关节软骨的生物力学特性汇总十篇
关节软骨的生物力学特性篇（1）
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨退变、关节缘骨质增生为主要改变的疾病，临床尚缺乏根治措施，建立动物模型是研究OA发病机制、治疗及预防的必要手段。
OA分继发性和原发性，故OA动物模型可从制作方法上分为两大类：一类为诱发模型，即通过各种操作方法如关节制动、手术、关节内注射物质等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发产生OA，如C57黑鼠、STR／ort小鼠等；除以上两类模型外，还有一种模拟骨关节炎模型的方法，即关节软骨细胞体外培养。
1 诱发模型
1.1 关节制动
根据其制动位置可分为屈曲位、中间位、伸直位，伸直位时尚可施加外力挤压；将动物的关节长期固定于某一位置后，由于关节应力的改变可产生关节软骨退变进而形成OA。屈曲位时因减少了横跨膝关节的肌肉的收缩而导致关节软骨的萎缩性变化；若以伸直位制动，限制了关节的运动，肌肉、关节囊收缩，对关节面产生了过度压力，导致了OA的发生〔1〕；伸直位并施加压力时因增大关节面压力而进一步促进OA的形成。Evans等〔2〕观察发现家兔膝关节制动60 d后，大部分关节软骨的变化无法逆转；若制动不超过30 d，病变则有恢复的可能〔3、4〕。对人膝关节制动后，其关节软骨的病变与动物实验中所见到的改变相似。动物实验表明，无论是短期的反复制动或是持续性制动，若制动时间超过30 d，则可导致进行性OA的发生。在研究临床OA的发病机制及治疗反应时，将兔膝关节于伸直位制动5～6周是较好的OA动物模型制作方法之一〔6〕。尚平等〔5〕比较过屈位和过伸位固定制作OA模型的优劣，结论是两者均能成功制作OA模型，但前者简便、固定牢靠、耗材少、家兔适用性好、成功率高。
1.2 手术方法
1.2.1 关节内手术
1.2.1.1 前交叉韧带或（和）半月板切除
关节不稳定时由于关节应力发生变化（局部增大或减小）会造成关节的退行性改变，从而导致骨关节炎的发生。Pond等将犬膝关节前交叉韧带切断，观察到实验肢体的发展过程和自然发生（前交叉韧带破裂所致）关节不稳定是一样的，并且其最后的肉眼病理表现与骨关节炎是一样的〔3〕。王君等〔6〕在切除兔前交叉韧带的基础上固定手术对侧肢体使手术侧肢体过度负重形成兔膝负重模型，该模型造模时间较单纯切断前交叉韧带造模时间短。Moskowitz等〔3、7〕将兔膝关节半月板部分切除来造成关节的不稳定，从而得到骨关节炎模型；仅切除内侧半月板，半年后也可出现类似早期OA的形态学和生化改变；单纯半月板切除可减轻手术造成的损伤，但造模时间也相应延长。去神经支配本身不引起关节退变，但能加速交叉韧带或半月板切除动物模型的关节退变〔3〕。
1.2.1.2 切除兔后肢膝关节籽骨韧带3～4 mm或腓侧韧带3～4 mm和前外侧半月板4～5 mm，以及部分或全部切除髌骨，均可导致不同程度的OA改变〔8〕；股骨髁切除亦可导致OA的形成〔9〕。
1.2.1.3 Hulth模型
此为经典手术造模方式，具体步骤为：将动物麻醉后仰卧于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。术后不固定伤肢，自由活动，可适当给予抗生素预防感染〔10〕。胡阿威等〔11〕在Hulth模型基础上进行了改良，即按Hulth法行动物手术后7 d驱赶动物，每日30 min，分2次驱赶，驱赶动物4周后即得明显的OA模型。
1.2.1.4 关节划痕
在幼犬的关节软骨上用圆绞刀造成广泛且深度不等的软骨及软骨下骨缺损，2周后局部出现软骨细胞变性、基质中异染物质丧失〔1〕。为避免关节内划痕关节内操作对OA模型的影响，Marijnissen等〔3、12〕提出一种新的关节刻痕OA模型，方法是在狗的膝关节股骨髁上刻痕，不损伤软骨下骨，术后将对侧肢体固定于躯体上，迫使手术肢体负重，每周3 d，每天4 h，共20周。20和40周（后20周正常负重）后，关节软骨的生化表现与临床非常相似，并且关节炎症很轻微。由于关节的退变由一过性软骨损伤造成的，且炎症反应轻微，认为这是一个观察OA早期表现及治疗效果的理想模型，尤其是观察主要针对软骨保护和修复的治疗措施疗效时更为敏感。与切断前交叉韧带造模相比，关节划痕造模（Marijnissen法）对于观察治疗效果更好，因为前者关节不稳定持续存在从而影响治疗效果的观察〔12〕。
1.2.2 关节外手术
1.2.2.1 改变关节应力
（1）增加关节应力：陈宝兴等〔3〕用出生后1周内的Wistar种大鼠，结扎其双前肢及尾部，常规饲养，由于大鼠直立的异常体位，使髋关节应力增加从而产生OA。
（2）降低关节应力：王胜等〔13〕用手术方法延长兔髌韧带3 mm，降低髌股关节压力，术后6周开始出现软骨细胞增生、排列紊乱；16周时软骨已明显变薄，并且出现纵裂纹和胶原纤维增粗、断裂。由低应力导致的软骨退变早期，软骨细胞缺乏软骨退变中常见的代偿性增生表现说明低应力可能对软骨退变修复有抑制作用。
1.2.2.2 臀肌切断
关节生物力学的紊乱是骨关节炎主要病因之一，但关节内手术途径所得到的OA模型不能排除手术所致创伤性滑膜炎对实验的千扰，因此白希壮等采取完全切断豚鼠附着在髂嵴上的臀大肌及深部的臀中、小肌，切除远侧断端1 cm，从而获得满意的髋OA模型〔3、14〕。
1.2.2.3 破坏关节血液循环
关节局部的血液循环异常也是关节的致病因素之一。结扎狗膝关节周围的静脉可导致关节软骨的局部损伤和变性；结扎大鼠股静脉并切除1 cm且切断髂内静脉、切除踝至膝部的大隐静脉，8周后可见关节软骨的钙化层增厚、新骨形成、松质骨硬化，与临床OA的变化相似〔1〕。刘蜀彬等〔15〕采用阻断成年大耳白兔干骺端髓内血运成功地诱发骨关节退行性病变。其方法为：将成年大耳白兔于右侧股骨下端外侧切开皮肤、皮下组织，于关节外分开肌肉，显露股骨下端，以骨钻将股骨干骺端钻一直径0.5 cm之骨圆窗，将该处髓质刮除，直达对侧骨皮质，以骨蜡填塞，阻断股骨干骺端的髓内血运，缝合伤口。在左侧股骨下端外侧做同样手术切口，但不做骨的开窗，缝合切口，做为对照组。该方法短期内可获得满意的早期骨关节炎病变的动物模型、无滑膜炎症的影响且由于干骺端血供并非完全阻断，因此模型具有一定的仿真性、对关节未造成不可逆转的影响有利于后续实验。
1.2.2.4 卵巢切除
Pernille等〔16〕将SpragueDawley鼠卵巢切除制作绝经后骨关节炎模型，结果表明代表软骨变化的CTXⅡ（collagen type Ⅱ degradation products）及代表骨吸收的CTXⅠ较对照组明显升高，且第4周时两者的水平及此时关节变化与关节最终的变化呈明显相关性；该模型为研究雌激素及其类似物质对关节软骨保护作用的有用模型。
1.3 关节腔注射物质
1.3.1 尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）
石辉等〔17〕利用关节腔注射尿激酶的方法制作兔骨关节炎模型，实验12周即可完成，其方法为：实验组在右膝关节内注射uPA 0.4 pg／0.2 mL，对照组注射等容量的生理盐水，注射完成后在4、8、12周分批取兔滑膜进行组织学观察、取软骨行组织学观察及电镜检查，12周形成的关节炎模型与符合OA的组织病理特征。
1.3.2 木瓜蛋白酶（papain）
Havdrup等〔18〕以20％的papain 0.2 ml注射入兔膝关节2周后即可见关节软骨退变、成骨细胞活动、骨赘形成，而注射浓缩papain后2 d即可见关节软骨退变，注射后3 d可见成骨细胞活动，1周后可见骨赘形成；前者退行性变较后者明显。以4％的papain 0.3 ml分别于实验的第1、4、7 d注入兔髋关节中，可制作稳定的退行性关节炎〔8〕。杨峰等〔19〕于兔颞颌关节内注射0.3 ml 1.6％木瓜蛋白酶溶液，1周后重复1次，注射后2周即可见软骨退变、骨质增生。
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1.3.3 胶原蛋白酶
Kikuchi等〔20〕将不同剂量的胶原酶（0.5、10，2.0 mg）注入成年兔膝关节腔内，组织炎性反应于注射后1周最重，其后逐渐减轻，至第6周时呈慢性病变后变化较小；注射后2周关节软骨表层缺失、移行层软骨细胞消失并出现裂口；4周时移行区及放射区细胞克隆中度增殖；6周后组织学观察发现关节软骨和滑膜均有变性，与胶原酶剂量呈正相关，外侧股骨髁和胫骨平台处病变较内侧重，移行区及放射区细胞增殖更明显。其关节软骨骨关节炎样改变与人的骨关节炎相似，该方法时间短、药物剂量小，因此该方法在研究骨关节炎病理及抗骨关节炎药物作用时适用。
1.3.4 菲律宾菌素（Filipin）
菲律宾菌素（一种抗生素，提取自在菲律宾发现的微生物）可破坏溶酶体，将其注入兔膝关节腔后可使滑膜增生、基质中蛋白多糖含量降低、关节周缘骨赘产生等〔1〕。
另外，肾上腺皮质激素、透明质酸酶、乙烯亚胺多聚物、单体碘乙酸、软骨碎片或微粒、异物等注入动物膝关节内也可导致关节软骨的退行性改变〔1、8、16〕。
2 自发模型
2.1 C57黑鼠和Hartley豚鼠
Silberberg于1941年首先发现C57黑鼠具有自发形成OA的特性，但C57黑鼠OA模型与人存在一定的差别，主要表现为几乎无关节软骨的微纤维化，关节软骨剥离脱落呈腐蚀状，软骨细胞几无集簇形成，无骨棘形成，滑膜炎症不明显，OA进展过程中不伴有GAG、DNA合成增加。Hartley豚鼠亦有自发OA的特性〔8、21〕，其OA组织学变化随年龄增长逐渐加重。C57黑鼠体积小、不易观察、OA表现与人OA存在一定区别，与之相比，Hartley豚鼠发病率与人OA相似，易于饲养、观察且费用相对较低〔21〕。
2.2 基因缺陷自发OA模型
2.2.1 Ⅱ型前胶原基因缺陷小鼠模型
正常软骨基质胶原以Ⅱ型为主，Ⅱ型前胶原基因点突变使Ⅱ型胶原合成障碍，可导致家族性的OA，呈常染色体显性遗传，并伴有轻度的脊柱软骨发育不良〔10〕。
2.2.2 双糖链蛋白多糖／纤维调节素相关基因缺陷小鼠模型
双糖链蛋白多糖／纤维调节素基因联合缺陷小鼠胶原合成减少，肌腱胶原纤维在结构和机械性能上均发生改变，引起关节不稳定、步态改变、肌腱异位钙化，出现严重早发并快速进展的OA〔10〕。
2.3 基因转录障碍模型
STR／ort小鼠邻近胫骨OA样病损区软骨细胞缺乏胶原Ⅱ、X、Ⅺ和蛋白聚糖（aggrecan）的基因转录，从而使软骨基质合成障碍，在27周龄左右会自然产生膝关节OA病变，雄性STR／ort小鼠发生比例高且病变较严重。
3 关节软骨细胞体外培养
