细胞增殖论文篇（1）

糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1．2亿，预计到2025年，将达到2．5亿以上，而大约15％的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。

1临床资料

1．1一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69．2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。

1．3截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。

1．4中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。

2观察方法

2．1标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。

2．2设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。

2．3免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10．0软件包进行方差分析。

3结果

3．1中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例（31．25%），脉络瘀热组10

例（31．25%），气阴两虚瘀阻组4例（12．5%），脉络热毒组8例（25．0%）。年龄、性别分布情况，见表1。

表132例患者年龄、性别分布n（%）

性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24（75．0）4（12．5）8（25．0）11（34．4）1（3．1）女8（25．0）1（3．1）3（9．3）4（12．5）0总计32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。

表2各证型Ki67阳性表达指数比较（%）

证型Ki67阳性表达指数脉络热毒4．87±1．01*气阴两虚瘀阻1．86±0．47脉络瘀热1．49±0．13气血两虚瘀阻0．30±0．18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P<0．05。

气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中均可见部分细胞Ki67呈阳性表达，在脉络热毒证中表达指数最高，气血两虚瘀阻证中表达指数最低，二者比较具有显著性差异(P<0．05)。

4讨论

Ki67抗原为细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，分子量为345kd和395kd，其编码基因位于第10号染色体上。Ki67的表达出现于G1中期到晚期，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，到G0期则不表达，半衰期为lh或更短[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。

在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P＜0．05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。

5参考文献

1BoultonAJ.Thediabeticfoot：aglobalview.DiabetelMetabResRev，2000，16(1)：2．

细胞增殖论文篇（2）

中图分类号：R255.4R587.1文献标识码：B文章编号：1672-1349(2011)05-0545-02

糖尿病的发病率呈现快速增长,胰岛素是糖尿病治疗中不可替代的药物。胰岛素的发展经历了动物胰岛素、基因工程人胰岛素和胰岛素类似物三个阶段。甘精胰岛素和地特胰岛素作为胰岛素类似物出现,已广泛应用于临床［1］。脂肪组织是胰岛素的重要靶器官之一,前脂肪细胞具增殖能力,且能分化为脂肪细胞,作用持续于人的一生,其增殖和分化能力影响脂肪组织的构建。本文拟比较甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响,从而指导临床选择不同的胰岛素对糖尿病患者进行个体化治疗。

1资料与方法

1.1主要实验用品及化学试剂DMEM-F12培养基、胰蛋白酶购自Gibco-BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；青霉素、链霉素购自华北制药厂；噻唑兰、二甲基亚砜、人胰岛素、甲状腺素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤均购自Sigma公司；油红O染料购自Amersco公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素液体和纯品由甘李药业有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.13T3-L1前脂肪细胞的复苏准备37 ℃的温水,从液氮罐中取出冻存管,迅速投入温水中。在水中来回晃冻存管1 min左右,观察到冻存液基本融化。将冻存管中液体吸入离心管中,1 000/min离心5 min,吸弃上清,加入新的培养基,吹打均匀,使得细胞分散,以104/mL密度接种,放入CO2培养箱中培养。

1.2.2MTT法观察前脂肪细胞增殖前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,37℃、5%CO2培养24 h后,设对照组(含10%胎牛血清的D-MEM/F-12配制的完全培养液)和四组干预组(含10 nmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘体胰岛素、地特液体胰岛素的完全培养液)孵育细胞,隔日一次倒置显微镜下观察细胞并作MTT比色法测增殖。

1.2.3前脂肪细胞分化过程观察前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,D-MEM/F-12(1∶1)基础培养基中添加0.25 μmol/L胰岛素、0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素以及0.5 mmol/L IBMX作分化培养基诱导分化,设对照组(不含胰岛素)和四组干预组(含0.25 μmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘体胰岛素、地特液体胰岛素的分化培养液),3 d后改用不含IBMX的分化培养基诱导直至14 d,隔日一次显微镜观察。用油红O染色和异丙醇抽提的方法进行细胞内脂质含量定量(以OD值表示)。

1.3统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0统计学软件处理。多组间应用单因素方差分析,两两之间比较采用LSD-t检验。

2结果

2.1不同胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响3T3-L1前脂肪细胞在接种16 h左右基本完全贴壁,显微镜下观察形态类似于成纤维细胞,呈棱形、梭形或多角形,细胞核圆形,位于细胞质中央,使用油红O染色完全不能着色。接种后的第4天进入对数增长期,第10天进入增殖平台期。8 d时地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P

人胰岛素为胰腺β细胞合成和分泌的一种多肽激素,由A链和B链组成,A链含有2 1个氨基酸残基,B链含有30个氨基酸残基。甘精胰岛素是合成的人胰岛素类似物,对结构的改进是将人胰岛素A链21位由甘氨酸取代天冬氨酸,B链末端增加2个精氨酸［2］。地特胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物,它是通过去掉胰岛素肽链上B30位的苏氨酸并通过酰化作用在B29位的赖氨酸上结合了一个14碳的脂肪酸(肉豆蔻酸)而形成［3］。

在增殖实验中,到第8天时地特液体胰岛素开始抑制细胞的增殖直到第12天,第10天时甘精胰岛素促进细胞的增殖。Slieker 等［4］实验表明胰岛素B26-B30 分子结构的改变会影响与IGF-IR 的亲和力,最终影响胰岛素促进有丝分裂的能力。甘精胰岛素因为B链分子结构的改变使其促有丝分裂的能力强于其他胰岛素。Ashish等［6］在观察不同胰岛素对MCF7(乳腺癌细胞)增殖的影响时得出结论,在甘精胰岛素浓度为1.5 nmol/L～1.5 mmol/L时能明显促进细胞增殖,而地特胰岛素浓度在15 nmol/L～1.5 mmol/L时促增殖作用弱于人胰岛素。Mayer等［7］实验表明含甘精胰岛素的血清对MCF7促增殖作用是含人胰岛素血清的1.11倍,而含地特胰岛素的血清为含人胰岛素血清的0.99倍,这与本文得出的结论相似。

