数第二次分裂期染色体数目不一定为奇数），否则可能是有丝分裂或者减数第一次分裂。

其次看有无同源染色体：有的话一定不是减数第二次分裂。

最后如果有同源染色体，看同源染色体的行为。如果有联会、四分体存在则一定是减数第一次分裂。反之则为有丝分裂。

2 有丝分裂和减数分裂的理论区别

首先，减数分裂过程中细胞连续分裂两次，而有丝分裂过程中细胞只分裂一次。

其次，减数分裂的结果是染色体数目减半，而有丝分裂的结果是染色体数目不变。

再次，减数分裂后，一个细胞变为四个含有不同遗传物质组合的子细胞（考虑四分体中非姐妹染色单体片段交换）。或者两两相同的子细胞（不考虑单体片段交换）。而有丝分裂后，一个细胞只形成两个遗传物质相同的子细胞。

第四，减数分裂过程中有其特有的同源染色体配对和同源非姐妹染色单体间的局部交换，而有丝分裂则没有。

最后，减数分裂发生部位为或者精巢和卵巢，有丝分裂发生部位为体细胞（但是原始生殖细胞即性原细胞发生增殖时属于有丝分裂）。

3 有丝分裂和减数分裂的生物学意义区别

3.1 有丝分裂的生物学意义：细胞有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去。由于染色体上有遗传物质，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。有丝分裂的目的是细胞增殖，即细胞数量的增加。对于单细胞生物体，细胞分裂意味着生物个体数的增加。多细胞生物体的生殖活动也是通过细胞分裂完成的。对于多细胞生物体，细胞分裂则是生物体生长发育的基础。细胞分裂保证了细胞有足够大的表面积与环境进行物质交换，从而保证了新陈代谢对物质更新的需求。因此细胞分裂是生物体生长、发育和繁殖的基础。

3.2 减数分裂的生物学意义：减数分裂是遗传学的基础。其目的是产生成熟的生殖细胞。具体表现在：

3.2.1 基因分离律的细胞学基础：在减第一次分裂过程中，因为同源染色体分离，分别进入不同的子细胞，故在子细胞中只具有每对同源染色体中的一条染色体。减数分裂中同源染色体的分离，正是基因分离律的细胞学基础。

3.2.2 基因连锁和互换的细胞学基础：同源染色体联会时，非姐妹染色单体之间对称的位置上可能发生片段交换，也就是父源和母源染色体之间发生遗传物质的交换。这种交换可使染色体上连锁在一起的基因发生重组，这就是染色体上基因连锁和互换的细胞学基础。

3.2.3 配子的遗传基础多样化：由于减数分裂，使每种生物代代都能够保持二倍体的染色体数目。在减数分裂过程中非同源染色体重新组合，同源染色体间发生部分交换，结果使配子的遗传基础多样化，使后代对环境条件的变化有更大的适应性。

4 有丝分裂和减数分裂的种类区别

4.1 有丝分裂的类型：出现纺锤丝的细胞分裂均可看作是有丝分裂。所以减数分裂也是一种特殊的有丝分裂。

4.2 减数分裂可分为三种主要类型

4.2.1 配子减数分裂：配子减数分裂，也叫终端减数分裂，其特点是减数分裂和配子的发生紧密联系在一起。在雄性脊椎动物中，一个精原细胞变为初级精母细胞后减数分裂为2个次级精母细胞，2个次级精母细胞又一次进行减数分裂，总共形成4个精细胞。精细胞在经过一系列的变态发育，形成成熟的。在雌性脊椎动物中，一个卵母细胞经过减数分裂形成1个极体和1个次级卵细胞，次级卵细胞再分裂形成一个卵细胞和一个极体，极体也分裂为两个极体，总共形成一个卵细胞和三个极体。

4.2.2 孢子减数分裂：孢子减数分裂，也叫中间减数分裂，（居间减数分裂）见于植物和某些藻类。其特点是减数分裂和配子发生没有直接的关系，减数分裂的结果是形成单倍体的配子体（小孢子和大孢子）。小孢子再经过两次有丝分裂形成包含一个营养核和两个雄配子（）的成熟花粉（雄配子体），大孢子经过三次有丝分裂形成胚囊（雌配子体），内含一个卵核、两个极核、3个反足细胞和两个助细胞。

4.2.3 合子减数分裂：合子减数分裂，也叫初始减数分裂，仅见于真菌和某些原核生物，减数分裂发生于合子形成之后，形成单倍体的孢子，孢子通过有丝分裂产生新的单倍体后代。此外某些生物还具有体细胞减数分裂现象，如在蚊子幼虫的肠道中，有一些由核内有丝分裂形成的多倍体细胞，在蛹期又通过减数分裂降低了染色体倍性，增加了细胞数目。减数分裂由紧密连接的两次分裂构成。通常减数第一次分裂分离的是同源染色体，所以称为异型分裂或减数分裂。减数第二次分裂分离的是姊妹染色体，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂或均等分裂。

5 有丝分裂和减数分裂的相同点及联系

5.1 DNA分子的数量计算都相同：其一，有染色单体时，DNA数等于染色单体数。其二，无染色单体时，DNA数等于染色体数。

5.2 染色体数的计算都相同：染色体数等于着丝点数。

单细胞生物起源篇（2）

    2 DC与AS的关系1995年,Bobryshev等[1]在无AS组织学证据的人主动脉和颈动脉内膜中,发现一种具有与其他部位 DC类似超微结构及形态的DC亚群——血管树突状细胞（vascular dendritic cell,VDC）。它与血管内膜下T淋巴细胞及与遍布定居于动脉内膜的巨噬细胞共同构成血管相关性淋巴组织（vascular|associated 1ymphoid tissue,VALT）；后者与存在于呼吸道及消化道中的粘膜相关性淋巴组织类似,对血管组织中有害的内源性或外源性物质进行免疫监视[2]。

单细胞生物起源篇（3）

一、在细胞分裂间期染色体经过复制后，染色体和DNA的数目都增加一倍

辨析：在细胞分裂间期，用光学显微镜观察细胞核内的染色体，它似乎是静止的，实际上细胞核内部正在完成组成染色体的DNA分子的复制和有关蛋白质的合成。染色体复制的结果是每个染色体都形成了两个完全一样的姐妹染色单体，但由一个共同的着丝点连接着，每个染色体只含有一个着丝点，计算染色体的数目时，以着丝点为单位。所以在细胞分裂间期染色体复制的结果是DNA数量加倍，而染色体数目不变。需要重点强调的是染色体数目加倍发生在细胞分裂的后期，着丝点一分为二时，由一个着丝点相连的两条姐妹染色单体彼此分离后形成了两条子染色体。

二、在细胞分裂前期出现的纺锤丝都附着在染色体上

辨析：纺锤丝是细胞在分裂前期出现的丝状结构，从细胞两极发出后形成一个梭行的纺锤体。在细胞内的纺锤丝有两种类型：一类丝一端与染色体的着丝点相连，另一端向极的方向延伸，称为染色体牵丝。另一类丝并不与染色体相连，而是从一极直接延伸到另一极，称为连续丝。染色体是在染色体牵丝的牵引下，向着细胞的两极移动。

三、赤道板和细胞板都是细胞分裂中真实存在的物质结构

辨析：在细胞分裂中期，每条染色体的着丝点的两侧，都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体运动，使每条染色体的着丝点排列在细胞中央的一个平面上，这个平面与纺锤体的中轴相垂直，类似于地球上赤道的位置，所以叫赤道板。赤道板只是类似地球赤道位置的空间，此板是不存在的，是非物质的，是人们在研究细胞分裂时假象的一个平面。相反，细胞板是细胞在分裂末期在赤道板的位置形成的真实存在的结构，最后会发展成细胞壁在光学显微镜下能够看见。

四、细胞在分裂后期，着丝点的分开是纺锤丝牵拉所致

辨析：在细胞分裂后期，着丝点一分为二，两条姐妹染色单体分开后成为两条染色体，纺锤丝把两条染色体拉向细胞两极。但是着丝点的分裂并非纺锤丝牵拉所致。从染色体的结构可见，染色体上的主缢痕部位是着丝粒，它的两侧为着丝点，这是染色体上不可缺少的部分。着丝粒是指有丝分裂过程中姐妹染色单体在前期时连接，后期时分离的一段非编码DNA区域。在分裂前期和中期，着丝粒把两个姐妹染色单体连在一起，到后期产生两个着丝粒，随后姐妹染色单体分开。而着丝点位于着丝粒两侧，各由一个蛋白质构成的三层盘状或球状结构，与纺锤体的纺锤丝连接，与染色体的移动有关。所以着丝点的分开并非由纺锤丝的牵拉所致，即使没有纺锤丝存在时，着丝点也可以一分为二。

五、减数第二次分裂整个过程中，染色体的变化特点与有丝分裂完全相同，它完全是一次普通的有丝分裂

辨析：有丝分裂的重要特点之一，是一条染色体上的两条姐妹染色单体在后期分离后形成两条子染色体分别进入不同的子细胞，在这一点上，减数第二次分裂的结果与有丝分裂是相同的。但是，对于二倍体生物来说，有丝分裂产生的子细胞内有成对的同源染色体，而减数第一次分裂之后，由于同源染色体彼此分离，成对的同源染色体就分别进入不同的子细胞中，所以次级精（卵）母细胞中不存在成对的同源染色体。因此，在减数第二次分裂过程中和产生的精（卵）细胞中是没有成对的同源染色体的，所以减数第二次分裂绝不是一次普通的有丝分裂，只能说类似于普通的有丝分裂。

六、生殖细胞的产生必须通过减数分裂

辨析：生殖细胞是指生物借以繁殖下一代的细胞，如、卵细胞、孢子等。进行有性生殖的生物，产生生殖细胞时，大多是经过减数分裂；但也有例外的，如高等植物的、卵细胞的最后形成都是有丝分裂，还有进行无性生殖的生物，如根霉、青霉等，它们产生的孢子也属于生殖细胞的一种，但无性别之分，叫无性生殖细胞，是通过有丝分裂产生的，不需经过两性生殖细胞的结合就可直接形成新个体。可见，生物的生殖细胞有通过减数分裂产生的，也有通过有丝分裂产生的