Ross等〔22〕取正常狗胫骨平台软骨，经过切割、酶解消化、稀释离心冲洗并于特殊的培养液（其组成为DMEM（Dullbeccos modified Eagles medium）、10％牛胎血清、50 μg／ml抗坏血酸盐、100 U／ml青霉素、100 μg／ml链霉素）中培养4周，培养后第1、2 d、第1、2、3、4周分别取样、免疫标记Ⅱ型、Ⅳ型胶原等，在共焦显微镜下观察并与骨关节炎动物关节软骨比较，初步研究结果表明两者病理结构相似，提示培养过程中软骨改变与骨关节炎病程相似，因此可作为研究骨关节炎起病及进展的体外模型。
4 骨关节炎动物模型的选择
自发性OA模型较少受外界因素干扰，可排除操作所致的误差，在研究原发性OA的起始机制、关节软骨生化改变和防治效果的比较等方面具有极大优势，可帮助研究人类骨关节炎众多病理生理改变之间的因果关系，以STP／ort小鼠和Hartley豚鼠模型应用较多。
经由关节外途径制作的模型由于无手术创伤对关节内的影响，适于研究药物疗效及药物对关节软骨成分、炎症介质、蛋白酶等表达的影响和治疗药物的筛选，也适合用于研究步态异常等关节外生物机械因素所致骨关节炎。卵巢切除可作为绝经后骨关节炎模型研究雌激素及其类似物对关节软骨的保护作用。
关节内手术方法如Hulth法等模型诱导成功率高，稳定性好，应用广泛，特别适用于膝关节内注药预防和减轻OA病理改变的研究。但由于手术创伤及炎症易影响OA模型软骨、滑膜的生化代谢，因此不适宜观察OA生化代谢的变化。
关节腔内注射化学物建模所需时间短，可模拟软骨破坏的终末环节，适于软骨病理、药物防治的研究〔10〕，需注意的是不同部位的OA模型所需的药物剂量可能不同。
鼠模型关节软骨退变的组织学特征与人类OA相似，但其关节几何形状与人类稍有不同且软骨不含硫酸角质素，以大鼠或小鼠为OA模型时需考虑上述差异，但用于药物防治软骨退变的研究，鼠模型能满足上述要求；小鼠等小型动物在需要大量使用时具有选择优势。狗、兔膝关节组织结构与人类接近，其OA模型的软骨生化指标与人类OA一致，如研究OA的病理进程、组织病理特征或软骨生化代谢的变化，选用狗、兔模型较适宜〔3、8〕。
关节软骨体外培养可了解骨关节炎病理生理过程，但该方法尚需进一步发现反应骨关节炎的指标，因此目前尚不成熟。
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关节软骨的生物力学特性篇（2）
【摘要】 ：很多实验证明软骨下骨在骨关节炎的发生发展过程中发挥着重要作用，软骨下骨硬化可能是关节炎发病的始发因素，但是关节软骨退变与软骨下骨硬化之间的因果关系至今仍不完全清楚。骨重塑异常导致的软骨下骨硬化，极大的减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用，使其丧失保护关节软骨的功能，进而引起关节软骨退变，加速骨关节炎进程。研究软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用、开发调控软骨下骨重塑的药物必将给骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。
【关键词】 骨关节炎 软骨退变 软骨下骨 骨重塑 骨硬化
role of subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis
shan peng-cheng,cao yong-ping
department of orthopaedic surgery，peking university first hospital,beijing 100034, china
abstract: many studies have proved that the subchondral bone plays an important role in the development of osteoarthritis ,and may be the initial factor of the disease, but the exact relationship between articular cartilage degeneration and subchondral bone sclerosis is still unclear. subchondral bone sclerosis caused by bone remodeling abnormality severely decreases the ability of subchondral bone stress absorption and protective function of articular cartilage ,which finally leads to cartilage degeneration and osteoarthritis deterioration . studying the role of subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis and developing potential drugs to regulate subchondral bone remodeling will provide a new way of prevention and treatment for osteoarthritis.
key words：osteoarthritis; cartilage degeneration; subchondral bone; bone remodeling; bone sclerosis
骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种主要累及负重关节的慢性、退行性疾病，其典型的病理特征为关节软骨进行性退变、软骨下骨骨质硬化。临床上以关节疼痛、肿胀、活动受限、关节畸形等为主要表现。oa病因复杂，至今仍不完全清楚，导致oa发病的可能因素包括年龄、肥胖、过度负重及创伤等。长期以来，骨关节炎被认为始发于关节软骨代谢紊乱、局部软骨降解［1、2］，但是近些年的研究发现，oa早期已经出现软骨下骨骨转化增强、骨小梁结构改变，而且很多实验证明，软骨下骨硬化在骨关节炎的发生和发展中发挥着重要作用，可能是oa发病的始发因素［3、4］。因此研究软骨下骨在oa进程中的作用以及调控软骨下骨硬化来防治oa，已经成为目前oa研究的热点。
1 软骨下骨的解剖构成
软骨下矿化组织可以分为三层：钙化软骨、软骨下皮质骨和软骨下松质骨(图1)，它们在形态学、生理学及机械作用方面是各不相同的［5］。作者通常所说的软骨下骨包括软骨下皮质骨及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙等。软骨下骨区含有数量众多的动脉、静脉和神经，它们的细小分支不规则地排列成口径不一的窦状小管，这些窦状小管的末端与构成横向静脉窦的细小静脉丛相连。软骨下骨区的小动脉、小静脉和窦状小管穿行在皮质终板的血管通道中，将髓腔和钙化软骨层连接起来，向得不到关节液滋养的深层软骨提供营养。
2 软骨下骨的生物学功能
软骨下骨的主要生物学功能为吸收应力、缓冲震荡和维持关节形态。
软骨下骨的弹性模量比关节软骨低，但数量相对较多，所以在缓冲震荡中起主要的衬垫作用，保护关节软骨免受过度应力的损伤［6］。在正常负重情况下，富含水分的关节软骨可将所受应力分散传导，但却仅能缓冲所受应力的1%～3%。当所受应力从关节软骨向骺端传导时会形成较大的剪切力，此时钙化软骨、软骨下骨和锯齿状潮线的波动可将这种剪切力转化为压力和张力，所以当关节所受的应力传到软骨下骨时几乎完全是压力和张力［7］。软骨下骨可将传来的力缓冲掉30%，其余的部分被皮质骨和周围的关节囊所吸收。正常关节中软骨下骨的密度和厚度是不均一的，所以不同部位软骨下骨的生物力学特性也有所不同，其缓冲震荡的衬垫作用也随所受应力的改变而改变，使不同部位的软骨下骨力学特性与其衬垫作用达到最佳平衡，从而维持关节的正常生理环境。
软骨下骨的另一作用是维持了不一致的关节表面形态，使周围的关节面保持密切接触，而中央的关节面不接触。这样关节在负重时其中央部分可发生轴向移动，将所受的应力传到周围的皮质骨，这有助于维持关节软骨浅层的营养。
3 骨关节炎中软骨下骨的病理生理
在骨关节炎中软骨下骨硬化非常常见， 目前就软骨下骨硬化与关节软骨退变之间的关系存在两种假说：一种观点认为作用在关节上反复的超负荷压力导致骨与关节软骨的轻微损伤、水肿和出血。随着关节软骨的缓慢侵蚀，软骨下骨逐渐硬化，最终导致软骨下骨硬度升高，这可能反过来引起关节软骨进一步损伤［1］；另一种观点认为，软骨下骨的硬化发生在关节软骨改变之前，关节软骨的完整性依赖于其下方骨床的生物力学特性，因此软骨下骨硬化可能是骨关节炎发病的始发因素［3、4］。
oa软骨下骨硬化可能与成骨细胞的功能缺陷有关。研究表明来自oa软骨下骨的成骨细胞在甲状旁腺激素和前列腺素的刺激下合成环磷酸腺苷的能力较来自正常人群的成骨细胞低［8］。软骨下骨的硬化还可能与局部和系统的力学因子有关，这主要是指胰岛素样生长因子(igf)和血浆酶原，并且血浆酶和血浆酶原系统调节着igf系统的活性。igf以及igf连接蛋白系统的激活促进软骨下骨成骨细胞过度增殖，从而导致软骨下骨的增厚和硬化［8、9］。
软骨下骨具有粘弹性特性，急性过度负重比逐渐过度负重更容易导致微损伤。软骨下骨和钙化软骨的反复微损伤将启动骨重塑过程［10］。mori和sokoloff等研究发现oa患者钙化软骨和软骨下骨的微损伤增加，这些微损伤启动了骨重塑过程，由于骨重塑区的血流增加和破骨细胞的局部溶骨，软骨下区可表现为短暂的骨质疏松。重塑过程中纤维血管长入钙化软骨中，产生了新的软骨下骨和新的软骨矿化区，导致了潮线的扩展和软骨下骨的硬化，软骨下骨的这种慢性改变最终导致了关节软骨的变薄和丢失［11、12］。关节软骨和软骨下骨的过度负重还可以导致未钙化软骨的结构改变，包括纤维损伤和产生异常基质蛋白，导致软骨水肿和深层软骨区的肿胀。如果持续过度负重，软骨下骨的硬化、纤维化、囊性变等将导致其血液循环减少，进一步加重深层关节软骨和软骨下骨的损伤以及未钙化软骨浅层发生剥脱并导致关节表面不规则，甚至关节软骨的全层缺失。
4 软骨下骨硬化与关节软骨退变的关系