在观察不同胰岛素对前脂肪细胞分化影响的实验中,可以看到胰岛素为前脂肪细胞分化的必须试剂,在不含胰岛素的培养基中前脂肪细胞基本不分化。此外,人胰岛素促进前脂肪细胞分化的能力最强,甘精胰岛素次之,地特胰岛素最弱。胰岛素促进脂肪细胞分化是通过包含一系列胰岛素受体底物(IRSs)的信号网络实现的。最早发现体外培养前脂肪细胞的分化需要胰岛素,胰岛素可以提高前脂肪细胞的分化率,胰岛素在前脂肪细胞转化中起相当重要的作用［8］。Kristensen等［9］实验表明胰岛素分子结构的改变会影响与胰岛素受体的结合力,从而影响代谢能力。Peter等［5］也得出结论，人胰岛素与受体结合的能力最强,甘精稍弱,地特的结合能力最差,这可能与其促分化能力不同有关。Staiger 等［10］做出的实验表明小剂量的人胰岛素即可促进前脂肪细胞分化,这与本文结论相似。Anja 等［11］得出结论地特胰岛素小剂量和大剂量对前脂肪细胞分化的影响都低于小剂量的人胰岛素,这与本文结论一致；同时,地特胰岛素对前脂肪细胞分化的影响并非由于B29位结合的肉豆蔻酸改变信号转导通路造成的,机制尚不明确。

参考文献:

［1］Jeffrey SF,DO.Insulin Analog Therapy:Improving the match with physiologic Insulin secretion［J］.J Am Osteopath Assoc,2009,109:26-36.

［2］Andreas T,Mario T,Philippe D,et al.Mass spectrometric identification of degradation products of insulin and its long-acting analogues in human urine for doping control purposes［J］.Anal Chem,2007,79,2518 -2524.

［3］YaredND,NaveedY,Handrean S.Therole ofinsulindetemir in overweight type 2 diabetes management［J］.Vascular Health and Risk Management,2009,5：553-560.

［4］Slieker LJ,Brooke GS,Dimarchi RD,et al.Modifications in the B10 and B26-30 regions of the B chain of human insulin alter affinity for the human IGF-I receptor more than for the insulin receptor［J］.Diabetologia,1997,40:S54-S61.

［5］Ashish S,Jean G,Volker E,et al.Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines［J］.Endocrine Related Cancer,2009,16:429-441.

［6］Mayer D,Chantelau E.Treatment with insulin glargine(Lantus) increases the proliferative potency of the serum of patients with type-1 diabetes:A pilot study on MCF-7 breast cancer cells［J］.Arch Physiol Bioche,2010,116(2):73-78.

［7］Kristensen C,Kjeldsen T,Wiberg FC,et al.Alanine scanning mutagenesis of insulin［J］.J Biol Chem,1997,1272(20):12978-12983.

细胞增殖论文篇（3）

细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(Epidermal Growth Factor， EGF)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human EGF，rhEGF)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质， 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhEGF对人表皮细胞的增殖作用进行研究。

1材料及方法

1.1试剂

重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。DMEM、PRMI1640培养基为美国Gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；MTT为美国Sigma产品。

1.2实验方法及结果

1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，PBS洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%CO2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。

1.2.2MTT 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhEGF使浓度为 0，5，10，20，50，100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl MTT，常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（Relative growth rate， RGR）：RGR = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhEGF作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（PI）：PI=(S+G2/M) / (G0/G1+S+G2/M)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用PBS 洗离心除去固定液，冰冷PBS 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入cmyc， cfos和cjun单抗，使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗IgG，37 ℃作用30分钟，PBS洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。Bios Consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。

图1 表皮细胞正常光镜图

2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响

通过MTT 法测定细胞的增殖，rhEGF在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。

图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响

2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达

rhEGF处理组的细胞在DNA合成前期减少，而处于DNA合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高， S和G2/M期细胞数增加，G0/G1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhEGF处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，cmyc的标记率和表达量明显升高， cfos和cjun表达量也明显升高，结果见图3。

图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达

2讨论

表皮生长因子（EGF）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展，人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外，还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用，调控着创伤的修复。EGF与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性EGF在创面明显积累，但由于组织中的EGF含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的EGF可加速创面的愈合速度[3]。

重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhEGF对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhEGF处理细胞48h后处于DNA合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现cmyc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是G0～G1期的过渡。cfos基因蛋白cfos可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。cjun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhEGF处理表皮细胞后cmyc的标记率和表达量明显升高， cfos和cjun表达量也明显升高，提示rhEGF可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。

参考文献

1 Jahovic N， Guzel E， Arbak S et al. The healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (EGF): role of the neutrophils[J]. Burns， 2004， 30(6): 531538.

2 Nagelschmidt M， Becker D， Bonninghoff N et al.Effect of fibronection therapy and fibronection deficiency on wound healing: A study in rats [J].J Trauma， 1987， 27(1): 1267-1271.

细胞增殖论文篇（4）

细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human egf，rhegf)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质, 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞的增殖作用进行研究。wWw.133229.cOM

1材料及方法

1.1试剂

重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。dmem、prmi1640培养基为美国gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；mtt为美国sigma产品。

1.2实验方法及结果

1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，pbs洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%co2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。

1.2.2mtt 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhegf使浓度为 0,5,10，20,50,100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl mtt,常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（relative growth rate, rgr）：rgr = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhegf作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（pi）：pi=(s+g2/m) / (g0/g1+s+g2/m)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用pbs 洗离心除去固定液，冰冷pbs 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入cmyc, cfos和cjun单抗,使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗igg,37 ℃作用30分钟，pbs洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。bios consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。

图1 表皮细胞正常光镜图

2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响

通过mtt 法测定细胞的增殖，rhegf在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。

图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响

2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达

rhegf处理组的细胞在dna合成前期减少，而处于dna合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高, s和g2/m期细胞数增加，g0/g1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhegf处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，结果见图3。

图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达

2讨论

表皮生长因子（egf）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展,人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外,还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用,调控着创伤的修复。egf与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性egf在创面明显积累，但由于组织中的egf含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的egf可加速创面的愈合速度[3]。 重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhegf处理细胞48h后处于dna合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现cmyc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是g0～g1期的过渡。cfos基因蛋白cfos可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。cjun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhegf处理表皮细胞后cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，提示rhegf可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。

【参考文献】

1 jahovic n, guzel e, arbak s et al. the healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (egf): role of the neutrophils[j]. burns, 2004, 30(6): 531538.