七、有丝分裂产生的体细胞中染色体都是以成对的同源染色体存在，而减数分裂产生的生殖细胞中的染色体都是以非同源染色体存在

辨析：在一般情况下（对于二倍体生物来说），有丝分裂产生的体细胞中染色体都是以成对的同源染色体存在，而减数分裂产生的生殖细胞中的染色体都是以非同源染色体存在。但也有例外的，如蜜蜂、蚂蚁等，它们的雄性个体（雄蜂、雄蚁）都是由未受精的卵细胞发育而来，通过孤雌生殖产生的单倍体生物，其细胞中无同源染色体存在，所以，它们有丝分裂产生的体细胞中也无同源染色体存在。而多倍体生物同源的染色体就有多个，如马铃薯是同源四倍体，体细胞中同源染色体就有四个，经过减数分裂形成的生殖细胞中也有同源染色体存在。

单细胞生物起源篇（4）

慢性心力衰竭(chronic heart failure，chf)患者循环中炎性细胞因子明显升高，证实其体内存在着系统性炎症反应。除心肌细胞外，白细胞、血小板、组织巨噬细胞、内皮细胞等其他组织细胞促成这一炎症反应，其不但引起心肌损害，导致chf的发生和发展，并且造成其他组织器官功能障碍，从而导致恶病质、贫血、内皮障碍等chf心脏外方面的改变。

一、chf循环中炎症介质的水平

已经证实chf循环中炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子仅(tumor necrosis factor α， tnf-α)、白介素1p(interleukin，il-1α)、白介素(il-6)以及化学因子，如单核细胞趋化肽-1(monocyte chemoattractant peptide，mcp-1)、白介素8(il-8)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein，mip-1α)等升高，在chf发生发展过程中起到重要作用，而抗炎性细胞因子如白介素10(il-10)无相应升高，因此产生炎症反应的净效应。白介素10能够抑制白介素1β和白介素6基因表达，在chf免疫功能调节中起着重要作用。循环炎性细胞因子和化学因子水平与心功能nyha分级和左室射血分数(lvef)显著相关，并与患者预后相关。solvd研究中，血浆tnf-α<6.5pg/ ml的患者较tnf-α>6.5pg/ml的患者预后好。

二、炎症反应的来源

(一)心肌组织

chf升高的炎症细胞因子反应不同组织和细胞的免疫激活和释放。心肌组织是重要来源。黏附分子(adhesion molecules)、tnf-α和il-6相关的细胞因子等在衰竭心肌表达增强，而炎性细胞因子的释放并非与心肌细胞的坏死或凋亡相关，在心肌缺血或急、慢性室壁牵张作用下心肌细胞合成和分泌炎性细胞因子。不只是心肌细胞，内皮细胞和成纤维细胞等也可产生和释放炎性细胞因子。心肌局部产生的炎症因子不但以自分泌或旁分泌方式发挥作用，还进入循环发挥“内分泌”样作用。

(二)循环中白细胞

chf患者由于组织低灌注导致外周血单核细胞(如t细胞，b细胞，nk细胞和单核细胞)炎性细胞因子的表达和释放增加。研究表明单核细胞促进chf系统性炎症反应，而最近研究表明t细胞可能是炎性细胞因子更重要的来源。

(三)血小板

激活的血小板产生和释放炎症介质，导致邻近白细胞和内皮细胞的炎症应答，后者释放的炎症介质可反过来再作用于血小板使其激活，从而形成血小板介导的炎症反应环在chf时发挥作用。

(四)内皮细胞

chf内皮细胞的激活可能继发于氧化应激和炎症反应，而内皮细胞不适当的激活反过来增强炎症介质的表达，如化学因子il-8、mcp-1、黏附分子和环氧化酶2(cox2)，进而促进白细胞.内皮细胞问的相互作用和系统性炎症反应。

(五)肺脏、肝脏和组织巨噬细胞

由于多个器官参与chf，其他心脏外器官也可能成为炎症因子的来源。肺脏是 chf病理过程和症状的中心器官，临床和基础实验发现chf时肺脏il-6和mcp-1等细胞因子表达增强，肺血管内皮细胞亦可能是炎症介质的重要来源之一。aker等起搏诱发兔心衰的实验中发现肝脏释放tnf-α增加。虽然单核细胞已被证实是炎症因子的重要来源，肺脏和肝脏中的组织巨噬细胞可能更重要。另外，其他一些器官如中枢神经系统的上丘脑也可能产生炎症因子。但是，不管炎症介质的来源如何，炎症反应状态与引起chf的原发疾病无关，表明炎症反应是chf中普遍存在病理特征。

三、炎症反应的发生机制

虽然已明确chf时存在持续的系统性炎症反应，但引起炎症反应的原因尚不清楚，可能存在以下机制。

(一)血流动力学改变和氧化应激

首先，心室前、后负荷加重和剪切力能诱导细胞因子表达。其次，缺血和缺氧可能诱导某些炎症因子的产生。最后，氧化低密度脂蛋白胆固醇增加内皮细胞和心肌细胞细胞因子的表达，这在冠心病心衰时尤为重要。

(二)toll样受体(toll-like receptors，tlrs)

tlrs为模式识别受体，是对各种微生物起始免疫反应的重要成分。刺激tlrs后开始一系列复杂的免疫应答，包括产生细胞因子和化学因子以及免疫细胞问的相互作用等。最近发现tlrs也参与chf时的炎症反应。急性心肌梗死后心力衰竭时心肌细胞 tlr4被激活，更广泛tlrs的激活可能参与扩张型心肌病(idcm)时感染、组织损伤和自身免疫间的相互作用。并且，血管内皮细胞受到炎性细胞因子刺激后表达高水平 tlr2和tlr4，表明tlrs参与chf时内皮细胞相关的炎症反应。重要的是，不仅微生物能刺激tlrs，损伤或应激细胞释放的成分(如热休克蛋白和ros)同样能激活 tlrs，因此，不论是感染还是非感染因素参与，tlrs均能够促进chf的炎症反应。

(三)微生物抗原

自身免疫和各种微生物在扩张型心肌病的发病中起到重要作用，这些作用同样在 chf时导致持续的炎症反应状态。某些微生物的感染(如肺炎衣原体和巨细胞病毒)可能参与动脉粥样硬化的发病机制，而微生物抗原可介导心肌细胞损伤，微生物抗原的刺激造成细胞因子的活化与释放。然而，尚无证据表明chf炎症反应与某一特定病原微生物相关，任何反复的病原学感染都会促成或增强系统性炎症反应。

(四)内毒素假说

chf水肿时内毒素可从消化道漏出，触发免疫炎症反应，而利尿消肿治疗可降低内毒素水平。假如内毒素是chf中炎症反应的主要机制，将首先激活单核细胞。然而发现chf时单核细胞仅表现轻度的激活和细胞因子表达，这与内毒素假说相悖，但这可能反映了单核细胞的脱敏状态。kupffer细胞在败血症炎症反应中起重要作用，在chf时与内毒素假说高度相关。kupffer细胞既对lps起清除和解毒作用，又对lps应答产生炎症介质。

四、炎症反应的结果

炎性细胞因子tnfα、il-1和mcp-1等可直接刺激心肌细胞引起肥大，并通过基因调节，使基质金属蛋白酶含量增加，进而加快降解心肌细胞外基质的胶原蛋白致心室重塑，心肌细胞肥大、凋亡和纤维化，进而导致chf。但是炎症反应还可导致其他组织器官的损害，形成chf综合征其他方面的表现。

(一)内皮功能异常

不但导致心肌功能受损，并可减少其他器官灌注，使运动耐量减低和肝功能异常等。炎性细胞因子可通过几种途径损害内皮功能：首先，增强内皮细胞表达黏附分子和炎性细胞因子，这可再增强血管壁的炎症反应，其次，改变内源性血管舒张因子和血管收缩因子间的平衡，导致血管收缩；再次，tnfα超家族直接造成内皮细胞凋亡；最后，刺激产生活性氧(ros)，激活系列氧化还原信号途径，造成内皮损伤。

(二)心源性恶病质

chf时存在多脏器受累，包括心脏、胃肠道、肾脏和骨骼肌系统，导致食欲减低、体重下降、肌肉和脂肪减少、肝脏糖脂代谢异常，肌肉与其他脏器进行性消瘦与萎缩是心源性恶病质的标志。恶病质是多种细胞因子、神经肽、应激激素和代谢中间产物间相互作用的结果。tnfα曾被称为恶病质素，因此炎症反应在心源性恶病质的发病机制中起的关键作用不言而喻。tnfet、il-1和il-6参与蛋白水解、脂代谢异常、肌肉萎缩、肌细胞凋亡和体重减轻。tnfα增加血浆瘦素(1eptin)水平，导致食欲下降和静息能量消耗增加。恶液质的消耗累及多种组织成分，不但与神经激素异常有关，还与异常的炎症反应相关。

(三)贫血

chf时经常发生贫血，促进chf进展和活动耐量受损和疲劳等临床症状。贫血是 chf不良预后独立的预测因子。许多可能的原因导致贫血，如骨髓抑制，肠道铁摄取减少，血液稀释，炎性细胞因子通过多种途径参与上述作用。已发现tnfα、il-1和 il-6等能够干扰肾脏红细胞生成素的产生，并干扰红细胞生成素的活性，导致epo抵抗，而且可能通过促使起源祖细胞凋亡等途径直接抑制骨髓红细胞生成。另外，炎性因子尤其是il-6诱导肝细胞产生抗菌多肽(hepcidin)抑制巨噬细胞的铁释放和肠道铁吸收，导致铁缺乏，使贫血发生。

(四)炎症与神经激素的相互作用

单细胞生物起源篇（5）

2?1 AS斑块内DC的定位、定量研究在正常主动脉不易发生AS的部位,DC少量散在分布于内膜下层；而在承受血液涡流压力较大而易于发生AS的部位,早期VEC受损可引起血循环中单核细胞趋化至血管内膜下并分化为单核细胞源性DC；后者与T淋巴细胞、单核／巨噬细胞等簇集,提示,在AS早期,DC即可通过参与捕获及递呈局部抗原参与动脉壁免疫炎症反应。对颈动脉AS斑块进展不同阶段（起始病变期、稳定斑块进展期及不稳定斑块进展晚期） 的病理标本进行免疫组化分析发现,进展期斑块内DC显著多于起始期斑块内DC,其DC更多地呈现出成熟形态。而与稳定斑块相比,晚期不稳定斑决内DC显著增多，并簇集在斑块易破裂部位,其细胞表面高度表达人类白细胞抗原DR（HLA－DR）并与T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、VSMC及泡沫细胞等多种炎症介质细胞相互作用。提示,在发生AS的动脉壁中,DC可能通过启动斑块局部的免疫炎症反应,促进 AS的病理进展,最终引起斑块破裂[3]。研究发现,与正常对照相比,不稳定型心绞痛（UAP）患者AS斑块内 DC细胞表面共刺激分子CD86表达上调,其激活T淋巴细胞增殖并分泌细胞因子的功能亦显著增强[4]；在急性缺血综合征患者AS斑块中；DC数量显著增加，并高表达HLA-DR,簇集在AS斑块的易破裂部位与T及NK细胞作用[3],而AS支架植入术后再狭窄斑块中DC亦显著多于初始AS斑块内DC[5]。