关节软骨退变是进展期骨关节炎的显著病理改变，因此很多学者认为骨关节炎始自关节软骨细胞合成蛋白多糖的减少，并逐渐发展为胶原纤维框架结构改变，最终导致关节软骨退变［1］。然而，burr db认为在骨关节炎发病中软骨下骨起着重要作用，软骨下骨硬化不仅可以加速疾病进程，而且可能是骨关节炎发病的始发因素［5］。day等通过实验证明在骨关节炎早期关节软骨退变之前，软骨下骨已经出现弹性模量减低、骨量减少的改变［13］。他们认为软骨下骨在oa发病中发挥着至关重要的作用。
1986年，radin和rose首先提出软骨下骨硬化可能是导致软骨损伤的重要因素。他们认为软骨下骨就像一把坚硬的椅子，而关节软骨就像放在上面的软垫，如果椅子表面的硬度不均匀，垫子承重后就会产生剪切力，造成关节软骨损伤［6］。在众多相互争论的关于骨关节炎病因的理论中，这是第一个主要强调软骨下骨作用的一种假说。1993年，dieppe等首次用实验数据证明了软骨下骨与关节软骨之间存在密切关系。他们对94位膝骨关节炎患者进行5年的前瞻性研究，结果显示入组时48%的患者胫股关节面存在软骨下骨硬化，34%的患者存在关节间隙狭窄>2 mm或者需要手术治疗，54%的人最终发展到关节间隙狭窄>2 mm或是行膝关节置换术。64%的膝关节有同位素异常浓聚，其中88%为进展期骨关节炎。这组数据强有力的支持了关节软骨进行性损伤与软骨下骨硬化之间存在密切关系。遗憾的是，此实验未能从根本上说明关节软骨降解与软骨下骨硬化之间的因果关系［14］。
为了进一步研究二者之间的关系，libicher等利用狗前交叉韧带横断骨关节炎模型，通过mri检查，发现在软骨退变发生之前软骨下骨已经出现骨髓水肿［3］。tomoya muraoka等利用hartley豚鼠自发性骨关节炎模型进行研究，结果发现2个月龄时其软骨下骨已经发生结构的改变，直到3个月龄时才发现关节软骨细胞减少，而且随时间延长数目不断减少。通过此实验，tomoya muraoka认为，软骨下骨改变是发生在关节软骨降解之前的［4］。
然而，yamada等通过对72名志愿者140膝的研究发现，软骨下骨增厚及骨密度增加不是导致关节软骨退变的原因，软骨下骨硬化更像是继发于关节软骨损伤的结果［2］。raudenbush等认为软骨下骨硬化与关节软骨降解之间不存在必然联系［15］，这就意味着软骨下骨硬化可能并不是关节软骨降解的病因。
目前，虽然关节软骨退变与软骨下骨硬化之间的因果关系仍不完全清楚，但是人们对骨关节炎的发病机制已经有了新的认识，不再认为是由于单纯的关节软骨磨损及撕裂而导致的不可避免的结果。软骨下骨在骨关节炎发病中的作用越来越受到重视，而且越来越多的研究支持软骨下骨硬化继发关节软骨损伤这一理论。
5 调控软骨下骨重塑对关节软骨退变的作用
早在上世纪80年代，radin和rose便已提出骨关节炎的发病中机械因素起至关重要的作用［6］。而且很多研究证实骨关节炎中软骨下骨改变早于关节软骨退变［3、4］。骨重塑异常导致的软骨下骨密度增高和硬化，极大的减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用，使其丧失保护关节软骨的功能，引起继发性关节软骨退变［5］。因此，通过调控软骨下骨重塑来防治骨关节炎越来越受到研究者的关注。
tadashi hayami等人［16］建立大鼠前交叉韧带横断骨关节炎模型，发现在骨关节炎早期骨转换增强，继发软骨下骨硬化，应用阿仑磷酸钠后，不仅抑制了软骨下骨硬化，而且还降低了关节软骨降解产物血清软骨低聚物基质蛋白和尿ⅱ型胶原c端肽的水平，有效地减缓了骨关节炎进程。lajeunesse等［17］利用狗膝关节前交叉韧带横断oa模型，通过体外培养膝关节软骨下骨成骨细胞，测量其代谢表型标志物、碱性磷酸酶、骨钙素及upa、igf-1等物质的水平，发现oa成骨细胞与正常细胞相比代谢活性明显增强，应用环氧化酶抑制剂licofelone后，其分泌的upa、igf-1、peg2等因子的水平明显降低。因此，lajeunesse认为licofelone可以改变软骨下骨代谢活性，间接稳定关节软骨的生物力学环境，减少关节软骨的损伤。此外，hayami等［18］应用大鼠膝关节创伤性骨关节炎模型，发现在软骨退变及软骨下骨硬化之前已经出现软骨下骨骨吸收增强，而且与oa早期发病关系密切，认为骨吸收抑制剂可以作为潜在药物用于oa的防治。
tat等［19］利用oa患者膝关节置换术后股骨髁标本进行软骨下骨成骨细胞体外培养，加用硫酸软骨素及氨基葡萄糖进行干扰，结果发现：两种药物对骨吸收活性均有抑制作用，硫酸软骨素能够增加骨转换过程中骨保护素／rankl的比率，在oa疾病进程中发挥积极作用。boileau等［20］应用相同的方法，证明双醋瑞因可以抑制骨吸收因子mmp-13及组织蛋白酶k的活性，抑制破骨细胞的生成，调节软骨下骨异常代谢，对关节软骨产生保护作用。
软骨下骨硬化在oa的发生和发展中发挥着至关重要的作用。软骨下骨代谢增强、骨重塑加快所导致的软骨下骨硬化可能是引起软骨退变的始发因素，而且会进一步加速oa的进程。研究软骨下骨在oa发病机制中的作用，通过调控软骨下骨硬化以减少关节软骨损伤必将给oa的防治带来新的理念。
6 展望
虽然软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用还不完全清楚，但是软骨下骨与关节软骨紧密的解剖关系决定了它的特殊作用。很多实验已经证实，通过药物调控软骨下骨代谢活性、抑制骨重塑速度可以延缓骨关节炎的进程。因此，开发调控软骨下骨代谢和重塑的药物，调节软骨下骨的代谢活性和骨重塑强度，改善软骨下骨硬化，必将为骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。
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关节软骨的生物力学特性篇（3）
本人从事太极拳教学多年，时有同事和学生说起在练习24式简化太极拳的过程中，膝关节会有不同程度的疼痛。于是我出于专业的好奇，查阅了一些文献资料，结果是支持太极拳具有良好健身作用的文献不胜其数。然而从事篮球专业训练的运动员会多发篮球膝，原因主要是膝关节在篮球运动中常处于不稳定的半蹲位，且膝关节在不断的蹬伸过程关节软骨不断研磨，这样容易造成关节的损伤，如果不及时休息恢复，很容易造成慢性损伤，导致骨关节炎。是不是太极拳的练习过程中若不注意太极拳的技法和要求，或者因为其他的原因等导致膝关节不同程度的损伤？
一、由关节的压缩特性来谈24式简化太极拳的教学
关节软骨是一种复合生物材料，由固体相胶原纤维、蛋白多糖和液体相水及电解质等组成。通过光学显微镜的观察认为，关节软骨具有浅表层、移行层、放射层、钙化层四层结构。关节软骨的生物力学特性是与其内部结构密切相关。胶原纤维在关节软骨中，呈网状结构，能够限制大分子物质的自由扩散，而小分子物质则不受限制，可自由通过，因此，蛋白多糖在其中并不能自由扩散，而水分子则可以自由移动。关节软骨材料特性在很大程度上取决于施加负荷的速度。因为在迅速施加并迅速解除负载的情况下，软骨发生瞬间变形，没有时间让软骨组织挤出液体，这种情况下，关节软骨组织类似于一弹性单相物质，施加负载时马上变形，负载消失后立即复原。这种关节软骨瞬间变形和复原反应是软骨组织能够抵抗冲击负荷。
关节软骨不仅是一种良好的抗压材料，而且是一种粘弹性十分明显的材料。粘弹性材料的两个基本反应是蠕变和应力松弛。蠕变是材料在恒定应力作用下，其应变随着时间的延长而不断加大；应力松驰则是指材料在保持恒定应变状态下，所需要的外在应力随着时间的延长而不断地减小。不同材料的粘弹性发生的机理可以有所不同。
在软骨组织负荷后，首先发生瞬间变形，但当负荷持续作用时，软骨的抗压作用迅速减少，而是出现一依赖时间的蠕变期。这是由于软骨内液体被逐渐挤出的缘故。在初始阶段，蠕变速度非常快，这是由于外在压力与软骨内蛋白多糖渗透压之间差距大，故液体渗出很快。随着液体的进一步渗出，软骨蛋白多糖浓度增加，渗透压增大，反过来又阻止液体的渗出。结果渗出逐渐减少直至最后达到平衡，此时无液体渗出，软骨变形停止，最后成为一直线。人体软骨的蠕变量是很大的，初始应变与最大应变可以相差3～5倍，即使作用于关节软骨的力很小，但只要作用时间足够大就有可能因为蠕变作用而引起软骨的较大变形。这种蠕变作用还有可能使得软骨内的软骨细胞发生损伤，或者是胶原纤维发生断裂。只要时间足够，较小的应力同样可以产生较大变形。关节软骨的粘弹，对于理解软骨的正常生理及损伤机理具有重要意义。孟维春等关节软骨压缩特性的实验研究生物力学方面论证了关节软骨在遭受慢性应力作用时，因蠕变而引起的软骨内部结构破坏，最终导致慢性骨关节炎的改变。Cooper的调查研究发现，经常从事长时间屈膝负重工作者，膝关节的骨关节炎的发生率明显增高。因此，临床上应尽量避免持续的慢性应力损伤。
由于关节软骨可缓冲短暂而强烈的机械冲击力，而在缓慢而持久的应力作用下，会出现一依赖时间的蠕变期，且蠕变作用使得软骨内的软骨细胞发生损伤和胶原纤维断裂，只要时间足够较小的应力同样可以产生较大变形。
关节软骨的粘弹与24式简化太极拳的缓慢持久的运动特征是一对矛盾。在太极拳的练习中，膝关节软骨较一般运动来说要承受较长的缓慢而持久的应力作用，也就是说在这种应力下很可能造成关节软骨的软骨细胞发生损伤和胶原纤维断裂。所以在教学和练习中我们应注意：身体重心和虚实的转换，别使某一膝关节软骨处于较长时间的缓慢应力的作用下；要注意练习的时间和适当的休息；要根据自己的身体条件安排练习的时间和强度，做到区别对待。
二、由膝关节的力学结构特点来谈太极拳的教学
膝关节由屈曲至伸直并伴有旋转时，最易造成半月板的损伤。膝半月板：位于股骨髁和胫骨髁之间，左右各一，它附在胫骨平台上并随胫骨在股骨上移动。当膝关节在半屈位旋转时，半月板产生移位。单纯的胫骨屈曲，半月板移位不大，只有当胫骨旋转时半月板移位最大。瓦斯摩尔斯（德国）认为这种移位所产生的压力在膝关节旋转不稳定中常能使半月板发生病理性损害。如半月板炎和半月板病，这些损害会进一步加重膝的旋转不稳定，甚至发展成膝关节骨关节病。
关节软骨在受压时，间质内的液体可被挤入关节表面，产生自压形式的静水作用，使关节软骨面具有低磨擦系数。软骨细胞则在软骨粘连素及蛋白多糖的协助下与Ⅱ型胶原纤维相粘连。关节软骨具有黏弹性的间质内液体流是软骨渗透及蛋白多糖固定电荷集团的表现,使其弹性系数高,抗张力性能强。关节面在受到突然的撞击或扭转后，软骨基质中大分子网络结构将承受巨大的剪力，在基质内的液体流动难以形成相对抗的压力时，这种网络结构将被破坏，细胞于基质中受到损伤，甚至延及至软骨下骨。