细胞增殖论文篇（5）

【关键词】  尾加压素Ⅱ；晶状体上皮细胞；增殖；细胞信号转导；后发性白内障

Abstract?AIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferation induced by urotensin?Ⅱ(U?Ⅱ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：U?Ⅱ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction, H7, PD98059, W7 and nicardipine, were incubated with LEC separately. Then the proliferations of LEC were detected via 3H?TdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3H?TdR in U?Ⅱ group was higher than that in control group(P<0.01). The radioactivities of 3H?TdR in groups of four blockers decreased in varying degrees compared with U?Ⅱ group(P<0.01，P<0.01). The blocking effects of PD98059 and H7 were higher than that of nicardipine and W7（F= 13.251，P<0.01）. CONCLUSION：U?Ⅱ induced LEC proliferation by means of signal trasduction which can be blocked by four signal transduction blockers. The result provides a new thinking for prevention and treatment of after cataract.

?

KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract

0　引言

   

尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ, U?Ⅱ）是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质。最早由Coulouarn于1998年从人体中克隆出人U?Ⅱ（human urotensin Ⅱ, hU?Ⅱ）[1]。此后的研究表明，体内多种组织中含有U?Ⅱ。U?Ⅱ不仅具有强烈的缩血管作用[2] ，而且具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。我们曾发现眼部各组织均含有U? Ⅱ，并发现U?Ⅱ具有促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的作用。后发性白内障 (after cataract)是白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症。其病理生理机制是手术后残留的LEC发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。我们拟探讨U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制，为防治后发性白内障寻求新的途径。

1　材料和方法

学术

1.1　材料

无菌操作取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培养箱中进行晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hU?Ⅱ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品， 3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）购自上海原子核研究所，2,5?二苯基恶唑（PPO）及1,4?双?（5?苯基恶唑基?2）?苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶（trypsin）购自华美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯为市售分析纯产品。本研究采用CO2培养箱（美国FORMA 2111）、倒置研究显微镜（日本Olympus IMT?413）、低温冰箱（日本MDF?V5410）、真空泵（美国Nulgene EF006）、微量移液器（法国Gilson）、γ?液闪计数仪（西安FJ2003PS）。

1.2　方法

将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC中加入胎牛血清和DMEM培养液。U?Ⅱ组在对照组的基础上加入终浓度为10?8mol/L的 U?Ⅱ。H7组、PD98059组、W7组和尼卡地平组分别在U?Ⅱ组的基础上加入4种细胞信号转导阻断剂，终浓度分别为H7 10?5mol/L，PD98059 10?5mol/L，W7 10?6mol/L，Nicardipine 10?5mol/L。取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。在CO2培养箱中继续培养12h后，按照上述实验分组，分别加入hU?Ⅱ和 H7，PD98059，W7和尼卡地平。将LEC在CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3H?TdR（其放射比活性为每孔 3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃,30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。

  

统计学分析：用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数± 标准差（ ±s）表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差One?Way ANOVA分析。

2　结果

  

U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性（个/min）显著高于对照组 (2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P<0.01)，说明U?Ⅱ使LEC发生明显的增殖。4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低 (1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P<0.01, P<0.01)，显示这4组LEC的增殖减少，表明4种阻断剂均不同程度地阻断了U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导途径。在4种阻断剂中，PD98059组和H7 组的放射活性显著低于W7组和Nicardipine组（F=13.251，P<0.01），表明PD98059组和H7 组对U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导途径的阻断作用更强（表1）。表13H?TdR掺入法检测4种信号转导阻断剂对U?Ⅱ诱导LEC增殖的影响 (略)

3　讨论

  

U?Ⅱ是一种生长抑素样环型结构的神经肽，最早提取自鱼的尾部下垂体，1998年首次从人体克隆出来。研究表明，U?Ⅱ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质，具有较强的促进多种细胞增殖的作用。U?Ⅱ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)发生增殖，呈浓度依赖关系；降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL?10等均能抑制由U?Ⅱ诱导的VSMC增殖；U?Ⅱ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制U?Ⅱ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[4?6]。还有报道U?Ⅱ能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性。有关U?Ⅱ促进细胞增殖作用的细胞信号转导机制已有报道[7]，U?Ⅱ促进细胞增殖的途径与Ca2+介导的信号转导通路有密切关系。另有文献指出[8]，抑制与有丝分裂有关的多种信号蛋白分子，如c?src，PKC(protein kinase C)，CaM?PK，MAPK(mitogen activated protein kinase)，钙调神经磷酸酶(CaN)，均可在不同程度上抑制U?Ⅱ的有丝分裂效应，从而抑制U?Ⅱ刺激细胞增殖的作用。Watanabe等[9] 研究发现，PKCCaMGPCRMAPK的阻断剂可抑制U?Ⅱ对VSMC的增殖作用，从而间接表明U?Ⅱ是通过PKCCaMGPCRMAPK信号转导途径发挥其促增殖的作用。

   学术

我们曾发现，眼内各组织中均有一定量的U?Ⅱ，U?Ⅱ能显著促进LEC发生明显的增殖并呈浓度依赖关系。在此基础上，我们采用3H?TdR掺入法检测4种细胞信号转导阻断剂对U?Ⅱ促进LEC增殖的影响，以探讨U?Ⅱ促进LEC 增殖的信号转导机制。这4种信号转导阻断剂中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制剂，PD98059是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂，W7是钙调素（CaM）抑制剂，尼卡地平(Nicardipine)是钙通道阻滞剂。研究结果发现，4种信号转导阻断剂均能降低LEC的放射活性、阻断U?Ⅱ促进 LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖的作用减弱。间接表明U?Ⅱ是通过DG蛋白激酶C途径、受体酪氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径、 Ca2+和钙调蛋白激酶途径等细胞信号转导途径发挥其促进LEC增殖的作用，从而探明了U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制。

  