2?2 DC在AS病理进展中的激活及其病理意义参与AS病理发生、发展的多种致病因素,可激活动脉内膜中的DC,后者在局部摄取和递呈异物抗原,同时表达粘附分子及T淋巴细胞共刺激分子而活化T淋巴细胞,进而损伤VEC,激活单核／巨噬细胞及VSMC产生炎性细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）等,从而启动AS的免疫炎症反应。研究发现,缺氧、肿瘤坏死因子α（TNF－α）以及抑制VEC内NO合酶,均可促进AS早期DC粘附至VEC并趋化至内膜下[6],而AS局部低密度脂蛋白（LDL）氧化产物尤其是氧化型LDL（ox－LDL）的沉积,不仅促进DC与VEC的粘附；而且还可作为自身抗原刺激局部产生抗ox－LDL抗体,促进单核细胞源性DC分化成熟，并激活T淋巴细胞；参与AS局部免疫炎症病变[7]。此外,晚期AS斑块内多种细胞产生热体克蛋白HSP70,可诱导局部未成熟DC表达抗原递呈分子HLA－DR、CD1a及T淋巴细胞共刺激分子而分化成熟,进而激活局部T淋巴细胞[8]；而趋化至内膜下的单核细胞在分化为DC过程中,伴有补体成分Clq表达,因而可能在局部“捕获”免疫复合物而促进 AS的免疫炎症反应[9]。糖尿病患者发生AS早于无糖尿病的正常人群,且其AS病理进展亦明显增快,即所谓加速性AS。体外研究发现,高浓度葡萄糖可促进 DC分化成熟及激活T淋巴细胞[10]；而长期高血糖经体内糖基化反应生成的晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products,AGEs）,可以正反馈方式上调DC表面AGE受体—RAGE的表达,进而通过后者介导诱导DC分化成熟,并增强DC激活T淋巴细胞增殖及分泌细胞因子的能力,加速AS的免疫炎症反应[11]。此外,尼古丁可诱导DC分化成熟,增强其刺激T淋巴细胞增殖、活化的能力,并促进DC募集至AS病灶局部,从而促进AS的病理进展[12]。活化的血小板亦可促进单核细胞源性DC分化成熟及内皮下趋化[13],而AS局部 DC可表达5-脂氧合酶（5-lipoxygenase）,进而通过花生四烯酸代谢途径产生炎症介质白三烯,后者以自分泌或旁分泌方式参与DC启动的免疫炎症反应[14]。

3 DC在AS治疗中的意义研究发现,他汀类药物除通过调脂作用外；还可以非调脂机制延缓AS的病理进展,这可能部分归因于其对AS斑块局部免疫炎症的调节作用。一方面,他汀类药物可降低LDL|C，升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL|C）与载脂蛋白-AI（apoA-Ⅰ）血清浓度,而apoA－Ⅰ可在体外抑制单核细胞源性DC分化成熟；并减弱 DC与NK细胞的相互作用[15]；另一方面,体外实验也发现,他汀类药物如西立伐他汀及阿托伐他汀,可抑制由TNF－α、白介素1β（IL-1β）及前列腺素E2（PGE2）混合物诱发的单核细胞源性DC分化成熟；并减弱DC诱导T淋巴细胞增殖的能力[16]。而急性缺血综合征患者经他汀类药物治疗后,其体内AS斑块DC数量显著减少并呈现稳定斑块[3]。噻唑烷二酮类（Thiazolidinediones,TZDs）作为过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）激动剂,在临床上用于改善糖代谢异常患者体内胰岛素抵抗状态。近年研究发现,TZDs可抑制VSMC过度增殖、改善VEC功能、减少单核／巨噬细胞产生细胞因子及表达吞噬脂质的清道夫受体（SR）－A、促进胆固醇的由血管壁向肝脏的逆向转运；来对AS斑块产生抗炎作用。已发现,在 DC分化成熟过程中伴有PPAR－γ的胞内表达；后者激活后可影响DC表面CD1a及共刺激分子的表达；从而减弱DC对T淋巴细胞的增殖激活作用[17],而TZDs如Ciglitizone、troglitazone及pioglitazone等则可抑制ox-LDL诱导的DC分化成熟及免疫功能,来减轻AS局部的免疫炎症反应，延缓AS的病理进程[7]。体外研究发现,目前AS药物涂层支架常用药物雷帕霉素,可抑制DC分化成熟及抗原递呈功能,提示其除可抑制AS支架植入术后再狭窄处血管壁的VSMC过度增殖外,还可能通过减轻支架植入局部的免疫炎症反应,以预防AS支架植入术后再狭窄[18]。此外,阿司匹林在体外可抑制小鼠髓源性DC的分化成熟及免疫功能,提示其在AS治疗中的免疫炎症抑制作用[19]。

4 关于DC在AS的免疫治疗中作用的展望[20]DC作为免疫反应的关键成员,在AS慢性免疫炎症反应中起重要作用,因此对AS斑块局部DC的免疫抑制,可能有助于延缓AS的病理演进。由于DC递呈MHC-抗原多肽复合物至T淋巴细胞的同时,必须通过共刺激分子信号才能有效激活T淋巴细胞。因此,可以设想,将AS斑块加入体外培养的DC中，使其表面表达MHC-抗原多肽复合物,而同时设法阻断T淋巴细胞共刺激分子的表达或其活性,然后将体外培养的这种既表达MHC-抗原多肽复合物又无有效共刺激分子信号的DC回输入AS患者血循环中,就有可能在AS斑块局部抑制免疫炎症反应。然而，AS斑块局部产生激活T淋巴细胞的抗原具体成分及其免疫原有效性尚未完全明确,因此,界定AS斑块局部有效激活 T淋巴细胞而又与正常血管壁成分无抗原交叉性的抗原成分,将成为AS免疫抑制治疗的关键所在。从目前研究来看,可能参与AS局部免疫反应的抗原有ox-LDL、AS斑块局部坏死／凋亡细胞的变性大分子,以及AS斑块局部单核细胞／巨噬细胞、VSMC和DC等多种细胞产生的新生抗原如热休克蛋白HSPs。其中,AS局部ox－LDL的产生有可能成为此种抗原的理想候选者。目前关于AS中的DC介导的免疫炎症反应的研究刚刚起步,相信今后的免疫病理研究将为AS的免疫抑制治疗带来更多希望。

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单细胞生物起源篇（6）

【关键词】 泡沫细胞；髓系细胞触发受体1；动脉粥样硬化

泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。U937是一种人淋巴瘤细胞，本质是单核细胞，体外细胞培养呈悬浮生长，经佛波酯刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，后者在含氧化型低密度脂蛋白胆固醇（oxLDL）的培养液中培养可转化为泡沫细胞〔1〕。髓系细胞触发受体1（triggering receptor expressed on myeloid cells1，TREM1）是一个30 ku的糖蛋白，能诱使多种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素8（IL8）和单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的生成。因此，TREM1在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎症反应中处于较重要地位。但有关TREM1在单核细胞源性泡沫细胞中表达情况未见报道。本研究用PMA及oxLDL诱导U937细胞向泡沫细胞转化，用RTPCR及Western 印迹法探讨TREM1在此过程中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及主要试剂

U937细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，系人单核细胞系，倍增时间为24～48 h，在含10%小牛血清RPMI1640培养基中呈悬浮样生长。

oxLDL由Yuanyuan biotechnology提供。佛波酯购自Sigma公司。RPMI1640培养基和Trizol购自Gibco公司。MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP、Oligo（dT）购自Fermentas公司。小鼠抗人TREM1单克隆体为Abnova公司产品，兔抗人GAPDH抗体为Santa Cruz产品。ECL发光试剂盒为Millipore公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 U937细胞的分化及诱导

呈对数生长的U937细胞（细胞密度1.0×109/L），加入终浓为100 nmol/L PMA，孵育72 h，使其由单核细胞分化为巨噬细胞样U937细胞。用无血清培养液培养12 h后，换成含oxLDL(终浓度为100 mg/L)的培养液继续培养24 h，将上述巨噬细胞样U937细胞诱导为泡沫细胞。

1.3 油红O染色法鉴定U937泡沫细胞

将贴壁生长的细胞用新鲜配制的0.3％油红O染色20 min，苏木素染色5 min，70％乙醇脱色及返蓝后，水溶性胶封片，镜下观察结果。

1.4 实验分组

将经PMA诱导的U937细胞平均分为3组，分别为PMA诱导组，PMA+低密度脂蛋白（LDL）组和PMA+oxLDL组。每组设5个孔，分别用正常含10%小牛血清的RPMI 1640培养液、含LDL终浓度为100 mg/L的培养液及含oxLDL终浓度为100 mg/L的培养液培养24 h，收集培养细胞进行RTPCR检测及Western印迹检测。

1.5 RTPCR法检测培养细胞中TREM1 mRNA的表达

按Trizol说明书提取培养细胞总RNA，按逆转录酶提供的说明书进行逆转录反应。取逆转录模板2 μl用于PCR，反应条件为cDNA预变性94℃ 5 min后，经94℃ 30 s，55℃ 30 s；72℃ 30 s共30个循环；循环结束后再72℃延伸10 min。反应结束后取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行积分光密度扫描。以GAPDH密度作参考定量标准，各组光密度与其比值表示表达量强弱。

根据GenBank提供数据设计引物。TREM1引物上游序列为5′TGCTGTGGATGCTCTTTGTC3′，下游序列为5′CACAGTTCTGGGGCTGGTAT3′，扩增片段长度为491 bp；GAPDH引物上游序列为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游序列为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增片段长度为452 bp。以上引物均由上海捷瑞公司合成，用TE缓冲液稀释成终浓度为15 pmol/L，-20℃贮存备用。

1.6 Western印迹法检测培养细胞中TREM1蛋白的表达

将培养细胞用细胞裂解液收集并充分裂解后，进行10% SDSPAGE电泳，电转膜，丽春红染色，观察转膜效果；以PBST洗膜15 min，共4次，室温下2% 脱脂奶粉封闭1 h；分别加适当稀释的一抗（TREM1按1∶500稀释，GAPDH按1∶2 000稀释）4℃孵育过夜；PBST洗膜15 min，共4次，加二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG）室温2 h；PBTS充分洗膜，用ECL试剂盒化学发光检测，GAPDH为内对照，用图像分析仪分析各组条带光密度值。