在一般人看来，太极拳动作柔和、运动强度小、没有危险,很适合老年人。然而，锻炼不当会导致膝关节的损伤.太极拳的标志动作是马步蹲裆,有资料显示，人体屈膝30°，膝关节承受压力和体重相等。屈膝60°,膝关节压力为体重的4倍；屈膝90°,所承受的压力是体重的6倍。如果膝关节长期处于紧张和负重状态就容易加速关节软骨的磨损,引起膝关节疼痛。
24式简化太极拳膝关节在练习中不断的屈伸扭转，且很多动作膝关节都是在屈曲至伸直并伴有旋转，譬如野马分鬃，左右揽雀尾等动作。运动中为了避免胫骨和股骨较大的相对运动。在练习时我们应该适当的注意些细节。练习野马分鬃和搂膝拗步时，后撤撇前脚的外撇幅度不能太大，这样在接下来弓步的蹬伸过程中膝关节不会太大的扭转。练习左右揽雀尾，当左揽雀尾转右揽雀尾时要注意左脚的内扣。还有蹬转的过程中应该注意虚实的转化，后脚的蹬伸以前脚掌为轴要圆活，尽量避免膝关节扭转时胫骨和股骨的相对运动。换句话说，也就是要做到“迈步如猫行”的轻盈圆活。且在24式简化太极拳的练习中不光是这几个动作仅仅如此，只是举个例子而已。另外，在练习中所有的弓步和马步不要屈膝不要太深，因根据自己的身体条件而定，要做到“中正安舒”。所以我们在教学中要注意：动作正确，尤其注意膝关节不要因扭转造成胫骨和股骨很大的相对运动；应根据习练者得身体条件提出练习要求。
三、小结
运动创伤和劳损是膝关节疼痛的一个重要原因，因此明确膝关节在进行太极拳练习时可能造成哪些损伤及损伤原因对进行太极拳教学非常重要。
太极拳运动对腿部的要求较高，膝关节始终处于半蹲位的静力性支撑，这就对膝关节的要求较高；动作姿势的不正确是直接造成膝部损伤又因素之一；运动前准备活动不充分，运动结束后没有适当的整理放松活动，使运动中产生的疲劳堆积形成损伤；没有根据自己的实际情况安排好运动时间和运动强度，忽略了运动应遵循的循序渐进原则；从生物力学的角度分析，由于膝关节股骨内外髁的外形和长度不同，即内髁关节面较外髁长，致使膑骨关节面不平稳。股内侧肌无力或变得萎缩，则能失去股内侧肌这种弓弦作用，增加了膝的旋转不稳定，结果可导致膑骨软骨病。因此股内侧肌肌力不足，无法保证膝关节的稳定，也是造成损伤的又一个重要原因。
24式简化太极拳是全国推广的具有很好健身效果且老少皆宜的健身手段。如果我们在练习中不注意习练的技法和要求，不遵循体育锻炼的一般原则也许会对身带来不良的后果；此外，要根据自己的身体条件安排习练的时间和强度，注意休息和恢复不能急功冒进。
参考文献：
[1]孟维春，董启榕.关节软骨压缩特性的实验研究[J].医用生物力学，2003，18（1）
关节软骨的生物力学特性篇（4）
骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变和关节周围骨质增生为病理性特征的慢性进行性骨关节病。随着人口的老龄化,骨性关节炎已成为及常见的疾病。多年的研究提示,在诸多因素影响下,关节软骨细胞外成分的合成减少与降解增加,是造成骨性关节炎软骨变形的重要因素之一。
OA是由于机械性和生物性因素相互作用,使关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨合成与分解的正常进程失去平衡的结果。成人正常关节软骨中,软骨细胞占整个软骨体积的2%以下,其余为大量的细胞外基质,主要由胶原(大部分为II型,其他型胶原较少)和蛋白聚糖组成,蛋白聚糖主要以软骨聚集蛋白聚糖的形式存在。正常情况下,软骨基质的分解与软骨细胞合成基质的速率保持平衡,是软骨的形态和功能得以维持。由于机械性磨损或理化因素致使软骨破坏或降解加快,或者因软骨细胞合成基质收到抑制或其他因素的影响,使软骨修复能力下降后,最终可导致骨关节炎形成。
目前针对骨关节炎的体外研究,主要集中在兔关节软骨细胞的培养及诱导成模,动物的软骨细胞往往增生活跃,并且由于种属间差异,只能从一定程度上说明研究的意义。而直接从临床上获得的人关节软骨细胞,尤其是骨关节炎软骨细胞在体外研究中更能说明问题,因为它更符合实际生理状态,研究结果更可信,对临床上防治OA有直接指导作用。
1 骨性关节炎(OA)的发病机理研究探讨
在OA的病理过程中,关节软骨细胞及滑膜细胞分泌过量的基质金属蛋白酶,打破了MMP-TIMP(组织金属蛋白酶抑制剂)的平衡,造成对关节软骨ECM的国度降解,是软骨逐渐出现腐烂、溃疡、缺失等一系列退行性变的重要原因。MMPs可降解软骨关节ECM中的II型胶原、弹力纤维和蛋白多糖等。前者使软骨的拱形纤维结构破坏而受损,蛋白多糖的降解测试软骨失去弹性,其包绕胶原纤维的分子筛滤过作用下降从而导致关节软骨更易受到降解酶的作用而破坏。
机制金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组锌依赖性的蛋白水解酶,能够特异性的降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、蛋白质的组成部分和裂解信号蛋白质。主要参与细胞外基质代谢,与正常组织塑性和病理状态下细胞外基质退变有关。MMPs以无活性酶原形式出胞,在各种炎症介质调控下被激活,导致细胞外基质的降解,同时它们能被特定的蛋白抑制物(如TIMP)所抑制。
MMPs在骨关节炎关节软骨的退变中起着重要的作用。酶和酶抑制物水平失调是OA的可能致病机制,在OA中的软骨关节内存在MMPs及其抑制物之间的不平衡,关节软骨的破坏程度与软骨降解酶的含量呈正相关。根据作用底物,MMPs可分为胶原酶、明胶酶和间充质溶解酶等,而在OA病理生理中,研究较多的是MMP-1(胶原酶-1)和MMP-13(胶原酶13)。它们对细胞外基质尤其是II型胶原酶有很强的降解能力,是目前在软骨破坏中研究较多的胶原酶指标。OA时它们可由软骨细胞或滑膜细胞生成,研究表明,在OA关节液以及病变部位软骨中,MMPs的活性增高,而且继发于软骨破坏后。
白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)与肿瘤坏死因子(TNF-α)是参与OA发病进程中的重要递质,是炎症发病反应的重要调节剂,是调节炎症的始动因素[1]。白介素1(interleukin-1,IL-1)。近年来,人们逐渐认识到白介素1特别是IL1-β在骨关节炎的发病中起着重要的作用,并认为IL-1β水平的不断升高是骨关节炎软骨进行性退行性变的重要原因之一。
有人应用特定的基因转染载体将IL-1受体拮抗蛋白基因转移到存在病变的关节软骨或滑膜组织中,使该基因在关节内大量表达,从而阻断病理状态下所产生IL-1的破坏作用,达到预防、治疗和长期维持骨关节炎缓解状态的目的。Ghivizzani等将IL-1β基因转到兔滑膜组织中,结果诱导出了典型的关节炎改变。IL-1对OA发生的影响是多方面的。白介素-6(interleukin-6,IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子,包括激活B细胞和T细胞,以及产生急性期蛋白[2]。正常及OA软骨中分离的关节软骨细胞都能自发分泌IL-6,而正常人滑膜免疫组化检测不出IL-6的存在,OA滑膜内壁细胞则可以免疫组化显示。
IL-1β是体内广泛存在的与炎性有关的因子,体外培养的正常软骨细胞和滑膜组织细胞都能够产生微量的IL-1β。据报道,IL-1β能明显影响关节软骨细胞合成基质,从而在OA发病过程中扮演重要角色。IL-1β对关节软骨降解作用的主要降解作用的主要机制可能在于促进软骨中MMPs合成和分泌,抑制基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)合成,而前者对基质有较强的溶解作用。由此,IL-1β被用于诱导OA模型产生,而IL-1受体阻滞剂(IL-1Ra)也可用于OA模型治疗,并取得初步效果。
肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。肿瘤坏死因子-α以旁分泌的方式作用于Th细胞,加强其IL-2分泌,提高IL-2受体的表达水平、促进T细胞的活化和扩增。在OA动物模型中,OA关节软骨免疫组化染色其基质及细胞中TNF-α及受体均呈阳性反应,且强度、范围与OA严重程度相平行。
细胞凋亡和骨关节炎的发生发展较为密切,Hashimoto等研究发现正常关节软骨可出现细胞凋亡,但检出率低,主要位于表层,OA患者出表层的数量增加外,中增均有凋亡细胞存在。Blanco等认为关节软骨降解最终完全丧失是骨关节炎的主要病理特征,通过形态学及细胞生化学的方法发现在骨关节炎患者的关节软骨内有凋亡细胞的存在。细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)各成分平衡是维持各层软骨细胞活性的重要条件,细胞凋亡与基质崩解密切相关。
切片显示,OA患者关节软骨富含凋亡细胞的区域伴有大量蛋白多糖降解,表层移行软骨细胞凋亡最多,且基质降解最严重。Heraud等观察人的正常和OA股骨头关节软骨发现,OA软骨细胞中有18%～21%软骨细胞表现出调往特征,而正常关节软骨只有2%～5%凋亡细胞.Cao等发现蛋白多糖聚合物的降解产物之一G1结构域由于与透明质酸的结合不易进入循环系统,易在滑液中及软骨中积累,通过降低细胞间粘附诱导软骨细胞凋亡,滑膜是关节滑动结构中的重要组成部分,其中有大量的血液供应和丰富的神经支配,滑膜的分泌吸收和营养代谢是关节软骨维持正常功能的前提。
细胞凋亡是受基因调控的一种细胞主动死亡过程,参与机体许多生理和病理过程,软骨细胞的异常凋亡对骨关节炎的发生于发展起至关重要的作用。近年来的研究证明,软骨细胞调节细胞凋亡有两条通路:NO诱导途径和Fas介导途径。Fas又称APO-1或CD95,Fas/CD95介导的凋亡通常包括其死亡区与连接程序分子FADD(Fas-associated protein with death domain)相连结,以及FLICE(CD95L白细胞介素-1β转换酶)的募集,继而发动ICE的其他家庭成员蛋白水解酶的激活,如caspase-8和caspase-3,产生caspase家族级联反应,最终导致凋亡发生。已有研究证实,能导致细胞氧化损伤的因素均能引起细胞凋亡,过氧化氢可以引起剂量依赖性细胞死亡,但浓度低于100μmol/L的过氧化氢主要导致细胞凋亡,浓度超过100 μmol/L则细胞坏死开始占优势。
OA发病机制中除了酶以及抑制物的代谢失衡外,软骨细胞的凋亡以及自由基也起了重要作用。细胞凋亡(apoptosis)是一种基因控制并依赖ATP功能的细胞自主性死亡方式。随着细胞分子生物学的发展,国内外许多学者研究发现软骨细胞凋亡在OA的发生发展中起到关键作用。
2 骨关节炎中软骨细胞的研究发现