白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术后残留的LEC发生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及 Soemmering环，再向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜, 使晶状体后囊膜发生混浊，导致白内障术后视力再度下降。这是后发性白内障的主要病理生理过程。我们的前期研究发现U?Ⅱ能促进LEC增殖，提出其很可能是后发性白内障的一个重要发生机制。我们的研究结果发现，4种细胞信号转导阻断剂均能阻断U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖作用减弱。该结果一方面表明U?Ⅱ促进LEC增殖的作用及其细胞信号转导机制，阐明了后发性白内障发生发展的可能机制；另一方面揭示采用信号转导阻断剂可阻断U?Ⅱ促LEC增殖作用，减少白内障手术后的后囊膜混浊，提出这可能是防治后发性白内障的一个新途径。经广泛查阅国内外文献，有关U?Ⅱ促进晶状体上皮细胞等眼内组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见U?Ⅱ促进LEC增殖作用的细胞信号转导机制的研究报道，本研究具有一定的科学意义和应用前景。

【参考文献】

 

1　Matsushita M, Shichiri M, Fukai N, et al. Urotensin II is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinol 2003;144（5）:1825?1831

2　Maguire JJ, Kue RE, Davenport AP. Ophen?receptor ligand human urotensin II: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin?1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441?446

学术

3　张勇刚, 陈亚红, 马春艳, 等. 尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志 2001;9(1):14?16

4　夏春芳,霍勇,尹航, 等. IL?10对尾加压素II诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4):332?334

5　齐永芬, 夏春芳, 陈亚红, 等. 肾上腺髓质素对尾加压素II刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响．中国病理生理杂志 2002;18(3):230?232

6　袁杰,李菊香,李国华,等.降钙素基因相关肽对尾加压素II诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响．贵阳医学院学报 2002；21(3):129?132

细胞增殖论文篇（6）

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.583文章编号：1004-7484（2013）-07-3983-02

降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一种由37个氨基酸组成的另一种血管活性肽。动物实验表明动脉粥样硬化兔血清中的CGRP明显降低。细胞培养证实，CGRP对人血管平滑肌细胞增殖有抑制作用，并推断其作用机制是通过抑制周期蛋白D、E。使VSMC停留于G0/G1期，限制细胞周期进程而达到抑制VSMC增殖[1-3]。然而，CGRP对VSMC表型转化的影响如何还未见报道。本实验通过建立血管平滑肌细胞增殖的器官模型，以CGRP为干预因素，研究CGRP对大鼠主动脉平滑肌细胞中HRG-1和SM22表达的影响。

1材料与方法

1.1动物150g-200g健康SPF级SD大鼠。

1.2主要试剂及仪器CGRP；噻唑蓝（MTT）；兔抗大鼠HRG-1抗体、兔抗大鼠SM22抗体；山羊抗兔二抗购于武汉博士德公司；标准胎牛血清（FBS）购于杭州四季青公司BCA蛋白定量试剂盒购于美国HyClone公司。

1.3实验方法

1.3.1大鼠主动脉血管平滑肌增殖器官模型的建立和实验分组选用体重150g-200g健康大鼠12只，腹腔注射浓度为3.6%的水合氯醛（1ml/100g），取大鼠腹主动脉，用Hanks液冲洗三遍，取出血管周围多余脂肪组织，剪成2.5cm左右小段，随机分成3组：A、B、C，每组两段血管。A组用含有CGRP（终浓度为2×10-7mol/L）和ox-LDL（终浓度50μg/ml）的培养液培养，B组用含有ox-LDL（终浓度50μg/ml）的培养液培养；C组用新取出大鼠主动脉，不予培养。以上步骤所制备材料供H-E染色和抗5-Brdu免疫细胞化学染色所用。

1.3.2细胞增殖情况的测定H-E染色和Brdu标记的免疫组织化学观察细胞增殖情况。每一批免疫组化均设已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。5-Brdu阳性表达定位于细胞核。评分标准：全部阴性细胞为0分；阳性细胞数≤10%为1分；11%-50%为2分；51%-75%为3分；>75%为4分。染色强度：0分为无染色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为深棕色。免疫组化结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分，两者乘积0-1分为阴性（-）；2-3分为阳性（+）；4分以上为强阳性（++）。

1.3.3Real Time RT-PCR检测目的基因取材方法及培养方法同上。称重（约50mg）后将其剪成小块，放入预冷的研钵内快速研磨、匀浆，直至匀浆液变成无颗粒透明液体。进行总RNA提取、纯度和完整性检测。参照说明书进行逆转录反应，反应结束后，实验数据用系统自带的SDS软件（v1.4）进行分析。相对定量实验使用的分析方法为比较Ct值法。Ct值表示阈值循环，是荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。根据公式：Ct=[目的基因-内参基因]实验组样品-[参照样品基因-内参基因]对照组样品，本文实验采用Ct最大的样品组为参照组。计算实验组样品相对于对照组基因的表达量2-Ct。

1.4统计学处理实验数据均以均数±标准差（χ±s）表示。实验数据资料统计采用统计学软件SPSS for Windows 13.0。两组间比较用独立样本t检验。P

2结果

2.1HE染色和免疫组化观察血管壁平滑肌细胞的增殖情况正常对照的未予培养组（C组）管壁未见增厚，其余各组均见管壁增厚，其中加了CGRP的A组较未加CGRP的B组增厚程度明显减弱且标记到增殖细胞减少。免疫组化检测VSMC增殖显示A组呈阴性（-），而B组呈强阳性（++）。

2.2Real time RT-PCR检测HRG-1、SM22a的表达情况首先分别求出每个样品中3个重复孔目的基因，HRG-1、SM22α和内参基因18S rRNA的平均Ct值后，应用内参基因18S rRNA对各实验组样品进行校正（Ct），再取其对数，对于HRG-1、SM22α表达的差异，分别在A组和B组之间进行比较，见表1、表2。比较HRG-1、SM22α在样本中的表达差异然后对各组的样品的Ct进行归一化处理（Ct），最后根据Ct算出各组样品与对照组样品间HRG-1，见表3。SM22的表达差异，见表4。