2 结 果

2.1 泡沫细胞的形态学鉴定

U937细胞经过PMA诱导72 h后，倒置显微镜下观察，多数细胞由圆形变成多角形，并易于聚集、贴壁，表明细胞已由单核细胞分化后具有巨噬细胞样特征。经oxLDL油红染色后可见培养细胞明显显示出泡沫样改变，胞浆内较多的脂滴颗粒存在，且发现由于个别细胞吞噬了过多脂滴而致细胞体积增大（见图1），而未加oxLDL的对照组细胞及LDL对照组细胞内无明显脂滴颗粒。

2.2 TREM1 mRNA及TREM1蛋白在泡沫细胞中的表达

RTPCR结果显示，TREM1扩增产物为492 bp。结合Western印迹结果显示，与PMA组及PMA+LDL组比较，PMA+oxLDL组TREM1 mRNA及TREM1蛋白表达量明显增加（P

3 讨 论

AS是一个复杂的炎症免疫反应病理过程，AS斑块中含有包括单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、oxLDL负载的巨噬细胞（即泡沫细胞）和T淋巴细胞等炎性反应细胞浸润〔2〕。病变早期的泡沫细胞多来源于血中的单核细胞，后者进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体可与oxLDL结合，从而摄入大量胆固醇，成为泡沫细胞。同时，巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞时可生成血管内皮生长因子（VEGF）、TNFα等细胞因子，这些因子在AS的发生发展中起着关键作用〔3，4〕。近年来的研究发现，肺炎衣原体、幽门螺杆菌、巨细胞病毒等病原体通过激活炎症反应及损伤内皮而促进冠心病的发生发展〔5〕，提示AS与感染性疾病的发病机制可能密切相关。

TREM1属免疫球蛋白超家族成员，能显著放大由脂多糖（LPS）等细菌产物引发的急性炎症反应，在感染性休克发生中具有重要作用，因而引起越来越多研究者的关注。研究表明，TREM1不仅与细菌感染相关的急性炎症有关，在一些病毒感染性炎症、非特异性慢性炎症、缺血再灌注损伤、烧伤、甚至肿瘤的复发及预后判断方面都有重要作用〔6，7〕。

U937本质上是人单核细胞，经佛波酯、oxLDL刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，进而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞。U937的这一特性使其成为体外研究泡沫细胞形成机制的重要工具。本研究用RTPCR法及Western印迹法对U937向泡沫细胞转化过程中TREM1 mRNA及蛋白表达情况进行检测，结果发现单核细胞在向泡沫细胞转化过程中表达量不断增加，提示TREM1参与泡沫细胞的形成，可能与AS斑块的发生发展密切相关。因此TREM1可能成为AS治疗的一个新的靶点或监测AS进展的一项新指标。

参考文献

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单细胞生物起源篇（7）

1．植物细胞有丝分裂各时期特点

时期主要特征

间期

G1期合成大量的RNA和蛋白质，为DNA复制做准备。

S期DNA复制，一个DNA分子复制出的两个DNA分子通过着丝点连在一起，与蛋白质结合形成两条姐妹染色单体。

G2期为进入分裂期做准备

分裂期

前期染色质变成染色体；核膜解体，核仁消失；形成纺锤体。

中期着丝点排列在赤道板中央；染色体数目最清晰，形态最固定。

后期着丝点分裂，染色单体分开，在纺锤体牵引下移向细胞两极。

末期染色体变成染色质；核膜重建，核仁出现；纺锤体解体；赤道板位置出现细胞板，形成细胞壁。

2．染色体、染色单体、着丝点、DNA的关系

一条染色体包含一个着丝点和1～2个臂。计算染色体的数目时，以染色体着丝点的数目为依据，有一个着丝点就有一条染色体，所以DNA复制前后均为一条染色体。当染色体的着丝点分裂后，原来的一条染色体就成为两条染色体，因此，间期DNA复制完成后DNA数目加倍而染色体数目不变，后期着丝点分裂染色体数目加倍而DNA含量不变。由着丝点分裂形成的两条染色体是由一条染色体复制而来，所以一般情况下，二者的形态和遗传特性是完全相同的。有丝分裂整个过程的染色体、染色单体、DNA的数目变化如下表：

分裂间期

前期中期后期末期

染色体NNNN2NN

染色单体02N2N2N2N00

DNAN2N2N2N2NN

3．细胞器与有丝分裂的关系

线粒体：有丝分裂间期，在组成染色体的DNA分子的复制和有关蛋白质的合成的过程中，需要消耗ATP水解释放的能量，而ATP主要是线粒体进行有氧呼吸产生的。

核糖体：组成染色体的蛋白质和细胞内的蛋白质，要在核糖体中合成，因此，分裂活动旺盛的细胞中，游离的核糖体数目较多。

中心体：在细胞分裂的前期，动物细胞的中心体内的两个中心粒已经各自产生了一个新的中心粒。在前期向细胞两极移动，两组中心粒之间的星射线形成纺锤体，以牵引染色体运动。

高尔基体：高等植物细胞有丝分裂的末期，在赤道板位置出现细胞板，进而扩展成细胞壁，这一结构的形成必须有高尔基体参与。

4．减数分裂和有丝分裂的比较

比较项目有丝分裂减数分裂

发生部位各组织器官精（卵）巢

发生时间从受精卵开始性成熟后开始

分裂起始细胞体细胞原始生殖细胞

细胞分裂次数一次两次

同源染色体行为无联会和分离现象有联会和分离现象

子细胞数目两个四个

子细胞类型体细胞有性生殖细胞

子细胞染色体数与亲代细胞相同亲代细胞的一半

子细胞间染色体组成完全相同不一定相同

相同点①染色体都只复制一次；②分裂过程都有染色体、纺锤体的出现；③均有核膜和核仁的消失与重建；④减数第二次分裂与有丝分裂相似，均有着丝点分裂、姐妹染色单体分开的行为；⑤均有子细胞产生。

5．减数第一次分裂与减数第二次分裂比较

减数第一次分裂减数第二次分裂

着丝点变化不分裂分裂

染色体数目2NN（减半）N2NN

DNA分子数目2N4N2N2NN（减半）

染色体行为有联会现象，四分体的非姐妹染色单体交叉互换，同源染色体分离，非同源染色体自由组合。着丝点分裂，染色单体分开。

染色单体无（0）有（4N）有（2N）有（2N）无（0）

同源染色体有（N对）无

6．的形成过程和卵细胞形成过程比较

卵细胞

部位动物精巢动物卵巢

原始生殖细胞精原细胞卵原细胞

细胞质的分配两次分裂都均等减数第二次分裂的第一极体分裂均等，其他分裂为不均等。

分裂结果1个精原细胞4个精细胞1个卵原细胞1个卵细胞+3个极体

是否变形精细胞变为不需要变形

相同点①染色体都在减数第一次分裂的间期复制；②减数第一次分裂都有同源染色体联会、均分；③减数第二次分裂都是着丝点分裂，姐妹染色单体分开；④产生的子细胞数目都是4个，且细胞中染色体数目减半。

7．减数分裂与配子的基因组成

1个基因型为AaBb的精原细胞，产生了1个基因是AB的，则其他3个的基因组成分别是AB、ab、ab；而一个基因型为AaBb的卵原细胞，产生了1个基因是AB的卵细胞，则3个极体的基因组成分别是AB、ab、ab；若产生1个基因为AB的极体，则卵细胞的基因为AB或ab。

8．关于减数分裂与遗传基本规律

在减数第一次分裂过程中，同源染色体彼此分离、非同源染色体自由组合，这是基因的分离定律和自由组合定律的基础。在减数第一次分裂过程中，四分体中的非姐妹染色单体之间常发生交叉，并且相互交换一部分染色体，这是连锁互换定律的基础。

9．减数分裂各期的染色体、DNA、同源染色体、四分体数量的计算

（1）根据减数分裂某个时期的分裂图，计算该细胞中的各种结构数目

染色体的数目等于着丝点的数目；DNA数目的计算有两种情况：当染色体不含姐妹染色单体时，一条染色体上只含有一个DNA分子，当染色体含有姐妹染色单体时，一条染色体上含有两个DNA分子；在含有四分体的时期，四分体的个数=同源染色体的对数。

（2）根据某种生物减数分裂某个时期细胞中的某种结构数量，计算其他各期的各种数目

染色体的数目在间期和减Ⅰ分裂期与体细胞相同，通过减Ⅰ分裂减半，减Ⅱ分裂后期暂时加倍，与体细胞相同。DNA数目在减Ⅰ前的间期复制加倍，两次分裂分别减少一半。

10．对二倍体生物细胞分裂图像的判别

给出一个细胞的图像，让学生判断该细胞进行的分裂类型和所处时期是最常见的考题，很多考生对此类试题常束手无策，下面作一个简单的总结：

（1）有丝分裂、减数第一次分裂、减数第二次分裂的判别――三看法

一看细胞中的染色体数目：如果细胞中染色体数为奇数，一定是减数第二次分裂；如果染色体数为偶数，则进行第二看。

二看细胞中有无同源染色体：如果没有同源染色体，一定是减数第二次分裂；如果有同源染色体存在，则进行第三看。

三看细胞中同源染色体的行为：若出现联会、四分体、着丝点位于赤道板两侧、同源染色体分离等现象，一定是减数第一次分裂；若无上述特殊行为，则为有丝分裂。

不要把减数分裂第二次分裂后期图像中姐妹染色单体分开后形成的两个子染色体当成一对同源染色体。

三看法可用下列图示表示：

(2)细胞分裂时期的辨别

看染色体的位置：前期散乱（减数第一次分裂前期联会形成四分体），中期在中间，后期到两端，末期分两边。

(3)动物细胞、植物细胞分裂的辨别――两看

一看细胞质分开方式：细胞板隔裂为植物细胞；向内凹陷缢裂为动物细胞。

二看细胞的外形特征：矩形有壁为植物细胞；圆形无壁一般为动物细胞。

(4)雄性、雌性减数分裂的辨别

看细胞质分裂是否均等：均等分裂为雌性减数分裂或雌性第一极体形成第二极体；不均等分裂为雌性减数分裂。

二、典例剖析

1．考查有丝分裂与细胞结构

例1．（2011年上海生物卷-17）下图为同一植物细胞处在有丝分裂两个不同时期的模式图，下列表述错误的是（ ）

A．a结构主要由纤维素和果胶组成

B．b表示细胞膜，c表示细胞核

C．d结构的形成需要高尔基体的参与

D．e的蛋白质成分是在G2期合成的

解析：a为植物细胞壁，其成分为纤维素和果胶；b表示核膜，c表示核仁；d是细胞板，会逐渐形成细胞壁，其形成与高尔基体有关；e为纺锤体，其蛋白质成分是在有丝分裂间期的G2期合成的。