软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,软骨细胞在软骨形成、代谢节修复中起着重要的作用。关节软骨细胞增殖和凋亡正常情况下处于动态平衡状态,使关节软骨在总体上保障其细胞数量及形态和功能的稳定。软骨细胞凋亡过盛可能是软骨退变发展成膝关节骨性关节炎的重要原因之一。
刚分离下来的原代软骨细胞呈大小均一的遮光性较强的球形。正常原代软骨细胞48 h后完全贴壁,细胞大部分呈圆形、椭圆形或短梭型外观,部分区域软骨细胞呈集落生长,约7 d后长满瓶壁,密疏不一,有的区域还可见大量基质包绕的结节样细胞群落;传代后一般24 h即可完全贴壁,第二代软骨细胞3 d左右即可长满,细胞仍以椭圆形多见,但随着传代次数的增加,细胞中梭型细胞逐渐增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。而骨关节炎组原代细胞贴壁普遍较晚,细胞形态多不规则,约9 d后才能长满瓶壁,多为单层生长,集落样生长和结节样细胞群落少见;传代后贴壁也较晚,第二代软骨细胞需4 d左右长满瓶壁,细胞中梭型细胞增多明显,有时可见浮起的死亡细胞,分泌和增值能力下降。
目前原代软骨细胞酶消化分离的方法很多,常用的有Green法和Klagsbrun法等。体外培养观察表明原代正常软骨细胞具有良好的附壁生长和增殖活性,细胞外基质富含II型胶原和蛋白多糖聚集体,直至传到第4代仍具有较好的软骨细胞生物学特性。相比较而言,骨关节炎软骨细胞的贴壁和增殖较慢,II型胶原和蛋白多糖的含量也较少,传到第4代软骨细胞生物学特性基本消失。同时,细胞凋亡明显增多,对相同浓度IL-1β的诱导反应更加显著。而IL-1β能促进基质金属蛋白酶(MMPs)生成同时降低基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的合成,还能够刺激中性蛋白酶和前列腺素E2(PGE2)的产生,加重关节的炎性反应,在软骨细胞的降解、退变过程中起到最重要的作用[3]。
OA中NO主要来源于软骨细胞,通过iNOS催化生成。研究表明,正常软骨细胞不表达iNOS,在OA中,软骨细胞则表达iNOS,并产生NO参与OA的病变过程。实验表明,IL-1β能通过NO介导,抑制软骨细胞蛋白多糖和胶原的合成,诱导基质金属蛋白酶的形成于释放,导致基质降解,还可抑制软骨细胞的增值;同时也参与了软骨细胞的凋亡过程。元建洪等研究了IL-1β对人软骨细胞MMP-13的影响,报道它们存在剂量依赖关系,但未对MMP-1进行研究。
Ieda等应用人软骨肉瘤细胞进行实验,发现IL-1β可以通过p38途径影响MMP-1/-13的变化,但并未对两者的不同进行研究[4]。Fas途径。Fas及FasL在细胞表面的表达手细胞密度的影响,低密度区细胞(细胞处于未融合状态)Fas及FasL的表达,要高于高密度去细胞(细胞处于融合状态),但后者被主动性抗体诱导儿凋亡的软骨细胞数目却是前者的15倍,提示在低密度培养时,保护性的抗凋亡机制被激活,使得软骨细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性下降。
3 药物对骨性关节炎的治疗进展
中药的作用机理引起膝OA军事从软股退化开始,继而发生其骨质和滑膜的改变。随着现代医学的发展,对其病机和中药的作用机制的研究也取得了进展。中医认为本病主要为筋骨失养,是肝肾虚弱所致。这与血瘀气滞病较为相似,因而中药医补肾壮骨和养血柔肝类为主。现代药理研究补益肝肾可改善微循环、防止自由基过量产生、调节内分泌状态、增强免疫功能,使软骨蜕变等表现得到改善和修复,从而达到防治和改善病情的目的。同时配以活血通络、温经止痛之品。它们在改善软骨细胞功能、促进软骨修复、抑制滑膜炎性改变、延缓软骨退变等方面也能起积极作用[5]。
丹参主要成分丹参酮I、II、IIA,主要功效为活血化瘀畅行血脉、通利关节、行血分、苦降开泄以散瘀等。研究发现马钱子及其主要单体成分马钱子碱等对软骨细胞凋亡及合成代谢有较大影响。其对兔膝OA有一定保护作用,对正常软骨细胞有促进增值而无诱导凋亡作用。马钱子及其主要单体马钱子碱在一定剂量时对不同途径下诱导的软骨细胞凋亡有抑制作用,并在抑制软骨细胞凋亡的同时对软骨细胞合成代谢功能有一定的改善作用。
牛维等采用软骨细胞培养技术观察补肾活血方对软骨细胞的增值和细胞总蛋白合成的影响,从细胞分子水平研究该方防治膝OA的作用机制。研究表明该方含药血清可促进软骨细胞的代谢与软骨细胞的增值以及软骨细胞蛋白质的合成。邵敏采用兔软骨细胞培养技术观察补肾活血方对SOD及一氧化氮合酶(NOS)的影响,从细胞分子水平研究该方防治软骨蜕变的作用机制。结果表明该方对软骨细胞的保护作用是可提高SOD活性,阻止自由基的生成,抑制NOS的活性,减少NO的生成,从而阻止NO、自由基对软骨细胞结构的损伤和破坏。刘坤等认为不同中药对软骨细胞银子的表达呈现出不同的效应,益肾方和柔肝方能降解血清中透明质酸的水平提高膝关节透明质酸的水平,对延缓软骨退变有重要意义。
殷惠芬等按照Hulth法建立兔膝OA模型,Feulgen染色测定图软骨细胞核DNA含量的图像分析表明,中药复方(独活、威灵仙、萆、鸡血藤、桑寄生、川牛膝)可明显减少兔软骨细胞核内异染色质的数量;末端原位标记法(TUNEL法)观察软骨细胞凋亡情况、琼脂糖凝胶电泳观测软骨细胞DNA特征性梯形带,结果显示该中药复方能减轻内源性DNA氧化性损伤,减少DNA键断裂及分子片段数量,减少兔软骨细胞凋亡数目。
抑制炎性细胞因子和NO含量;采用石膏管形固定致兔膝OA模型造模方法,测定关节液中IL-1β、TNF-α的含量,结果表明古方莶丸能降低实验动物关节液中IL-1β、TNF-α的含量,具有一定的抗炎作用;光镜和电镜下观察表明莶丸可改善关节固定造成的膝关节面软骨的退行性改变,对处于病变条件下的软骨具有保护作用,对已造成退行性改变的关节软骨有减轻和改善其病变程度的作用。安莉萍采用兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶方法建立兔膝OA模型,放射免疫分析法(RIA)检测血清及关节腔液IL-1β、TNF-α含量,以亚硝酸盐还原酶法测定血清及关节腔液中炎性细胞因子和NO的产生,起到减轻膝关节OA兔软骨损伤的作用。
镇痛剂对轻、中度关节炎有效,对乙酰氨基酚是这一类药物的代表药物,是治疗骨关节炎的传统制剂[6]。轻度或中度患者应用对乙酰氨基酚可以取得与应用非甾体抗炎药一样的效果。非甾体抗炎药(NSAIDs)对于退行性骨关节病的疼痛和僵硬是一种常规用药,选择性COX-2抑制剂塞来昔布和罗非昔布既能消炎镇痛,又极少出现NSAIDs并发的严重胃肠道反应。透明质酸钠是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成,该双糖单位以糖苷键相结合,并重复连接成链状聚合物。透明质酸钠关节腔内注射治疗骨关节炎与NSAIDs口服疗效相当,起效不如糖皮质激素快,但是维持时间比较长。
4 实验性对骨性关节炎(OA)临床研究
4.1 对实验性OA血液循环障碍的影响 袁忠治选取兔一侧膝关节切断其前交叉韧带,另一侧膝关节作假手术建立兔膝OA模型,观察膝关节大体形态学、测量股骨内髁软骨厚度和面积、测量股骨内髁关节滑膜细胞层厚度,实验表明补肾活血中药(当归、鸡血藤、熟地黄、川芎、丹参、牛膝、红花、益母草、骨碎补、泽兰、丹皮、淫羊藿、车前子)可明显减轻实验性OA关节软骨的缺损。明显增加。
陈述祥采用兔左膝伸直位管型石膏固定8周的方法建立OA动物模型,进行血液流变学检测和滑膜、软骨标本的组织学观察。结果中药复方骨痹灵口服液(鸡血藤、黄芪、骨碎补、肉苁蓉、防风、鹿角胶、怀牛膝、当归、白芍)能够有效改善家兔膝OA模型血液粘滞度,并促进软骨细胞增生、减轻滑膜组织炎症,从而达到治疗OA的目的,其效果优于芬必得胶囊。
高铁祥通过手术结扎右侧股静脉的方法复制右膝关节炎模型,观察中药复方胶囊(熟地、山药、枣皮、泽泻、枸杞等)等的治疗作用。结果中药复方胶囊组的股内压明显降低,心脏全血黏度、血浆黏度显著降低,心脏血中NO浓度显著降低。实验表明,中药复方胶囊对实验性OA有抑制作用。杨荣全研究骨脉康胶囊的药理作用,结果骨脉康胶囊能显著减少小鼠皮下血肿模型的血斑面积并显著缩短血斑消失时间,说明它对小鼠皮下血斑吸收有显著的促进作用;在整体动物实验中,说明它对小鼠皮下血斑吸收有显著的促进作用;在整体动物实验中,骨脉康胶囊低、中、高剂量组均有显著的抗血小板聚集功能。上述作用为骨脉康胶囊活血、化瘀、通络作用提供了药理学依据。
4.2 对实验性OA关节积液及生理生化指标的影响 陈卓夫按照Hulth方法建立兔膝OA模型,参照Gotdbrg VM法对膝关节活动进行临床评分,同时进行关节液量的测定、软骨羟脯氨酸及水量的测定、血清碱性磷酸酶与酸性磷酸酶含量的测定。结果中药化痰软坚片(白芥子、天竺黄、乳香、没药、当归、地龙、鹿衔草、鹿角霜、骨碎补、枸杞、黄芪)能够改善OA模型家兔关节炎的临床症状;化痰软坚片中、高剂量组家兔的关节腔内液、关节软骨中羟脯酸及水分含量、血清碱性及酸性磷酸酶均有显著或非显著性改变,低剂量组也有好的趋势,表明化痰软坚片能改善OA模型家兔关节炎症的各种生理生化指标。
4.3 骨性关节炎(OA)临床研究 骨性关节软骨中虽然软骨细胞只占很少的一部分,但发现它的生存或死亡在OA关节软骨中起重要作用。退化的软骨细胞随OA的严重程度增加而增加。在本研究中显示,OA的关节软骨光镜下软骨细胞数减少,排列紊乱并有成簇现象,细胞核固缩,呈浓密深染状态。软骨细胞在机械、炎症、生化或免疫等损伤条件下发生凋亡、坏死、增殖等反应,亦可通过调控合成基因及分解基因的表达,使合成减少或基质降解。炎症介质与软骨细胞、滑膜细胞的凋亡、坏死之间形成恶性循环,而机械作用是一种起始因素,它们相互渗透,互为因果。
骨和软骨组织、关节软骨中含有多种细胞因子及其受体,可通过自分泌或旁分泌的方式对骨和软骨的形成和修复起局部调节作用,维持关节软骨的正常形态和功能。其活性发生改变,则将导致关节软骨基质成分丢失和进行性破坏。在骨的微环境中,有许多生长因子参与调控成骨细胞的代谢。其中IGFs具有重要调节作用。其中IGF-II在骨中含量丰富,与骨代谢密切相关。作为一种自分泌调节因子,IGF-II能有效的促进骨细胞的有丝分裂和成骨细胞的功能分化增强碱性磷酸酶的活性和钙盐沉着,对骨骼体积增大及长度延长均有着重要的作用。