3讨论

本文通过Brdu标记和对HRG-1检测再次证实CGRP对血管平滑肌有抑制作用，CGRP对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的机制之一可能是通过上调HRG-1来实现。HRG-1是一个平滑肌增殖通路中的负性调控基因，对这一基因的深入研究对控制血管平滑肌增殖有重要意义。本文实验用CGRP作用血管平滑肌增殖器官模型，通过Brdu标记细胞增殖和检测HRG-1的表达，发现CGRP对增殖模型中VSMC增生有明显的抑制作用，明显上调HRG-1基因的表达，两条途径验证的结果是一致的。

VSMC发育与分化是一个极其复杂的多基因调控过程。研究证实[4]，心血管疾病所伴随出现的VSMC增殖、迁移及表型转化等一些细胞事件与VSMC分化过程有许多相似之处，因此，探讨VSMC发育分化的调控机制将有助于揭示此类心血管疾病的病理本质。平滑肌细胞具有收缩型和合成型两种表型，不同表型的细胞具有不同的生物学特性和功能，收缩型VSMC呈分化状态，有较强的弹性，可以维持血管的生理功能，不能增殖；合成型VSMC呈去分化状态，核糖体和高尔基体等细胞器增多，合成和分泌功能增强，同时收缩功能消失，对外界各种有丝分裂原起反应而活跃增生[5]。增殖的合成型细胞可以从血管的中膜迁移至内膜并分泌大量的细胞外基质，并成为引起AS和血管再狭窄等血管性疾病的主要原因。既然引起VSMC发生增殖的主要原因是VSMC发生了由一系列生长因子和细胞因子引起的表型转变，使VSMC由收缩型转变为合成型，因此如何防治和逆转VSMC向合成型转变就成为近年来研究的热点和难点。SM22α经常作为一种分子模型被广泛用于VSMC基因表达调控的研究。CGRP抑制平滑肌细胞增殖有报道，而CGRP对平滑肌细胞表型转化的影响还未见文献报道，本文观察了CGRP对大鼠血管平滑肌细胞SM22α基因表达的影响，实验结果表明：CGRP可明显上调VSMC中SM22α的表达，这与平滑肌表型转化是平滑肌增殖的初始步骤理论相吻合。关于CGRP对血管平滑肌细胞表型转化的作用机理还有待进一步研究。

参考文献

[1]Koichi Shimizu，MD，PhD；Manabu Minami，MD，PhD；Rica Shubiki，BA et al.CC Chemokine Receptor-1 ACtivates Intimal Smooth MuscleLike Cells in Graft Arterial Disease[J].Circulation，2009，120：1800-1813.

[2]songY，Bi L，Zhang Z，et al.Increased levels of calcitonin gene-related peptide in derum accelerate fracture healing following trau-matic brain injury[J].Molmed report，2012，2：432-438.

细胞增殖论文篇（7）

【关键词】：颅内生殖细胞瘤；影像学特征

在颅内肿瘤的发病率中，生殖细胞瘤占到1-2%，其多发地区为亚洲。颅内生殖细胞瘤是最为常见的生殖细胞肿瘤，松果体区生殖细胞瘤可占颅内生殖细胞瘤总数的50%以上。对我院2008年4月至2012年8月收治的经手术和病理证实为颅内生殖细胞瘤的54例患者的临床资料和MRI特征进行回顾性分析，以促进诊断水平的有效提升，现报告如下。

1.资料和方法

1.1一般资料

54例患者均经手术和病理证实为颅内生殖细胞瘤，其中有48例男性患者，6例女性患者，年龄在8～33岁之间，平均年龄为15岁，其中18岁以下的未成年患者有45例，占总病例的83%。病程为15天至30个月，平均病程为11个月。有28例患者病变部位为松果体区，占总病例的52%，21例患者病变部位为鞍区，占总病例的39%，5例患者病变部位为丘脑和基底节区，占总病例的9%。

1.2影像学检查方法

采用GEBrightspeed多层螺旋CT机作为扫描机，层间距和层厚都是5mm。先进行平扫，然后进行增强扫描，欧乃派克或优雅先可作为对比剂，用量为300mg/ml，推注时使用CT专用高压注射器，注射剂量是80～100ml，注射流率是3ml/s。对所有患者采用1.5TMR成像仪进行MRI检查，使用头部专用线圈，自旋回波序列（SE）应用于T1WI中，快速自旋回波序列（FSE）应用于T2WI中；国产（北陆）磁显葡胺（Gd-DTPA）是在对扫描进行增强时所采用的对比剂，剂量是0.1mmol/kg，经肘静脉向后行矢状面、横断面及冠状面快速注入，然后进行T1WI扫描。本组54例患者中，对8例患者只行CT检查，对18例患者只行MRI检查，对其余28例患者同时行CT和MRI检查[1]。

1.3观察指标

对患者的颅内压增高症状、研究运动障碍、小脑症状等进行认真细致的观察。MRI影像观察指标为肿瘤位置、生长方向、囊变坏死、增强后的肿瘤强化程度等。

2.结果

本组54例患者中行头颅CT检查的患者在检查之后显示，病变位于鞍区的有28例患者，占颅内生殖细胞瘤总数的51.9%，表现为圆形、椭圆形混杂密度，具有清晰的边缘，如果增强CT扫描，可见病灶呈均匀强化，和平时相比，病灶范围略有增加，生殖细胞瘤是等T1、等或稍长的T2信号，具有均匀、明显强化的特征；行MRI检查的患者在检查之后显示，依据具体部位的不同，可以将鞍区生殖细胞瘤囊分为三类，21例患者为鞍区生殖细胞瘤，5例患者为丘脑和基底节区生殖细胞瘤。丘脑和基底节区生殖细胞瘤多表现为混杂T1和混杂长T2信号，具有斑片样、囊壁环形分隔样增强等特征。

3.讨论

生殖细胞肿瘤十分常见，下至新生儿上至老年人都可发生，但青少年最多见。肿瘤的病理类型不同，发生的最小年龄和平均年龄就会不同，生殖细胞瘤发生的最小年龄是6岁，12～14岁是发病的高峰；平均年龄是10岁。松果体区生殖细胞瘤由于所具有的病理组织类型不同而具有不同的CT征象，可表现为类圆形、圆形等，可呈等密度、等高混杂密度等。生殖细胞瘤大多有钙化，具有不规则的边界，多表现均匀一致的强化。