答案：B

2．考查观察有丝分裂的实验

例2．（2011年江苏生物卷-28）洋葱(2n=16)为二倍体植物。为比较不同处理方法对洋葱根尖细胞分裂指数（即视野内分裂期细胞数占细胞总数的百分比）的影响，某研究性学习小组进行了相关实验，实验步骤如下：

①将洋葱的老根去除，经水培生根后取出。

②将洋葱分组同时转入质量分数为001%、01%秋水仙素溶液中，分别培养24h、36h、48h；秋水仙素处理停止后再转入清水中分别培养0h、12h、24h、36h。

③剪取根尖，用Carnoy固定液（用3份无水乙醇、1份冰乙酸混匀）固定8h，然后将根尖浸泡在1mol/L盐酸溶液中5～8min。

④将根尖取出，放入盛有清水的培养皿中漂洗。

⑤用石炭酸―品红试剂染色。

⑥制片、镜检；计数、拍照。

实验结果：不同方法处理后的细胞分裂指数(%)如下表。

秋水仙素溶液处理清水培养时间(h)

质量分数(%)时间(h)0122436

0.01

2410. 7113. 6814. 1914. 46

369. 9411. 9913. 5913. 62

487. 9810. 0612. 2211. 97

0.1247. 749. 0911. 0710. 86

366. 127. 879. 989. 81

485. 976. 687. 988. 56

请分析上述实验，回答有关问题：

(1)步骤③中“将根尖浸泡在1mol/L盐酸溶液中”的作用是。

(2)步骤⑥为了获得相应的观察视野，镜检时正确的操作方法是。

（3）根据所学的知识推测，石炭酸-品红试剂是一种性染料。

(4)为了统计数据更加科学，计数时应采取的方法是。

(5)根据上表结果可以得出如下初步结论：

①质量分数为秋水仙素溶液诱导后的细胞分裂指数较高；

②本实验的各种处理中，提高细胞分裂指数的最佳方法是。

(6)下面为一位同学在步骤⑥所拍摄的显微照片，形成细胞a的最可能的原因是。

解析：在洋葱根尖细胞分裂的观察实验中，可用1mol/L盐酸破坏细胞间质成分，使组织细胞相互分离；使用高倍镜观察时，需先在低倍镜下找到要观察的物像，缓慢移动装片，将其移至视野中央，再换用高倍显微镜观察；要清晰观察细胞分裂过程中的染色体行为，需要用碱性染料对染色体染色；为了使统计数据更加科学，计数时每个装片应该观察多个视野，取其平均值；分析表中数据，在用质量分数分别为0.1%和0.01%的秋水仙素溶液处理洋葱根尖时，相同时间内后者得到的细胞分裂指数始终较高，故0.01%的秋水仙素溶液诱导效果较高；从表中数据可以看出，分裂指数最高为14.46%，该数据对应的处理方法为0.01%的秋水仙素溶液诱导24h，在清水中培养36h；秋水仙素诱导染色体加倍的作用机理是抑制分裂前期纺锤体的形成，如果秋水仙素处理发生在上一个细胞周期纺锤体形成之后，就会发生a细胞所示染色体没有加倍的现象。

答案：(1)使组织中细胞相互分离开来 (2)先在低倍镜下观察，缓慢移动装片，发现理想视野后换用高倍镜 (3)碱 (4)每组装片观察多个视野 (5)①0.01% ②0.01%秋水仙素溶液诱导24h，再在清水中培养36h (6)秋水仙素处理发生在上一个细胞周期纺锤体形成之后

3．考查减数分裂与基因突变

例3．（2011年江苏生物卷-11）右图为基因型AABb的某动物进行细胞分裂的示意图。相关判断错误的是（ ）

A．此细胞为次级精母细胞或次级卵母细胞

B．此细胞中基因a是由基因A经突变产生

C．此细胞可能形成两种或一种卵细胞

D．此动物体细胞内最多含有四个染色体组

解析：本题考查细胞的减数分裂过程及有关生物变异的知识。由图中细胞无同源染色体可知，该细胞处于减数第二次分裂过程中，因此，该细胞可能为次级精母细胞、次级卵母细胞或第一极体。因亲代基因型为AABb，故细胞中的a基因只能是基因突变产生的；此细胞若为次级精母细胞，则形成2个是2种类型，若为次级卵母细胞，则形成1个卵细胞和1个极体，1个卵细胞只能是1种类型；该动物细胞中含2个染色体组，在有丝分裂的后期染色体数目加倍，则含有4个染色体组。

答案：A

4．考查减数分裂与配子的形成

例4．（2011年山东理综卷-8）基因型为AaXBY的小鼠仅因为减数分裂过程中染色体未正常分离，而产生一个不含性染色体的AA型配子。等位基因A、a位于2号染色体。下列关于染色体未分离时期的分析，正确的是（ ）

①2号染色体一定在减数第二次分裂时未分离

②2号染色体可能在减数第一次分裂时未分离

③性染色体可能在减数第二次分裂时未分离

④性染色体一定在减数第一次分裂时未分离

A．①③ B．①④ C.②③ D.②④

解析：由基因型为AaXBY的小鼠产生一个不含性染色体的AA型配子可知，A与A没有发生分离，而A与A的分离发生在减数第二次分裂后期，故①正确；配子不含性染色体有两种可能：一是减数第一次分裂同源染色体分离不正常，二是减数第二次分裂后期姐妹染色单体分离后移向同一极，故③正确。

答案：A

5．考查减数分裂中染色体、DNA、染色单体的变化

例5．（2011年上海生物卷-28）下图表示雄果蝇进行某种细胞分裂时，处于四个不同阶段的细胞（Ⅰ~Ⅳ）中遗传物质或其载体（①~③）的数量。下列表述与图中信息相符的是（ ）

A．Ⅱ所处阶段发生基因自由组合

B.Ⅲ代表初级精母细胞

C．②代表染色体

D.Ⅰ~Ⅳ中③的数量比是2∶4∶4∶1

解析：本题要求考生通过分析减数分裂过程中DNA、染色体、染色单体数的变化特点判断分裂时期。由图中信息可知，①表示染色体，②表示染色单体，③表示DNA，Ⅰ代表精原细胞，Ⅱ代表处于减数第一次分裂时期的初级精母细胞，Ⅲ代表处于减数第二次分裂前期和中期的次级精母细胞，Ⅳ代表减数分裂完成后形成的精细胞。Ⅱ所处的减数第一次分裂前期非姐妹染色单体的交叉互换和后期的细胞中非同源染色体的自由组合均可发生基因的自由组合。Ⅰ~Ⅳ中③的数量比应该2∶4∶2∶1。

答案：A

6．考查减数分裂和有丝分裂的综合

例6．（2011年天津理综卷-4）玉米花药培养的单倍体幼苗，经秋水仙素处理后形成二倍体植株，下图是该过程中某时段细胞核DNA含量变化示意图。下列叙述错误的是（ ）

A.a～b过程中细胞内不会发生基因重组

B.c～d过程中细胞内发生了染色体数加倍

C.e点后细胞内各染色体组的基因组成相同

D.f～g过程中同源染色体分离，染色体数减半

解析：本题考查细胞分裂DNA数量的变化曲线及分析。a～b过程处于有丝分裂的前、中、后期，而基因重组只能发生在减数分裂过程中；c～d过程中由于已用秋水仙素处理，故在此过程中导致染色体数目加倍；e点后细胞内各染色体组都来源于花药中一个染色体这样的复制，因此各染色体组的基因组成相同。同源染色体分离只发生在减数分裂过程中，而f～g进行的是有丝分裂。

答案：D

三、跟踪训练

1．下列关于细胞周期的叙述，正确的是( )

A．成熟的生殖细胞产生后立即进入下一个细胞周期

B．在细胞分裂间期，DNA复制，染色体数目也加倍

C．抑制DNA的合成，细胞将停留在分裂期

D．处于有丝分裂后期的果蝇体细胞有四个染色体组

2．右图是细胞有丝分裂过程中一条染色体上的DNA含量变化图解，下列叙述中正确的是( )

A．在AB段主要进行蛋白质的合成，细胞生长速度快

B．出现CD段变化的原因是细胞质分裂

C．该细胞中，在BC段始终有染色单体存在

D．若该细胞是植物细胞，则CD段高尔基体和内质网活动非常活跃

3．下列关于二倍体动物细胞增殖的表述不正确的有( )

A．体细胞有丝分裂后期，细胞每一极均含有同源染色体

B．体细胞有丝分裂末期，细胞不含有姐妹染色单体

C．体细胞有丝分裂过程中，染色体DNA与细胞质DNA平均分配

D．减数第二次分裂后期，细胞染色体数为2的倍数，不含同源染色体

4．右图为细胞分裂的某一时期，下列有关此图的叙述中，不正确的是( )

A．虽然细胞中有中心体⑨，但不能断定该细胞为动物细胞

B．④是一条染色体，包含两条染色单体①和③，两条染色单体由一个着丝粒②相连

C．细胞中有两对同源染色体，即④和⑦为一对同源染色体，⑤和⑥为另一对同源染色体

D．在后期时，移向同一极的染色体均为非同源染色体

5．人体内某一细胞正在进行减数分裂，其中有44条常染色和2条X染色体，则此细胞最可能是( )

A．初级精母细胞或次级精母细胞

B.初级精母细胞或初级卵母细胞

C．次级精母细胞或初级卵母细胞

D．次级精母细胞或卵细胞

6．在细胞有丝分裂和减数分裂中，都发生的生理过程有( )

①染色体复制 ②同源染色体联会 ③非姐妹染色体交叉互换 ④同源染色体分离 ⑤着丝点分裂 ⑥细胞不均等分裂

A．①⑦ B．①⑥ C．①⑤ D.③④

7．染色体经复制后不会出现( )

A．染色体内DNA含量加倍

B．着丝点数目加倍

C．有2条染色单体

D．蛋白质的含量较复制前增加

8．某卵原细胞内含有Aa、Bb两对同源染色体，形成的卵细胞的染色体组成为Ab，则其所产生的3个极体的染色体组成分别为( )

A．AB、Ab、ab B．Aa、Bb、AB

C．Ab、aB、aB D．AB、aB、ab

9．下列不是、卵子发生的区别的是( )

A．初级精母、卵母细胞的形成时间

B.MⅠ和MⅡ的时间连续性

C．成熟生殖细胞中染色体的数量

D．成熟生殖细胞是否经过变形

10．下图表示同一生物体内不同时期的细胞分裂图，相关说法不正确的是( )