骨性关节炎的发病机制现在还没有完全明确,而骨性关节炎的治疗也是一个棘手问题[7],一般用药对骨性增生改变的疗效并不明显,而关节置换存在着费用大、风险性高、假体容易出现问题等,目前在骨关节炎的基因治疗方面,国际上还处于动物实验阶段,但是软骨细胞凋亡在OA软骨退变发生发展中的如何作用,以及细胞凋亡与药物治疗OA疗效之间的关系如何,是一个值得研究的崭新课题,将来通过对软骨细胞凋亡调控机制的认识,进一步研究中药特别是补肾中药对软骨细胞代谢的影响,将最终为OA防止开辟一条新的途径。
参 考 文 献
[1] 任志伟,俞永林,杨丰建,等.IL-1β对兔关节软骨细胞MMP-1/-13 mRNA表达和NO的影响.复旦学报(医学版),2008,35(2)167-170.
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[4]巫桁锞,李荣亨.白介素-1在骨关节炎发病机制中的作用.中国老年学杂志,2008,8(28):1550-1552.
关节软骨的生物力学特性篇（5）
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.01.002
Correlation Study of Cartilage Tidal Line Drift and Degradation in Osteoarthritis
LI Xi-hai，LIANG Wen-na，YE Hong-zhi，LIU Fa-yuan，LI Hui-ting，ZHENG Chun-song，WU Guang-wen，
XU Hui-feng，CHEN Wen-lie， LIU Xian-xiang
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the correlation between cartilage tidal line drift and degeneration in osteoarthritis.Methods：20 SD rats of 8 weeks old were randomly and equally divided into the normal group and the model group.Injections of 4% papain were given to their double knee joint cavities to replicate the osteoarthritis models.After 8 weeks，the bilateral knee joints of the rats were taken conventionally，fixed，decalcified，embedded and sliced，respectively using hematoxylin-eosin，safranin O-fast green，toluidine blue and Masson trichrome staining，observing the osteoarticular histological changes.Results：The normal joints characterized smooth articular surface，cells arranging in neat rows，four-layer structure being clear，tidal lines being complete wavy and subchondral bone trabeculas being regular； but the joints with osteoarthritis characterized deformed and rough articular surface，cells arranging in disorder，the four-layer structure being not clear，multiple tidal lines or interrupted tide lines being visible and subchondral bone trabeculas being sclerotic and cystic.Conclusion：Cartilage tidal line drift is the necessary pathological changes in the process of cartilage degeneration in osteoarthritis.
【Keywords】 osteoarthritis；cartilage；tidal line；cartilage degeneration；subchondral bone；relevance；rats
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性、进行性关节疾病，在生物学和力学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[1-2]。目前，OA研究主要集中在软骨退变方面，而软骨潮线漂移研究相对较少。软骨潮线漂移引起软骨下骨重建异常，导致软骨下骨生物力学改变，降低对关节软骨保护能力，从而引发软骨退变[3]。本文旨在通过观察软骨潮线漂移与软骨退变的关系，探讨软骨潮线漂移在骨关节炎病理进程中的作用。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级8周龄SD大鼠20只，雄性，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005。医学实验动物环境设施为福建中医学院动物实验中心鼠类实验室，清洁级（合格证号：医动学第23-016号）。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 药品与试剂 10%水合氯醛，批号SF0341，上海士锋生物科技有限公司生产；4%木瓜蛋白酶，批号107147，sigma公司生产；苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE），批号G1120，北京索莱宝科技有限公司生产；番红O-固绿，批号DB0082，北京雷根生物技术有限公司生产；甲苯胺蓝，批号198161，sigma公司生产；Masson三色，批号C0620，百浩生物生物科技有限公司生产。
2 方 法
2.1 实验方法 采用抽签法将SD大鼠随机分为正常组和模型组，每组10只。模型组第1，4，7天，用10%水合氯醛3 mL・kg-1腹腔麻醉，4%木瓜蛋白酶0.2 mL双膝关节腔注射建立骨关节炎模型[4]，
8周后，取双侧膝关节股骨髁（0.4 cm×0.3 cm×
0.2 cm）常规固定、脱钙、包埋和切片，分别采用HE、番红O-固绿、甲苯胺蓝和Masson三色染色法，观察关节软骨组织形态的变化。参考Mankin's骨关节炎组织学分级方法进行评分[5]。
2.2 检测方法
2.2.1 HE染色 切片常规脱蜡，苏木精染液4 min，
1%盐酸酒精分化液分色10 s，伊红染液3 min，脱水透明封片。HE染色观察软骨组织结构、软骨细胞与软骨下骨的变化。
2.2.2 番红O-固绿染色 切片常规脱蜡，新鲜配制的试剂（A）即Weigert苏木素染液染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，蒸馏水洗1 min， 固绿染色液内浸染5 min，蒸馏水洗1 min，番红 O染色液内浸染 2 min，蒸馏水洗1 min，用乙酸溶液洗涤切片1 min，脱水透明封片。番红O-固绿染色观察蛋白聚糖的变化。
2.2.3 甲苯胺蓝染色 切片常规脱蜡，0.1%甲苯胺蓝溶液10 min，蒸馏水稍洗，快速95%与100%乙醇脱水，二甲苯透明和封固。甲苯胺蓝观察蛋白多糖的变化。
2.2.4 Masson三色染色 切片常规脱蜡，Weigert苏木素A和Weigert苏木素B等比混合，染色10 min，
蒸馏水洗1 min，Masson复合染色液染色15 min，蒸馏水稍冲洗，1%磷钼酸液处理5 min，苯胺蓝染色液复染5 min，1%冰醋酸水处理1 min，脱水透明封片。Masson 三染色观察软骨基质胶原的变化。
2.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据以表示，采用one-way ANOVA分析；计量资料采用Logistic回归分析Chi-square tests。
3 结 果
3.1 骨关节炎退变软骨的组织形态 正常组软骨细胞核呈深蓝色，胞浆及软骨基质呈粉红色，着色均匀；软骨表面光滑平整，表层细胞较小呈长扁形，平行于软骨表面排列；移行层软骨细胞较大呈椭圆形或圆形，同源细胞群分布散在；放射层软骨细胞较大单个或趋于柱状排列，分布散在。细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整。软骨下骨致密层厚度适中，松质层骨小梁密度和宽度适中，排列规律，骨细胞呈梭形，分布均匀，骨基质均匀红染。图1（1）。模型组软骨表面粗糙，完整性破坏，表层软骨出现纤维化变性及软骨缺损，甚至软骨下骨，软骨细胞出现簇集现象，或肥大软骨细胞增多，可见较多空软骨陷窝。细胞排列紊乱，四层结构不清晰，可见多重潮线或潮线中断。软骨下骨致密层变薄，骨松质层骨小梁稀疏，硬化或囊变，边缘有丘状隆起的骨赘。图1（2）。正常组与模型组的干骺端组织形态结构未见明显异常，图1（3）、1（4）。
图1 关节软骨与干骺的形态学观察（HE染色×40）
3.2 骨关节炎软骨基质的蛋白多糖含量减少和纤维变性 番红O与固绿染色分别染色，软骨与软骨下骨染色均匀，不能区分各组织的层次结构，图 2、图3。正常组软骨基质中蛋白多糖红染均匀，胶原纤维呈绿色，潮线清晰，软骨下骨皮质和骨小梁呈绿色，软骨与软骨下骨界限清楚，图4（1）。模型组软骨基质中蛋白多糖染色较淡，染色范围小，而绿色范围增大，由软骨表层和放射层向中间延伸，软骨表面的膜样结构破坏，图4（2）。正常组与模型组的干骺端蛋白多糖与胶原纤维表达未见明显异常。图4（3）、4（4）。
甲苯胺蓝染色，正常组软骨细胞核呈蓝色，软骨基质中的蛋白多糖异染呈紫蓝色，染色深且阳性面积范围大，软骨下骨基质染色很淡，图5（1）。模型组软骨基质染色的深度和面积都明显下降。图5（2）。正常组与模型组的干骺端蛋白多糖表达，未见明显异常，图5（3）、5（4）。
Masson三色染色，正常组软骨基质和胶原纤维呈绿色，着色均匀，向钙化层方向染色逐渐加深，潮线清晰，软骨和软骨下骨边界清晰，软骨下骨的密质骨及骨小梁呈绿色，骨胶原呈红色，图6（1）。模型组软骨失染，有裂隙，纤维化明显，潮线附件有大量火焰状升起的深色红染，升起较高，范围较大，软骨和软骨下骨边界不清晰，图6（2）。正常组与模型组的干骺端胶原纤维表达未见明显异常，图6（3）、6（4）。