一般情况下，松果体区生殖细胞肿瘤位于中线，相对于CT来说，MRI能够更好地将肿瘤的大小和部位显示出来。如果肿瘤比较小，CT就很容易将其遗漏掉。如果中脑导水管或大脑大静脉受压，在MRI上就会表现出上述流空效应减弱，这是一种较早的间接征象，发生原因是较小的肿瘤受到了轻度占位效应，而部分正常人的松果体会呈现囊性，大小可达10～15mm，和脑脊液信号相比，T1？和T2加权像都比较高。在T1加权像下，生殖细胞瘤都呈等信号[2]。肿瘤可沿脑脊液种植播散，因此在对其进行检查时应该将矢状位和冠状位包括在内，尽可能也包括颈段椎管的一部分，如果不太相信检查结果，应该做Gd-DTPA增强扫描。由于生殖细胞瘤对放射治疗十分敏感，因此在治疗之后MRI异常信号就会消失。

终上所述，颅内生殖细胞瘤的发病年龄、性别及MRI比较特殊，一般情况下可以做出正确诊断。

细胞增殖论文篇（8）

关键词：干细胞培养 丙酮酸钠 细胞增殖 细胞分化

1.引言

间充质干细胞具有多向分化特性，来源广泛，可从多种组织中提取。近期一系列研究表明，在正常及轻度退变椎间盘的纤维环中都存在具有多向分化特性的细胞，能在体外培养条件下被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，具有间充质干细胞的特征，但这些细胞的增殖能力有限1-3。

本研究从兔纤维环组织中分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，通过改变细胞培养条件，考察其增殖能力和多向分化潜力，以期获取大量具有良好状态的干细胞。

2.材料与方法

2.1 药品与试剂

5～7月龄的新西兰大白兔由苏州大学南校区动物房获得。

DMEM-LG培养基、胎牛血清FBS、青-链霉素，购自Hyclone公司。

胰酶，购自Gibco公司。

成脂诱导培养基、成骨诱导培养基购自cyagen公司，茜素红、油红O购自Sigma-Aldrich公司。

2.2 兔纤维环间充质干细胞提取

空气栓塞法处死新西兰大白兔后，在无菌状态下快速获取椎间盘组织并将纤维环组织分离出。将组织剪碎，以I型胶原酶消化、过滤。过滤后的细胞液体离心计数后接种于培养瓶中，分别加入2种培养基进行培养。其中一种培养基为含10% FBS的DMEM-LG细胞培养液，另一种为含10% FBS和200 ug/mL丙酮酸钠的DMEM-LG细胞培养液，于37℃、5％的CO2培养箱中培养。每3天换1次液。

2.3 细胞增殖检测

将细胞按1000细胞/孔的密度接种于96孔板中，分别以无丙酮酸钠和含丙酮酸钠的DMEM-LG培养基连续9天检测细胞的增殖情况，每天6个复孔。进行MTT检测。

2.4 诱导分化检测

将两种条件下培养的细胞分别按2×104细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板中，待细胞长到80-90%时，进行成脂分化和成骨分化。成脂诱导2周后进行油红染色。成骨诱导3周后茜素红进行染色。

3.结果

3.1 丙酮酸钠促进兔间充质干细胞集落形成

细胞悬液按一定密度接种到100 mm培养皿中后，到第3-4天即可观察到集落的产生，集落逐渐增大，到10天左右即可形成大量集落。对比有丙酮酸钠和没丙酮酸钠的培养基可发现，在相同接种密度的条件下，丙酮酸钠组形成的集落数更多，集落中的细胞数也更多。

3.2 丙酮酸钠促进兔间充质干细胞增殖

MTT增殖检测发现，细胞从第1天开始增殖，第3天开始进入对数期，第6天以较为缓慢的速度继续增殖直至第9天。对比无丙酮酸钠组和丙酮酸钠组，相同条件下，丙酮酸钠组的细胞数明显更多。

3.3 丙酮酸钠维持兔间充质干细胞的状态

在细胞形貌上，无丙酮酸钠组细胞呈现异质性，有些呈梭形，有些呈纤维细胞状；而丙酮酸钠组的细胞则相对较为均匀，均呈现梭形。在传代次数上，无丙酮酸钠组的细胞只能传3-4代，细胞即停止增殖，由原来的梭形以及纤维细胞状转变为扁平无规状细胞。而丙酮酸钠组的细胞则至少可传代到6代以上，同时细胞也仍旧保持梭形的形貌。

3.4 丙酮酸钠抑制兔间充质干细胞的自发分化

将无丙酮酸钠组细胞和非丙酮酸钠组细胞接种到24孔板中，分别进行成脂诱导和成骨诱导。在诱导组分别使用诱导培养基，对照组使用含10% FBS的DMEM-LG培养基。但是在无丙酮酸钠组，对照组的细胞易自发成脂的现象。在培养1周后即自发产生脂滴，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大。油红染色后，亦有明显的染色现象。但是丙酮酸钠组的细胞则自发成脂的现象明显减轻。自发成骨的现象也更弱些。

4.讨论

本研究从兔子的纤维环组织中成功分离出一群具有克隆形成能力的细胞，该细胞较好地维持了原有形态。通过在DMEM-LG培养基中添加丙酮酸钠，发现丙酮酸钠可明显促进兔间充质干细胞的集落形成及增殖速度。此外，丙酮酸钠可维持干细胞的干细胞特性，维持较为均一的梭形形态，可传代6次以上。同时不影响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化，在组织工程中将有良好的应用前景。

参考文献：

细胞增殖论文篇（9）

姜黄素（Curcumin）是从中药姜黄中提取的酚性色素，具有多方面的药理作用［1］ ，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等。我们应用Tca8113细胞为靶点，探讨姜黄素对其增殖的细胞周期各时相的改变，旨在为舌癌治疗提供理论依据，兹将结果报告如下:

1 材料和方法

1.1 材料 Tca8113细胞株，由北京医科大学口腔医院蕙赠;姜黄素购于上海化学试剂采购站（分析纯）;RPMI1640培养基、MTT（塞唑蓝）购于美国Sigma公司;胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取对数生长期的Tca8113细胞。经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，调细胞数为2×10 8 .L。接种于96孔塑料培养板内，每孔100μl.孔。分别加入10、20、40g.L姜黄素，每个浓度6复孔，同时设空白对照组，共4组。培养24h，于培养结束前6h加入MTT试剂20μl.孔，终浓度为0.5g.L。继续培养6h后加入酸化异丙醇50μl.孔。振荡5min，使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪在550波长处测定各孔吸光度A值，计算肿瘤细胞抑制率。

肿瘤细胞抑制率=（1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值）×100%

1.2.2 应用流式细胞仪检测 Tca8113细胞周期各时相变化及凋亡率，细胞培养及分组同1.2.1，培养结束后，胰蛋白酶消化。收集细胞，PBS洗2次，离心弃上清，用70%冷乙醇固定，上机前过4S目网，调细胞数为1×10 9 .L，测定细胞周期各时相变化。

1.2.3 透射电镜观察 Tca8113细胞亚结构改变，收集经姜黄素作用的Tca8113细胞。离心弃上清，用2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定。环氧树脂包埋。超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电镜观察并拍照。

1.2.4 统计学分析 组间比较用t检验，数据以均数标准差（ˉx±s）表示。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素对Tca8113细胞增殖抑制率的 影响 见表1。

表1 不同浓度姜黄素对Tca8113细胞增殖抑制率的影响（略）

表1结果表明，不同浓度姜黄素对Tca8113细胞增殖抑制率随着药物浓度的增加而升高，与对照组相比差异非常显著。

2.2 不同沈度姜黄素对Tca8113细胞周期及凋亡率的影响 见表2。

表2结果表明，随着姜黄素浓度增加，作用时间间延长，效果越明显，其凋亡率亦上升，20g.L组姜黄素对Tca8113细胞凋亡率可达11.5%。

表2 不同浓度姜黄素对Tca8113细胞周期及凋亡率的影响（略）

3 讨论

近年来，细胞周期的研究取得令人注目的成绩，特别是细胞周期中不同时相的改变为肿瘤预防和治疗提供了重要的理论依据。

我们应用MTT比色法测定姜黄素对Tca8113细胞的增殖抑制率，结果表明。姜黄素可明显抑制Tca8113细胞增殖，与对照组相比差异非常显著，且具有时间剂量依赖性。MTT试剂可被哺乳动物活细胞中线粒体脱氢酶还原成蓝色甲 颗粒，且甲 生成的量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系［2］ 。因此被广泛用于抗肿瘤药物的筛选。

流式细胞仪结果显示，不同浓度的姜黄素对Tca8113细胞增殖周期均有明显影响，组间比较差异均显著，结果显示G 1 期细胞增多，S期细胞减少，G 2 .M期细胞相对增多，G 1 期细胞又称细胞复制前期，是指细胞从有丝分裂到DNA复制之前，G 1 期是制造产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，所以说G 1 期是细胞复制周期运行的关键，同时G 1 期也是药物等因素作用的敏感点［3］ 。因而抑制细胞周期的G 1 期的RNA及核蛋白体的合成，可间接的使肿 瘤细胞的RNA合成减少，延缓肿瘤细胞的增殖。G 2 .M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应，多种细胞损伤剂不仅可引起G 1 期细胞停滞，亦可引起G 2 .M期细胞阻滞［4］ 。我们的结果显示，姜黄素对Tca8113细胞G 1 期阻滞，G 1 期细胞堆积，不能进入S期，阻滞G 1 期细胞向S期的进程，从而使G 2 .M期细胞相对增多，细胞凋亡率升高。

电子显微镜观察所见，细胞肿胀、细胞核变小，细胞质高度空化。总之，根据我们的实验结果，证明姜黄素对Tca8113细胞增殖有明显的抑制作用，为舌癌治疗提供了理论依据。

参考文献

［1］孙春艳，刘新月，陈 燕.姜黄素抗肿瘤机制研究进展［J］.国外医学肿瘤学分册，2003，30（5）:354-357.

细胞增殖论文篇（10）

目的 探讨海洛因及嘌呤核苷酸对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法 体外培养大鼠 C6 神经胶质瘤细胞，分别以不同浓度的海洛因及嘌呤核苷酸处理细胞，MTT 比色法检测海洛因和嘌呤核苷酸对细胞增殖的影响。 结果 MTT 实验表明，海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，120 mg/L海洛因作用 24 h对 C6 细胞的抑制率达 52%，并表现为剂量依赖性；嘌呤核苷酸对 C6 细胞的增殖有促进作用，120 mg/L嘌呤核苷酸作用 24 h，细胞增殖率为 30%，并表现为剂量依赖性。结论 海洛因抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖；嘌呤核苷酸促进大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖，并在某种程度上对抗海洛因对 C6 细胞增殖的抑制作用。

【关键词】 嘌呤核苷酸；海洛因；神经胶质瘤细胞；细胞增殖。

【Abstract】Objective To investigate the effects of heroin and purine nucleotides on the proliferation of C6 glioma cells. Methods The effects of heroin and purine nucleotides on the proliferation of C6 glioma cells were evaluated by MTT assay. Results Heroin inhibited the growth of C6 glioma cells in vitro，52% C6 glioma cells were inhibited when the cells were treated with 120 mg/L heroin for 24 h；purine nucleotides promoted the proliferation of C6 glioma cells，30% C6 glioma cells were promoted when the cells were treated with 120 mg /L purine nucleotides for 24 h. Conclusions Heroin inhibits the proliferation of C6 glioma cells，purine nucleotides promotes the proliferation of C6 glioma cells.