A．处于有丝分裂过程中的细胞是①③

B．细胞②可能发生等位基因分离

C．该生物体细胞染色体数量为4条，含有两个染色体组

D．细胞④中存在两对同源染色体

11．下图为某二倍体生物精原细胞分裂过程中，细胞内的同源染色体对数的变化曲线。基因重组最可能发生在( )

A．AB段 B.CD段 C．FG段 D.HI段

12．某些有毒物质能诱导真核细胞在分裂过程中产生微核。微核是由断裂的染色体形成的椭圆形异常结构，游离于细胞核之外，光学显微镜下可见。某生物小组为了探究香烟焦油能否诱导微核产生，完成了如下实验：

第一步：萃取获得香烟中的焦油，用醋酸丙酯将其溶解后再用蒸馏水稀释，配制成一系列浓度的焦油溶液。各取等量加入烧杯A、B、C、D中。将醋酸丙酯与蒸馏水混合液取等量加入烧杯E中。取等量蒸馏水加入烧杯F中。

第二步：将6个状况相同、幼根已培养至1cm的洋葱分别置于上述6个烧杯中培养较长时间，然后从每个洋葱上随机取根尖数根制作临时装片。

镜检记录出现微核的细胞所占的比例(微核率)，计算每组平均值如下表：

烧杯编号ABCDEF

焦油浓度(ug／mL)5010020030000

平均微核率(‰)12.5514.9317.3220.143.583.59

请分析回答：

(1)为何洋葱在上述溶液中培养时间不可过短?。

(2)镜检时应选择位于根尖区，且处于细胞分裂期的细胞。

(3)用洋葱根尖制作临时装片的一般步骤为。

(4)对ABCD四组而言，E组和F组哪组是对照组?。将E组与F组比较，作用是

。该实验可得出什么结论? 。

13．如图所示是某种雄性动物细胞分裂过程中，染色体（假设体细胞染色体数为2N）和核DNA含量的变化情况。请回答：

（1）图中表示的是分裂过程中的染色体和核DNA的变化曲线。

（2）图中表示染色体数目变化的是，图中表示核DNA含量变化的是。

（3）处于D点的细胞名称是，处于EF段的细胞名称是。

（4）DE段变化的原因是，FG段变化的原因是。

14．下图甲、乙是某种雄性动物细胞分裂示意图，图丙表示该动物细胞分裂时期核内DNA数量变化曲线。请据图回答：

（1）图甲细胞分裂发生的场所是。

（2）图甲细胞中染色体①与②的分离发生在图丙的时期。若该细胞完成减数分裂后，形成了一个基因型为DA的子细胞，则同时产生的其他子细胞的基因型分别是。

（3）图乙细胞含有条染色单体、个染色体组。

（4）图乙细胞所处分裂时期的重要特征是。请画出图乙前一时期的细胞分裂示意图。

15．下图一、二分别表示某二倍体雌性动物（2n=4）体内细胞正常分裂过程中不同时期细胞内染色体、染色单体和DNA含量的关系以及细胞分裂图像。请分析并回答：

（1）图一中a、b、c表示染色单体的是，Ⅰ~Ⅳ中存在同源染色体的是。

（2）图二中丙细胞对应于图一中的（填数字）期，产生的子细胞名称为。

（3）图二中甲、乙、丙细胞含有的染色体组数分别是。

（4）请绘出该雌性动物减数第一次分裂后期的细胞模式图。

参考答案：1．D 2．C 3．C 4．D 5．C 6．C 7．B 8．C 9．C 10．D 11．C

12．（1）确保经历至少一个细胞周期 （2）分生 间 （3）解离漂洗染色制片 （4）E 排除醋酸丙酯的影响 香烟焦油能诱导微核产生，且浓度越高，诱导作用越强

单细胞生物起源篇（8）

Key words Biotic material Cell-culturing Compatibility Toxicity experiment

生物材料的临床应用已有较长的历史，广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科领域。目前美每年有2-3百万人工脏器或假肢植入人体中。生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能，还必须具有良好的生物相容性，以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性，对于研制新材料和缩短研究周期起着重要的作用[1]。

根据1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验（口服法）、急性全身毒性试验（静脉注射法）、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段（亦称为细胞毒性试验），具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，正日益受到人们的广泛重视。本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。

1 细胞毒性试验方法的进展

1948年Rosen Bluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作，迄今为止这方面已有大量的工作积累与研究发现。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解，加之材料的多样性、置入要体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素，故迄今为止，国内外还没有一个统一细胞毒性试验方法。

细胞毒性试验由于细胞培养方式（如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等）的不同，细胞与材料之间有无间质（即细胞直接与材料或其浸出液接触，还是通过间质接触）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等）不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。

1.1间接法

最典型的间接法是琼脂覆盖法，该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是将含有培养液的琼层平铺在有单层细胞的培养皿中，再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法优点是不管试验材料是什么形态（膜、粉末或油脂状）等都适用。但该法敏感性受试样溶出物琼脂层上扩散程度的影响。当溶出物分子量小，易溶于水，其毒性发现早且较强。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并难溶于水，使用该法时材料毒性就难以表现出来。

为克服琼脂法的缺点，Sabita Sriva等提出分子滤过法[3]。该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜，将试样材料放在滤膜上，使材料毒性在成份通过滤膜作用于其下的细胞。由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bondemark认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。 van Luyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。该法是在甲基纤维素中混入细胞表面进行培养。该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要发生，因此可同观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。

1.2 直接法

生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应和组织反应的主要原因。易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。为研究这些溶出物的细胞毒性，一些学者提出浸出液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中适当条件下进行浸泡，制备出含有溶出的浸泡液再将浸了液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养，观察溶出物对细胞的影响。Oshima认为不同浸提条件和浸提方式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。

直接浸渍法：该法是形态不规则的试样（如金属粉末、油脂类材料）等与细胞一起放入培养皿中进行培养。当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。

另一些学者在直接法基础上提出直接接触法。该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。当有毒性物质释放时，由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度，同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”，很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。但是，对于与血液接触的循环系统来说，为了避免引起血栓形成，就希望细胞难以贴壁且不易增殖。因此应根据材料的使用目的，作出相应的生物相容性判断。

Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。作者认为浸出液法适合检测材料溶出物毒性，并与动物毒性试验结果相符合。直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可测出材料微弱的细胞毒性。琼脂法适合对毒性大的大指材料进行筛选。分子滤过法适合毒性成份分子子量小的材料进行生物相容性评价。

综上所述。细胞毒性试验方法多种多样，并各有其特色。每种试验方法因其原理及方法不同，选择材料的针对性也不同。根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途选择正确的实验方法是至关重要的。

2 实验细胞研究进展

目前细胞毒性试验中应用最早的及使用最广泛的细胞是L-929细胞，该细胞是Earle等1948年从小鼠皮小组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞（HeLa细胞）[10]。由于这两种具有传代容易，繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。1982年美国质量标准协会将L-929细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞[2]。

由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组织，HaLe细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这现两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。同时随着不断涌现，人们对材料植入人体后与机体组织之间可能发生的反应其对材料的影响产生了浓厚的兴趣。因此单用L0929和HaLe细胞培养检测材料的生物相容性已不能满足人们的这种需要。

从九十年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞作业实验细胞，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，其结果更为准确与客观。

对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物，因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。由于单核巨噬细胞来源于人体的血液，在人体免疫系统中起着重要的作用，能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应，同时刺激成纤维细胞生长促进伤品的愈合。因此选择单核巨噬细胞作评价材料细胞毒性的实验细胞，有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响[1]。

Cheung认为不同组织来源的细胞材料的敏感性是有差异的[12]。只用软组织来源的细胞培养检测材料的细胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料为例。前者种植到骨组织内，所接触的是骨环境，而后者存在于软组织环境中。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞，因为这种细胞在体外培养中可形成体内环境一致的矿物化小结，这种小结内含有类成骨细胞和类骨髓细胞及钙化的胶原基质，使体外细胞包培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的反应。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，这些可溶物质主要影响邻近的牙组织及口腔粘膜的上皮细胞、成纤维细胞及各种免疫细胞，并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能产生影响。因此对牙材料采用口腔粘膜的成纤细胞或/和上皮细胞才能更准确地反映出材料的生物相容性。

3 细胞毒性的观察方法

以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量，通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性[15]。由于材料毒性成份对细胞的损伤，首先发生细胞生物化学反应和生物分子结构的改变，出现代谢和机能的改变如线粒体氧化代谢障碍、蛋白质合成下降，细胞膜选择性通透屏障作用消失等，这种变化用形态学方法通常不能发现。只有当细胞死亡10h以上，细胞的自溶性变化相当明显的才能在光显微镜下根据细胞死亡的判断特点，即核浓缩、核碎裂、胞浆伊红染色等判断材料的细胞毒性程度。因此传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。

九十年代以来，越来越多学者倾向于从材料毒性成份引起细胞死亡所产生的细胞形态和数量的变化评价材料生物相容性转移到材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响，并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作材料的生物相容性评价指标。

在体外细胞培养中已有学者提出一些能敏感地反映细胞活力功/和细胞殖的实验室评价方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）摄入法[16]、荧光染色法（如乙酰乙酸荧光素）[18]、流式细胞光度术等[19]。这此方法各有其优缺点及适用范围。

放射性同位素摄入法是在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成清况[16]。该法能揭示细胞分子水平的动态变化，是研究细胞代谢状态的重要手段。但同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害，同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备是其缺点。

四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初应用于免疫学领域，近年一些学者将该法应用到生物相容性评价中[20]。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成兰色甲替。形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。

荧光染色法：其基本原理是当细胞受到损伤时，细胞膜的选择通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞[22]该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。

单细胞生物起源篇（9）

1 IL12家族及其受体的结构和相互联系

IL12家族中的成员IL12、 IL23、 IL27及最新发现的IL35均为异源二聚体。每一个异源二聚体细胞因子均由1个单体4－折叠螺旋束样细胞因子 (four helix bundle cytokines)亚单位(IL12p35、 IL23p19、 IL27p28、 IL35p35)和1个可溶型细胞因子受体样亚单位(p40和EBI3)组成。已鉴定出的IL12家族不同成员的受体均为异源二聚体， 属Ⅰ型细胞因子受体， 由IgSF、 CKR或Fn3结构域组成(图1)。