3.3 OA软骨退变的程度 Mankin's软骨组织形态学的分级标准，根据软骨退变程度计分，表层软骨细胞分裂增生（0～3分）、细胞排列（0～3分）、潮线（0～3分）、血管翳样物生成（0～3分）、AB-PAS染色（0～4分），最高为16分，是判断骨关节炎软骨退变的常用方法之一。关节软骨Mankin's评分，模型组（10.25±2.68）明显高于正常组（1.17±0.61）（P < 0.01），图7。正常组软骨潮线清晰，呈波浪起伏的曲线，模型组均出现软骨潮线紊乱，Logistic回归分析Chi-square tests显示软骨潮线变化与骨关节炎的发生发展密切相关（P < 0.01）。
正常组 模型组
图7 关节软骨Mankin's评分
注 1）P < 0.01
4 讨 论
OA本质上可能是一种生物学的重建过程，是多种生物因素与机械损伤因素相互作用所致生物力学紊乱而引起的病理改变。OA的发病率随着人口老龄化逐渐增加，已成为严重的公共健康问题。目前，OA发病的分子机制尚不清楚，且缺乏有效治疗方法，故OA的发病机制和防治是临床和基础研究的热点问题。OA动物模型的建立是研究OA发病机制及防治的常用方法，通过观察关节软骨的组织形态学，探讨动物模型的成功与否及防治疗效，为OA的深入研究提供了一个有效的技术平台。
关节软骨由软骨细胞和软骨基质组成，在生理条件下，软骨基质成分的分解与合成之间保持动态平衡。软骨细胞是软骨中唯一细胞类型，也是调节软骨代谢反应的主要来源，软骨细胞能感受细胞外基质微环境的变化并做出相应的反应，以维持基质成分分解与合成代谢的平衡，保持关节软骨的正常生理功能[6]。胶原和蛋白多糖是软骨细胞外基质的主要成分，软骨基质中的胶原以Ⅱ型胶原为主，是软骨基质的特征性胶原成分，构成软骨内的纤维网架结构；蛋白多糖由不同分支状的多糖聚合体组成，能吸引大量的水分子形成凝胶，保持软骨的良好弹性和膨胀能力。OA患者软骨基质结构发生破坏，以蛋白多糖和Ⅱ型胶原的破坏为主，出现胶原的变性、裂解、破坏、减少及晚期胶原纤维网架的消失，蛋白多糖含量下降，进而引起软骨细胞功能改变，基质成分分泌减少，从而加速软骨退变。软骨下骨由软骨下骨板及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙构成，是关节软骨的重要功能单位，对软骨起到机械性和代谢性的保护作用[7]。OA的病理过程中，软骨下骨发生骨塑形重建的方式是直接在关节软骨负重面的下方，或在关节的边缘，形成OA的骨赘[8]。在骨重建过程中，骨形成与骨吸收相耦联，成骨和破骨在同一部位有序进行，OA早期，软骨下骨重建以骨吸收占主导，后期则骨形成为主，从而导致软骨下骨硬化[9-10]。
潮线位于软骨放射层与钙化层的连接部，呈波浪起伏的曲线，具有防止软骨钙化的作用，属于放射软骨层的组成部分，潮线上下的胶原纤维是连接的，有利于放射层软骨的胶原纤维牢固地附着在钙化软骨层的髓腔层，并且有密集的胶原纤维平布潮线的表面，以对抗剪应力和限制软骨钙化[11-12]。潮线在关节软骨钙化过程中发挥重要的调控作用，虽软骨潮线漂移与软骨下骨变化的因果关系尚不确定，但软骨潮线漂移程度与软骨下骨变化存在一定的相关性，在OA软骨退变病理过程中发挥重要的调控作用。
HE染色法是依据苏木素的嗜酸性及伊红的嗜碱性特点，苏木素染组织中酸性成分（如核酸）呈蓝色，而伊红染组织中碱性成分（如蛋白质）呈红色，从而显示组织的形态结构[13]。HE染色法显示，OA的软骨层破坏，层次结构紊乱，软骨细胞凋亡，潮线漂移；软骨下骨硬化及囊变的病理现象。但HE染色的骨关节组织，软骨和软骨下骨的界限不清晰，也难以特异显示软骨基质的病变情况，可结合特殊染色法以弥补常规染色的不足。因此，本研究采用特殊染色法（番红O-固绿、甲苯胺蓝及Masson三色染色法）观察OA的蛋白多糖和胶原纤维的变化。
番红O-固绿染色法是OA组织形态研究的常用特殊染色法，番红O是一种碱性染料，即阳离子染料，能与酸性蛋白多糖（含阴离子）结合呈红色，染色强度曲线与软骨基质中固定电荷的密度曲线呈线性关系，可以通过图像分析系统进行半定量分析软骨基质中的蛋白多糖；固绿是酸性染料，与富含碱性氨基酸的胶原结合呈绿色，具有衬染的作用[14]。实验结果显示，番红O-固绿染色法能清晰区分软骨和软骨下骨，也能清晰地显示软骨潮线，可以用于观察软骨组织的层次结构及软骨厚度的形态计量学。甲苯胺蓝染色法是骨关节染色研究中的常用方法之一，常用于培养软骨细胞的鉴定及软骨蛋白多糖的半定量分析，甲苯胺蓝是一种碱性染料，与软骨基质中酸性蛋白多糖异染呈紫蓝色，其原理是糖蛋白上的酸性基团与甲苯胺蓝的阳离子结合时，染料分子发生聚合反应，导致吸收光谱的改变出现异染。实验结果显示，甲苯胺蓝染色法可清晰区分关节软骨与软骨下骨界限，潮线结构的显示亦可，而软骨下骨的形态结构不能清晰显示。
Masson三色染色法由Mallory三色染色改造，主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色，利用2种或3种阴离子染料混合一起或先后作用完成染色，与组织的渗透性和阴离子染料分子的大小有关。根据组织的渗透性能不同，选择分子大小不同的阴离子染料进行染色，胶原纤维、软骨与粘液呈蓝色，肌纤维、纤维素及红细胞呈红色，细胞核呈蓝黑色[15]。
Masson三色染色法可清晰显示软骨的各层结构，软骨和软骨下骨的界限显示不够清晰；胶原纤维分为多种类型，骨组织以Ⅰ型胶原为主，软骨以Ⅱ型胶原为主，且OA病理过程中软骨细胞的表型和胶原纤维的类型发生转化，而Masson三色染色法使所有的胶原纤维呈同一种颜色，不能区分胶原纤维的变性，可采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学法观察关节软骨和软骨下骨胶原成分的变化。
通过染色观察，HE染色显示模型组软骨破坏严重，同时伴有潮线紊乱、软骨下骨硬化或囊变、关节边缘骨赘，提示软骨潮线漂移与软骨退变有一定的相关性。番红O-固绿染色与甲苯胺蓝染色结果显示，模型组蛋白多糖失染明显；Masson三色染色显示模型组软骨绿色丢失程度明显，且染色同软骨下骨及骨小梁胶原，提示OA病理进程中，软骨基质中胶原和蛋白多糖的含量减少及胶原类型的转变。Mankin's评分结果显示，OA组明显高于正常组，表明本实验造模方法能较好的建立膝OA的动物模型。
综上所述，软骨潮线漂移是OA软骨退变进程中必经的病理变化，参与软骨基质代谢及软骨下骨重建的调节过程。HE染色、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色与Masson三色染色均能清晰观察关节软骨的组织形态结构，但各种方法所显示组织形态结构的部分不同，可根据实验设计的目的不同，选择不同染色方法，为OA关节软骨染色方法的选择提供参考依据。
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关节软骨的生物力学特性篇（6）
为什么年轻人很少发生，而都是中老年人易患骨关节炎？为什么人的膝关节多运动后易发作骨关节炎？究竟哪些因素会影响到软骨的损伤？
首先，软骨组织在体内是随生命的存在而保持新陈代谢，也就是它的成分保持着动态平衡。每日的活动造成关节内的软骨磨损总是不停地得到补偿，这种补偿受多种因素的制约。软骨负重下磨损增加超过了软骨的代偿性修复能力，也就是“补不敷损”；影响软骨组织再生的各种因素加强，包括性激素下降，必需营养物质不足等，均可延缓软骨的进一步修复。
目前对膝关节骨关节炎的治疗多采取综合治疗的方法，治疗包括以下几点：①加强软骨的营养，增强软骨的修复能力，如使用维骨力、透明质酸钠等药物。②去除影响软骨组织再生的因素，如补充雌激素、钙质等。③消炎止痛药物的应用。主要是非甾体类消炎镇痛药的应用，包括乙酰水杨酸（阿司匹林）、扑热息痛、双氯芬酸盐和各种新型非甾体类消炎镇痛药物。传统的这一类药物均有明显的胃肠道副作用，而新型的选择性环氧化酶（COX）抑制剂如西乐葆，其不仅有较好的消炎镇痛作用，且胃肠道刺激作用很小。④适宜的运动。骨关节炎患者由于疼痛、关节肿胀等原因而相应减少关节活动，长期可导致肌肉萎缩、关节不稳、关节负重失衡等。进行适宜的运动可增加关节活动，增强肌力和运动耐力，使关节在较好的生物力学条件下进行活动，特别如散步、太极拳等运动，可对软骨产生轻微的挤压和按摩作用，是最适合骨关节炎患者的运动形式。⑤其他治疗。如理疗、使用支具或辅助装置等。 （作者每周五上午有专家门诊）
作家新生代 作文新主张
《小作家》
愿成为广大中小学生的良师益友“每期一星” 重点推出有潜力的文学新人，配发评论和4～5幅照片，照片上封面；
“社团擂台” 为集团化的作文大比武;
“大作家小作家” 父子文章齐上阵;
“写作加油站” 为作家、语文名教师有针对性地对中小学生作文撰写辅导文章；
关节软骨的生物力学特性篇（7）
[中图分类号] R681.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)05-43-02
髌软骨软化症又称髌骨软骨病,是由于髌骨软骨损伤超出其自身修复能力而造成的髌骨软骨进行性破坏,在青少年膝前痛患者中并不少见。主要症状为膝软,上下楼无力,髌骨深面间歇性疼痛,尤其上下楼梯、蹲起及关节开始活动时明显,最后走跳也痛,如不及时治疗将严重影响患膝功能。传统的治疗方法多采用理疗、按摩、中药外敷、关节腔内注射肾上腺皮质激素、口服非甾体类消炎止痛药物等,疗效欠佳。我院自2006年9月～2008年7月,采用膝关节腔内注射施沛特治疗青少年髌软骨软化症患者150例、180个膝,取得了良好的临床效果,现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选择我院门诊患者150例,年龄17～23岁,平均22.5岁;其中男62例,75个膝;女88例,105个膝;发病到就诊时间最短2d,最长28个月,平均5个月。均有膝前疼痛,打软腿、髌骨深面疼痛及活动受限;膝关节X线片未见异常改变。经特异性体征[1]确诊:(1)髌前及髌骨周围压痛;(2)抗阻力伸膝痛;(3)单足半蹲试验阳性;(4)髌骨关节面不平整,摩擦音、摩擦感。150例患者均无膝关节手术史,未接受过系统治疗。
1.2 治疗方法
患膝消毒后选择内侧髌股关节间隙进针,关节腔内注射施沛特2mL,每周1次,连续5次为1疗程;每次注射后轻柔触压髌骨,以利药液向髌股软骨病灶弥散,不限制日常活动。