【Key words】Purine nucleotides；Heroin；Glioma cells；Proliferation

由于大鼠 C6 神经胶质瘤细胞膜上存在阿片受体，目前已被广泛用作研究各种阿片类药物作用机制的模型系统〔1，2〕。本实验室研究发现，海洛因不但能够抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖，而且还能使细胞内嘌呤核苷酸分解代谢增强〔3，4〕。已经明确的是海洛因对 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，但是嘌呤核苷酸对经过海洛因处理过的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖是否有影响并未见报道。本实验在前期研究发现的基础上，以大鼠 C6 神经胶质瘤细胞作为靶细胞，研究嘌呤核苷酸对海洛因处理的大鼠C6 神经胶质瘤细胞增殖的影响，探索嘌呤核苷酸治疗阿片类成瘾的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

C6 细胞株购自上海细胞研究所。低温台式离心机购自上海化工机械厂。倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司。CO2培养箱购自日本 SANYO 公司。超净工作台购自苏州尚田洁净技术有限公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，新生牛血清购自天津血液研究所。噻唑蓝 (MTT)、一磷酸腺苷 AMP 和一磷酸鸟苷 GMP购自Sigma公司。海洛因 (纯度为99% ) 由吉林省公安厅提供，临用时用灭菌三蒸水溶解。

1.2 大鼠 C6 神经胶质瘤细胞培养

C6 为贴壁生长的细胞。培养基为 DMEM，每100 ml培养基含青霉素 1 万U，链霉素10 mg，新生牛血清 15 ml，用灭菌的 5.6% NaHCO3 溶液调 pH7.2，置于 CO2 孵箱，37℃、5% CO2 条件下培养。细胞生长至近融合状态时，用 0.25% 胰酶消化传代，每周2～3次。

1.3 MTT 比色法检测海洛因对

C6 细胞增殖的影响及最佳药物剂量筛选 将处于对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，用吸管将细胞吹打成单细胞悬液，血细胞计数板计数；将细胞以 1×104个/cm2 的浓度接种到 96 孔细胞培养板中，每组均设 3 个平行孔。以生理盐水作对照，加入海洛因使其终浓度分别为10、40、80 和 120 mg/L，37℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后加入 20 μl浓度为 5 g/L的MTT，培养箱中继续培养 4 h；弃培养基，每孔加入 DMSO 200 μl，室温振荡 10 min 后，用酶标仪在波长 490 nm处测定吸光度值，计算细胞的生存率 (%) = (各实验组 OD 值/对照组 OD 值)×100%，绘制细胞生长曲线。

1.4 MTT 比色法测定嘌呤核苷酸对海洛因处理细胞增殖的影响

将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，用吸管将细胞吹打成单细胞悬液，血球计数板计数；将细胞以1×104个/cm2的浓度接种到96孔细胞培养板中，每组均设3个平行孔。对照组为海洛因处理组，加入海洛因使其终浓度为120 mg/L；嘌呤核苷酸处理组在加入120 mg/L海洛因的同时，加入等摩尔混合的嘌呤核苷酸，使嘌呤核苷酸终浓度分别为10、40、80和120 mg/L，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加入20 μl浓度为 5 g/L 的MTT，培养箱中继续培养4 h；每孔加入 DMSO 200 μl，室温振荡10 min 后，用酶标仪在波长 490 nm处测定吸光度值，计算细胞生存率(%)=(各实验组OD值/对照组OD值)×100%，绘制细胞生长曲线。

1.5 统计学分析

用SPSS 13.0 统计分析软件进行方差齐性检验及成组设计资料 t检验。

2 结 果

2.1 海洛因对C6 细胞增殖的影响及最佳药物浓度

MTT 实验发现，低剂量 (10 mg/L) 的海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用并不明显，490 nm处吸光度值为1.393±0.084，其抑制率仅为 7%，与对照组(1.497±0.091)比较差异不显著 (P＞0.05)。当海洛因的浓度达到40 mg/L时，490 nm处吸光度值为0.967±0.097，对 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制率为 35%；海洛因浓度为 80 mg/L 时，490 nm处吸光度值为0.777±0.067，抑制率为 48%；海洛因浓度为 120 mg/L 时，490 nm处吸光度值为0.713±0.068，抑制率为 52%；与对照组比较，差异均有显著性 (P＜0.05)。因此本文选择 120 mg/L的海洛因作为最佳药物剂量。

2.2 嘌呤核苷酸对海洛因处理的 C6 细胞增殖的影响

海洛因对照组490 nm处OD值为0.847±0.081，与海洛因组比较，嘌呤核苷酸的浓度为 10和 40 mg/L 时，490 nm处OD值分别为(0.573±0.077，0.803±0.098)，对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的作用并不明显 (P＞0.05)。嘌呤核苷酸的浓度达到80 mg/L时，490 nm处OD值为1.037±0.059，细胞增殖率为 22%；嘌呤核苷酸的浓度为 120 mg/L时，490 nm处OD值为1.097±0.114，细胞增殖率为 30%；与海洛因组比较，差异均有显著性 (P＜0.05)。

3 讨 论

研究发现，海洛因能够抑制体外培养的大鼠神经元细胞增殖，其机制是海洛因诱导神经元细胞凋亡〔5〕。阿片类药物吗啡对去甲基丙咪嗪 (抗抑郁药) 和内皮素等药物处理后的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用〔6〕。除此之外，本研究还发现，吗啡对没有经过任何药物处理的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖也有抑制作用〔7〕。海洛因抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖，其机制是海洛因使大鼠 C6 神经胶质瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA) 表达减少 〔3，4〕。本实验通过 MTT 比色法也证实了海洛因浓度达到 40 mg/L 时，以剂量依赖的方式抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖。同时，本实验通过 MTT 比色法证明，嘌呤核苷酸的浓度达到 80 mg/L时，以剂量依赖的方式促进大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖。这一结果表明，嘌呤核苷酸能够对抗海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用，其机制有待进一步探讨。

参考文献

1 Bohn LM，Belcheva MM，Coscia CJ.Evidence for kappa and muopioid receptor expression in C6 glioma cells 〔J〕.J Neurochem，1998；70(5)：181925.

2 Hauser KF，Houdi AA，Trubek CS，et al.Opioid intrinsically inhibit the genesis of mouse cerebellar granule neuron precursors in vitro ：differential impact of mu and delta receptor activation on proliferation and neurite elongation〔J〕.Eur J Nerosci，2000；12(4)：128193.

3 迟秀梅，张纪周，阚慕杰，等.海洛因对 C6 细胞增殖细胞核抗原基因表达的影响〔J〕.吉林大学学报（医学版），2008；34(6)：94951.

4 迟秀梅，阚慕杰，李 奇，等.海洛因对 C6 细胞嘌呤核苷酸分解代谢基因表达的影响〔J〕.中国实验诊断学，2008；12(5)：58991.