图1 IL12家族成员及其受体结构

1.1 IL12及其受体 IL12在1991年被克隆并成功表达［1］。它由Mr 35 000的p35和Mr 40 000的p40两个亚单位通过两个二硫键连接， 又称IL12p70。其中p35亚单位与IL6、 GCSF和鸡骨髓单核细胞生长因子具有同源性; p40属促红细胞生成素受体家族， 与IL6Rα的胞外区结构域、 睫状神经元营养因子(CNTF)受体及GCSF受体有同源性［2］。IL12受体为IL12Rβ1/IL12Rβ2二聚体， 两个亚单位均属细胞因子受体家族gp130亚族。单独的一个亚单位结合配体为低亲和力， 只有两者共表达后才能产生IL12高亲和力结合的位点。其中IL12 Rβ2发挥信号转导功能， IL12与其受体的相互作用引起“两面神”激酶(Janus Kinase)JAK2和TyK2相互磷酸化而激活， 进而催化受体发生酪氨酸磷酸化， 募集含SH2结构域的信号转导及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription， STAT)4、 STAT3、 STAT1和STAT5， 使其在JAK2和TyK2的作用下发生磷酸化， 其中磷酸化的STAT4在胞质形成同源二聚体进入胞核， 调节目的基因表达。STAT3还可调节DCs中IL12p40启动子对NFκB的募集［3］。另外在某些情况下， IL12p40还可以二硫键连接形成同源二聚体IL12(p40)2或称IL12p80。

1.2 IL23及其受体 IL23由p40和p19两个亚单位组成， 其中p40亚单位与IL12共用。p19亚单位具有IL6细胞因子家族成员的特征， 在氨基酸序列水平上与IL12p35亚单位同源性最高。IL23受体为IL12Rβ1/IL23R二聚体， 其中p40亚单位仍结合IL12Rβ1 。结构上IL23R与IL12Rβ2有很大相似性， 胞膜外区包括1个IgSF和2个CKR结构域， 胞质区有3个潜在的SH2结构域和2个STAT结合位点。IL23与其受体结合后， 同样引起JAK2和TyK2的磷酸化， 募集并磷酸化STAT3、 STAT4、 STAT1和STAT5， 其中STAT3和STAT4结合形成异源二聚体， 在IL23的信号转导中发挥主要作用。另外发现至少有6种IL23R亚型（IL23R16）， 由差异剪接所形成［4］。

1.3 IL27及其受体 IL27由EB病毒诱导的基因3(EB virusinduced gene3)编码的EBI3和p28两个亚单位组成。EBI3最初在EBV转化的B细胞中发现， 主要表达在髓样细胞谱系中， 结构上与IL12p40和IL6Rα亚单位同源; p28与IL12p35和IL6有一定的同源性， 且p28有14个带负电荷的氨基酸残基， 这在其他细胞因子中未曾发现。IL27受体为IL27R/gp130异源二聚体， 其中gp130亚单位与IL6家族成员受体亚单位gp130共有。gp130相关的受体与相应细胞因子结合后， 引起JAK1、 JAK2和TyK2的磷酸化。因此IL27与其受体结合后， 即通过这三种激酶的磷酸化募集STAT1、 STAT3和STAT5， 其中主要由磷酸化的STAT1介导其信号转导。

1.4 IL35 2007年， Liew和Vignali等［5， 6］两个小组分别报道了IL35。IL35由EBI3和p35两个亚单位组成， 分别与IL27和IL12所共有。人和小鼠中都已发现有IL35存在。IL35受体仍未鉴定出来。2 IL12家族的产生和调节及其生物学功能

2.1 IL12家族的产生与调节 IL12、 IL23和IL27主要由活化的单核细胞、 巨噬细胞(Mφ)和树突状细胞(DC)产生， 基因编码的两个亚单位需表达在同一个细胞上才能产生有生物学活性的异源二聚体。如编码IL12p35和IL23p19的mRNA可在不同的细胞和组织中出现， 包括已知不产生IL12和IL23的淋巴细胞， 而编码p40亚单位的mRNA基因严格表达在能产生具有生物学活性的异源二聚体的细胞上， 编码EBI3的mRNA则主要表达在扁桃腺和脾细胞等造血细胞上。与前三个成员不同， IL35由Foxp3＋调节性T细胞(regulatory T cell， Treg)优先分泌， 当Treg与效应T细胞共培养时， Treg中IL35基因表达明显上调。目前已知， EBI3是Treg细胞中转录因子Foxp3下游作用的靶分子。另外， EB病毒转化的B细胞、 γδT细胞、 CD8＋T细胞亚群、 DC和Mφ也可表达IL35［6］。IL12、 IL23、 IL27各自的受体广泛分布在Mφ、 DC、 NK细胞及活化的T细胞表面， 编码IL27R和gp130的mRNA还可在B细胞、 肥大细胞和内皮细胞中检测到。另外， 在初始CD4+T细胞和记忆性CD4+ T细胞上， 这些受体的表达水平有所不同， 小鼠初始CD4+T细胞(CD45RBhi)表达相对高水平的IL12Rβ2、 低水平的IL23R; 相比之下， 记忆性T细胞(CD4+CD45RBlo)则表达相对高水平的IL23R、 低水平的IL12Rβ2［7］。

微生物是IL12家族细胞因子产生的强有力诱导者。接触到病原微生物后是DCs首先产生IL12， 而且DC迅速产生IL12并不依赖于IFNγ和T细胞。不同的微生物产物刺激DC和Mφ 可产生不同的细胞因子， 例如G+菌胞壁肽聚糖优先刺激IL12的产生; 而百日咳毒素通过抑制G蛋白耦联受体导致cAMP升高， 优先诱导IL23的表达。活化的DCs上不同的Toll样受体(Toll like receptor， TLR)可诱导IL12家族中异二聚体细胞因子产生， TLR4信号途径特异性促进IL12产生， 而TLR2更易诱导IL12p80和IL23的产生。IFNγ促进p35、 p40基因的转录， IL4受体介导的信号也可增强IL12的产生。体外IL4和IL13比IFNγ更有效的增强p40和p35基因的转录。T细胞促进IL12产生不仅通过其产生的IFNγ和IL4， 还可通过直接的细胞细胞间接触， 如 T细胞上的CD40L与APCs上的CD40接触。IL12p40最初认为是IL12的调节性亚单位， p35 mRNA表达和编码蛋白的分泌， 可能是IL12产生的限速因素。

Ⅱ型细胞因子如IL10和Ⅰ型IFN以及TGFβ和TNF等可抑制IL12产生， IL10阻断p35、 p40亚单位基因的转录， 并可降低LPS引起的IL23p19在Mφ上的表达。此外， 趋化因子MCP1～MCP4、 补体成分C5a以及甲酰肽fMLP通过结合至G蛋白耦联受体(GPCR)途径可抑制Mφ产生IL12。

2.2 IL12家族的生物学功能 IL12相关细胞因子的基本生物学功能主要是调节NK细胞活化、 T细胞增殖和细胞因子的产生以及B细胞抗体产生。值得注意的是， 人IL12作用有种属特异性， 人IL12对小鼠细胞作用甚微， 而小鼠IL12对小鼠和人的淋巴细胞均有明显的刺激活性， 这种作用模式在细胞因子中很独特。

2.2.1 调节NK细胞功能 IL12、 IL23及IL27均可诱导NK细胞产生IFNγ， 并与其他细胞因子有协同作用， 如在IL2和/或IL18存在时其刺激NK细胞产生IFNγ的作用大大增强。IL12与IL27也有协同作用。IL12可明显提高NK细胞的细胞毒活性， 包括对NK细胞有抵抗的靶细胞、 抗体包裹的靶细胞以及病毒感染的成纤维细胞等。IL12还可促进NK细胞表达黏附分子、 活化抗原和细胞因子受体。

2.2.2 调节T细胞功能 IL12、 IL23及IL27均是T细胞增殖的辅助因子， 但各自作用的T细胞亚群有所不同。由于IL12Rβ2和IL23R在初始和记忆性CD4+T细胞上表达水平上有所差别， IL12在初始T细胞的活化中起着关键的作用， 而IL23只是一个作用较弱的辅助因子。IL27在抗CD3和抗CD28诱导的初始CD4+T细胞(人CD4+CD45RA+， 小鼠CD4+CD45RBhi)的增殖中有很强的辅助作用。而IL23可增强抗CD3和抗CD28诱导的记忆性CD4+T细胞(人CD4+CD45RO+， 小鼠CD4+CD45RBlo)的增殖。

IL12在诱导初始CD4+T细胞向Th1分化并促进Th1产生IFNγ中起着关键作用， 同时抑制Th2产生细胞因子， 包括IL4和IL13。IL27在IL12和抗CD3的协同下， 同样可诱导初始CD4+T细胞产生IFNγ。而IL23则通过PHA或抗CD3/抗CD28刺激活化/记忆性T细胞产生IFNγ。尽管三者均可刺激IFNγ的产生， 但IL12是Th1分泌细胞因子所必须的， IL12的缺失不能够由IL23和IL27所代偿［8］。IL12和IL23还可作用于除淋巴样细胞以外的髓样细胞。IL12通过活化JAK/STAT4途径诱导小鼠Mφ、 DCs产生IFNγ， IL23可以剂量依赖方式刺激小鼠DCs产生IFNγ， 但作用较IL12弱。另外发现IL23可诱导Th17细胞亚群的分化和成熟。当小鼠感染白色念珠菌的菌丝、 百日咳毒素或金黄色葡萄球菌胞壁肽聚糖时， 活化的DCs产生IL6， 通过STAT3信号途径上调IL23R的表达， 由DCs产生的IL23与其受体结合， 通过STAT3信号途径诱导CD4+T细胞分化为Th17细胞， 产生IL17并诱导其他细胞分泌IL6、 GCSF和IL8， 介导慢性炎症反应［9］。而Th1产生的IFNγ和Th2产生的IL4对Th17的分化有很强的抑制作用。在CD4＋记忆性T细胞中， 有相当一部分细胞表达IL23R， 这正是产生IL17的主要细胞， 但由于人的遗传因素造成的个体差异， 情况也不完全一致［10］。相反， IL27可分别通过STAT1依赖和非依赖的途径， 抑制Th17促炎性细胞亚群以及TGFβ诱导的Foxp3＋Treg细胞的发育［11］。

最新发现的IL35可促进抗CD3和抗CD28诱导的小鼠CD4+T细胞的增殖［6］。由IL35诱导扩增的CD4+CD25+T细胞表达Foxp3， 促进IL10的分泌， 并具有对CD4+CD25效应T细胞的抑制功能; 而IL35诱导扩增的CD4+CD25T细胞产生IFNγ， 不产生IL4。在有抗CD3和APCs存在的条件下， IL35可抑制CD4+CD25效应T细胞的增殖。IL35对T细胞增殖的双向调节作用可能与T细胞不同的活化模式有关。IL35在体内外有很强的抑制Th17的分化的功能。

2.2.3 调节B细胞功能 IL12和IL27对体液免疫最重要的作用可能分别通过IFNγ依赖和非依赖的途径降低IgG1和IgE的产生， 促进IgG2a的类别转换。IL23缺陷的小鼠T细胞依赖性的体液反应缺陷。IL23通过T细胞依赖性途径来调节抗体的产生， 而并不能直接作用于B细胞。

2.2.4 参与抗感染免疫 IL12家族成员在对胞内病原体的Th1型应答中功能相互重叠而又不完全一致。任何一个成员的缺失所引起的应答缺陷均不能由其他成员的功能完全补偿; 并且有些成员可能为应答早期所必须， 而其他成员可能参与微生物清除后对应答的中止过程。感染起病时， IL27通过其受体活化STAT1， 上调IL12Rβ2的表达， 进而IL12与受体结合活化初始CD4＋T细胞产生IFNγ， 即IL12和IL27在感染早期就发挥作用。IL23则是通过促进Th1效应/记忆性T细胞， 维持细胞介导的免疫应答。以分析鼠弓形体(Toxoplasma gondii)感染IL12或IL23缺失的小鼠为例［7］， 表明IL12是发挥保护作用所必须的， IL12的缺失只能由IL23部分补偿; IL27同样可增强对T.gondii的应答， 但其主要是发挥在微生物被清除后下调T细胞应答的功能。而IL35在发挥抗感染作用时具有双重作用［5］。急性感染时， IL35可明显诱导Th1细胞清除感染， 同时扩增Treg细胞并抑制Th17细胞分化， 防止过度的自身免疫反应发生; 在接下来的慢性感染期， 扩增的Treg细胞通过抑制剩余的效应细胞防止免疫损伤发生。

2.2.5 参与炎症性疾病发生 在敲除IL12和IL23亚单位的炎症疾病动物模型中， 如多发性硬化症(MS)、 类风湿性关节炎(RA)， 表明IL23， 而不是IL12控制着慢性炎症［12］。以炎症疾病特异性模型胶原诱导的关节炎(collageninduced arthritis， CIA)和实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentally allergic encephalomyelitis， EAE)为例， 表明IL23是疾病发展所必须的。IL23可促进Th17分泌IL17， IL17诱导级联的炎症细胞因子和趋化因子， 包括TNFα、 IL6和MCP1， 这些都在IL23诱导的慢性炎症中起着决定性的作用［7］。有报道［13］表明IL12可以特异性抑制IL17的产生， 从而支持了是IL23而不是IL12在炎症过程中的主导作用。中和性抗IL27抗体可降低炎症性疾病的严重程度， 说明IL27同样可促进炎症发展; 但IL27也可通过竞争结合gp130， 降低IL6的功能从而抑制Th17分化， 发挥抗炎的功能。IL35体内应用可降低小鼠CIA的病情， 同时伴有IL27产生的下降和IFNγ分泌的增加， 说明IL35是一种新的抗炎细胞因子， 主要机制可能是通过扩增Treg细胞和抑制Th17细胞的分化［5］。有趣的是， IL12家族中共同拥有EBI3亚单位的IL27和IL35功能具有一定的相似性， 均具有免疫抑制作用; 而另2个成员IL12和IL23不具有EBI3， 通常发挥活化免疫反应的作用。另外， IL12p40/p80除了已知能够提供负反馈环与IL12R竞争结合之外， 还可作为化学诱导物诱导Mφ， 促进细菌刺激的DCs迁移， 促进CD8＋T细胞产生IFNγ， 刺激小胶质细胞产生TNF和NO， 并与许多严重的病理性炎症反应有关， 如硅肺、 移植物排斥反应以及哮喘等［14］。

3 IL12家族与临床疾病

IL12和IL23均对银屑病的病理过程有促进作用。IL12p40和IL23p19亚单位基因的表达在银屑病病变区域大大增加， 而IL12p35的表达没有增加， 说明IL23在银屑病发病中的重要作用［15］。IL12活化的CD4＋T细胞和NK细胞产生IFNγ和TNFα， IL23活化特异T细胞产生IL17， 增加角质化细胞合成一氧化氮合酶， 均对银屑病的发病有促进作用［16］。具有中和活性的IL12p40抗体可成功的改善银屑病病情。IL12p40抗体与IL12p40和IL23p40亚单位结合， 阻止其与IL12Rβ1的结合。病变损伤区IFNγ和IL8、 IP10、 MCP1水平都在给予IL12p40抗体后明显下降［17］。最近发现IL23可促进肿瘤的发生和发展。IL23不仅可刺激中性粒细胞和Mφ浸润， 而且可以促进血管再生和炎症介质在肿瘤生长微环境中的聚集， 并且拮抗IL12和IFNγ， 增强肿瘤细胞对免疫系统的抵抗， 同时伴有肿瘤相关炎症发生［18］。

早期认为在MS动物模型EAE的发病中IL12起主要作用， 但经过对p40-/-小鼠的研究发现， IL23通过诱导IL17分泌， 在EAE的发病中比Th1细胞更为重要［19］。中枢神经系统中小胶质细胞产生的IL23可促进EAE早期的发生。因此， IL12p40抗体同样可以用于治疗IL23诱导的EAE。一直以来， 对炎性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)的研究始终集中在IL12。应用IL12p40抗体可明显减轻Crohn's病(CD)的症状。而通过研究IL12p35或IL23p19亚单位缺失的小鼠表明， 可能是IL23而不是IL12在CD发病中所必须， IL23可促进IBD模型中的小肠炎症， 表明特异性抑制IL23p19亚单位可用于CD的治疗。

在CIA中， IL35可通过扩增Treg细胞和抑制Th17细胞对CIA有治疗作用［5］。另外， EBI3和IL12p35均在胎盘滋养层中表达上调， EBI3与p35结合后在人足月正常胎盘提取物中表达， 可能在母胎耐受中发挥着重要作用。

4 展望

迄今为止， IL12家族成员已增加至4个。各成员之间相似的结构、 交叉重叠而又各不相同的生物学功能使其在免疫应答及调节中发挥着精细的调节作用。但各成员之间复杂的功能联系仍有待进一步研究， 尤其是最新发现的IL35， 其受体和信号转导途径仍不清楚， 与Treg细胞之间的密切关系也有待深入探讨。相信通过对IL12家族细胞因子的研究， 可以使我们更深刻认识细胞因子网络以及免疫应答的本质。

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单细胞生物起源篇（10）

生物的生殖过程实质上是繁衍后代的过程。如果说新陈代谢是生物个体得以生存的必要条件，那么，生殖则是物种得以延续的必要条件。因此，在生物的六个基本特征中，新陈代谢和生殖发育是其他特征的基础。生殖部分的知识要点包括：1）生殖的类型2）减数分裂和有性生殖细胞的形成。

1．生物的生殖类型解析 生物的生殖可以分为无性生殖和有性生殖两大类。分裂生殖、出芽生殖、孢子生殖、营养生殖是无性生殖的主要类型。它们都不需要生殖细胞的结合，由母体直接产生新个体。有性生殖由亲本产生两性生殖细胞，再经过两性生殖细胞的结合形成合子，由合子发育成新个体的生殖方式。

该考点在高考中多以选择题的形式出现，所赋于的分值较低。通常重点考查无性生殖和有性生殖的本质区别，无性生殖和有性生殖的实践应用。有如下难点问题需要注意：1）对于无性生殖来说，没有生殖细胞的结合，不代表没有生殖细胞的参与，例如：孢子生殖中的孢子即是生殖细胞，而组成放线菌孢子丝的孢子也是生殖细胞。2）特殊情况下，生殖的过程中即便没有生殖细胞的结合，也属于有性生殖。例如：蜂群中的雄蜂是由卵细胞不经受精作用直接发育来的，但仍然是有性生殖，叫孤雌生殖。3）一种生物的生殖方式往往不止一种，通过不同的生殖方式，生物可以适应不同的环境，产生不同的结果。

2．减数分裂和两性生殖细胞的形成 进行有性生殖的生物由原始的生殖细胞发展成为成熟的生殖细胞的过程，经过减数分裂来实现。在高考中，常常把有丝分裂与减数分裂结合起来，把减数分裂和细胞核遗传的基因分离和自由组合定律相结合，细胞质遗传和细胞核遗传结合加以重点考查。在学习和复习的过程中，要注意下面几个难点问题的理解和应用：1）原始的有性生殖细胞成熟时，一部分可以通过减数分裂形成有性生殖细胞，而另一部分则通过有丝分裂形成大量的原始生殖细胞对自身加以补充。2）与卵原细胞形成卵细胞不同，精原细胞通过减数分裂并不能直接形成成熟的精子，而是形成精子细胞。3）不考虑四分体时期的交叉互换，一个具有n对等位基因的精原细胞可以产生两种、四个精子细胞，而一个具有n对等位基因的卵原细胞仅可以产生一种、一个卵细胞；一种具有n对等位基因的精原细胞可以产生2n种精子细胞，一种具有n对等位基因的卵原细胞也可以产生2n种卵细胞。4）对比有丝分裂和减数分裂时，主要是比较两种细胞分裂过程各时期的细胞变化特点（例如细胞图的判断），尤其是染色体、染色单体、DNA的变化规律。关于细胞图的判断，在掌握了两种分裂方式的特点基础上，可以通过如下方式加以分析作出合理的判断：

奇数 无同源染色体 减数Ⅱ

染色体数

无同源染色体

偶数 有联会四分体；

着丝点并列于赤道板两侧； 减数Ⅰ

同源染色体分离

有同源染色体

无（联会等）上述行为 有丝分裂

而关于两种细胞分裂各时期染色体、染色单体、DNA的变化规律，可以采取下面方法理解记忆：假设生物体细胞中染色体数为2N,将其视作单位1。那么可以推出下表：

时期

染色体

DNA

染色单体

有

丝

分

裂

间期

1

12

02

前期

1

2

2

中期

1

2

2

后期

2

2

末期

1

1

减

数

分

裂

间期Ⅰ

1

12

02

前期Ⅰ

1

2

2

中期Ⅰ

1

2

2

后期Ⅰ

1

2

2

末期Ⅰ

1∕2

1

1

前期Ⅱ

1∕2

1

1

中期Ⅱ

1∕2

1

1

后期Ⅱ

1

1

末期Ⅱ

1∕2

1∕2

通过对表格数据分析不难看出，如果只考虑间期DNA和染色单体的变化结果：① 有丝分裂的间期，前期，中期；减数分裂的第一次分裂间期，前期，中期，后期的染色体数：DNA数：染色单体数均为1：2：2。