2 结果
本组150例、180个膝均按治疗计划用药5周,疗程结束后随访最短6个月,最长2年。根据疗效判定标准[2]对治疗中及治疗结束后6个月疗效进行评定:疼痛消失,上下楼梯自如,活动灵活者为优;仍有轻度疼痛,上下楼梯及蹲起无困难者为良;疼痛好转,但上下楼梯及蹲起仍有困难者为可;治疗前后症状、体征无变化者为无效。本组膝关节腔内注射施沛特治疗1周优良率为77.2%,3周时为93.3%,治疗5周达96.1%,治疗后6个月继续升高至96.7%,未出现无效病例。治疗1～5周及治疗结束后6个月疗效评价见表1。
3 讨论
虽然许多医生认为髌软骨软化症是膝关节退行性病变的一部分,但它其实也是一个特殊、独立的临床病症,是膝前痛的常见病因[3]。髌软骨软化症的治疗方法很多,主要目的是缓解疼痛,大多数髌软骨软化症性疼痛都可以经非手术方法治愈[4]。传统的治疗方法包括理疗、按摩、中药外敷、关节腔内注射肾上腺皮质激素、口服非甾体类消炎止痛药物等,只能短暂缓解症状,临床效果欠佳。玻璃酸钠是关节滑液的主要成分,主要由滑膜细胞和单核吞噬细胞合成,是软骨基质的成分之一。在关节腔内起作用,减少组织之间的磨擦,同时发挥弹性作用,缓冲应力对关节软骨的作用,从而保护软骨、维持软骨基质完整、屏蔽痛觉感受器等功能[5]。
关节腔内注射玻璃酸钠能提高滑液的玻璃酸钠含量,玻璃酸钠可以不同的形式在关节腔内软骨表面和滑膜表面积聚,重新恢复已破坏的生理屏障,防止软骨基质的进一步破坏/流失,并阻止炎性介质和某些微生物的侵入,玻璃酸钠还可以改善病理状态下的滑液生物性能,发挥其对关节内结构的保护和功能。实验研究显示外源性玻璃酸钠关节内注射后不仅覆盖于关节软骨的表面,同时以某种形式进入软骨基质与糖蛋白形成聚集体,有利于软骨的修复和维护正常软骨组织的完整性,并且可以渗透至变性软骨的深层发挥作用;外源性玻璃酸钠还可以与滑膜细胞CD44(白细胞分化抗原44)受体结合促进滑膜细胞合成内源性玻璃酸钠,增加关节内玻璃酸钠的含量。玻璃酸钠与细胞的CD44受体结合可促进软骨基质的合成。临床观察发现,在治疗过程中,当外源性玻璃酸钠消失后,关节滑液中自身的玻璃酸钠浓度增加,粘性指数升高。这说明外源性玻璃酸钠充填不仅具有暂时性补充和提高滑液及关节组织的粘弹性作用,还因其改善了软骨细胞的周围环境,从而使玻璃酸钠的合成功能恢复正常并能维持一段较长时间[4]。本组150例青少年髌软骨软化症患者膝关节腔内注射施沛特治疗1周大部分膝前痛症状得到缓解,关节功能改善;连续用药5周优良率达96.0%以上。说明高分子量、高浓度、高粘弹性的玻璃酸钠(施沛特)膝关节腔内注入后能明显改善关节滑液组织的炎症反应,提高滑液中玻璃酸钠含量,增强关节液的粘稠性和功能,保护关节软骨,促进关节软骨的愈合与再生,缓解疼痛,增加关节活动度。治疗后半年优良率继续升高,可能与外源性玻璃酸钠可以与滑膜细胞CD44受体结合促进滑膜细胞合成内源性玻璃酸钠、增加关节内玻璃酸钠的含量有关。
总之,关节腔内注射施沛特能提高滑液中玻璃酸钠含量,明显改善关节滑液组织的炎症反应,缓冲应力、降低髌股关节摩擦力,阻止髌软骨软化症的病理过程、促进损伤软骨修复,更能达到患者期望的“持久”疗效,为髌软骨软化症保守治疗的首选药物。
[参考文献]
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关节软骨的生物力学特性篇（8）
中图分类号：R684文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）11-264-02
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病,是老年人关节功能障碍和致残最常见的原因之一[1]。透明质酸钠(sodium hyaluronate) 广泛存在于生物体内，为关节腔滑液的主要成分，也是软骨基质主要成分之一，关节腔内注射透明质酸钠可明显改善滑液组织的炎症反应，提高滑液中透明质酸钠含量，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合与再生，缓解疼痛，增加关节的活动度，因此关节腔内注射透明质酸钠是一种安全可靠的治疗膝骨性关节炎的方法[2]。透明质酸属于粘多糖的一种，由特定的重复双糖单位构成，具有良好的生物相容性、自动粘附性和可吸收性，这对滑膜关节的、软骨的保护以及对关节生物力学特性的维持起着重要作用[3]。组成透明质酸钠的基本双糖单位的多少决定了它的分子量大小，不同分子量的透明质酸钠在治疗上具有不同的临床意义。本研究即选用不同厂家、不同分子量的透明质酸钠，针对骨性关节炎修复治疗作用的特点开展了实验研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新西兰大白兔，体重(2.2±0.3)kg，郑州大学医学院动物实验中心提供，自由觅食和饮水，室温(23±2)℃，自然光照。
1.2 药品 透明质酸钠注射液，透明质酸钠25mg，分子量90万(阿尔治，2.5ml/支，日本生化学工业株式会社生产，批号7726)；透明质酸钠注射液，透明质酸钠20mg，分子量150～250万(施沛特，2.0ml／支，山东博士伦福瑞达制药有限公司生产，批号070211022)
1.3 实验方法
采用木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎进行病理学研究。4组新西兰大白兔，每组15只，分为两个给药组(大分子量透明质酸钠组和小分子量透明质酸钠组)、空白对照组和生理盐水对照组(NS组)。其中，给药组和生理盐水对照组关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节病变模型，空白对照组不做造模。兔右膝关节腔内注入1.6％木瓜蛋白酶(Merck产品)生理盐水溶液0.5 ml，隔3天后，再注射第2次，共注射木瓜蛋白酶2次。于末次注射后的第7天，对治疗组和NS组分别在右膝关节腔内注射药物和生理盐水0.3 ml，每周1次，共5周。于末次注射后的第7天，将兔处死，打开关节腔进行大体观察后取标本，进行组织学研究。对侧标本作为正常对照。观察指标：膝关节有无积液和滑膜肿胀等滑膜炎表现，并于解剖显微镜下观察股骨内髁关节面的病理改变。按以下标准评分：
0分：关节面光整，色泽如常；
1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；
2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；
3分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；
4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露。
取膝关节股骨髁及部分半月板软骨和滑膜做光镜标本。滑膜行4％多聚甲醛固定，再按常规脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色观察滑膜形态学变化。软骨标本采用4％多聚甲醛(pH 7.4)固定72 h，15％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙10周，石蜡包埋，HE染色观察软骨形态学变化。
1.4 统计学处理 结果采用SPSSl7.0软件处理，采取单因素方差分析(one―way ANOVA)检验，以P
2 结果
透明质酸钠对木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎的治疗作用病理学研究显示，空白对照组关节软骨排列规整，层次无明显异常，生理盐水对照组滑膜组织增生，血管扩张充血，大量炎细胞浸润，大分子量透明质酸钠组显示滑膜组织增生，炎细胞浸润，但与生理盐水对照组相比改善显著；小分子量透明质酸钠组关节软骨和滑膜炎性改变较轻，较生理盐水对照组改善非常显著。
表l病理学评分显示，大、小分子量透明质酸钠治疗组较生理盐水对照组均有显著性差异，两种药物治疗效果明确。其中，小分子量透明质酸钠组较模型组差异非常显著(P
表1 木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎各组股骨内髁关节面的病理学评分
（1）P
3 讨论
透明质酸钠为广泛存在于动物和人体内的生理活性物质。在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水、眼玻璃体中均有分布。自20世纪70年代以来，透明质酸钠应用于临床治疗骨性关节炎，疗效确切[3,4]。本品具有高度的粘弹性、可塑性、以及良好的生物相容性，在预防粘连和修复软组织方面有明显作用。透明质酸钠为关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一。在关节腔内起作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨变性变化表面，改善病理性关节液，增加功能。还可抑制局部炎症的发生，从而延缓关节软骨退行性变的进程，通过遮蔽痛觉感受器以降低痛觉敏感性，缓解关节疼痛[5]。
本实验旨在观察不同分子量构成的透明质酸钠对骨性关节炎的治疗作用及其差异。选用目前国内临床常用的阿尔治和施沛特这两种不同分子量范围的透明质酸钠，阿尔治分子量90万， 施沛特分子量150～250万，可见，施沛特主要为相对大分子量透明质酸钠，阿尔治主要为相对小分子量透明质酸钠。
研究结果表明，在木瓜蛋白酶注射法制造的兔膝骨性关节炎模型中，骨性关节炎病理表现更严重，大分子量与小分子量透明质酸钠两组药物均显示有明确的治疗作用，其中，小分子量透明质酸钠组与生理盐水对照组比较改善更明显，较大分子量透明质酸钠组也有显著差异，提示小分子量透明质酸钠可能在促进软骨组织修复和减少滑膜组织增生方面治疗效果较好，优于大分子量透明质酸钠。可能机制是小分子量透明质酸钠更容易与纤维母细胞上的蛋白质结合，使纤维母细胞表现出运动活性，向组织损伤处移行，促进愈合，有保证营养物质渗透作用，为损伤细胞增生、合成、分泌胶原提供充足营养。
参考文献
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关节软骨的生物力学特性篇（9）
髌骨软化症是膝关节常见病，好发于青壮年，在运动员和体育爱好者中尤其多见，女性发病率较男性高。其主要病理变化是软骨的退行性改变，包括软骨肿胀、碎裂、脱落，最后股骨髁的对应部位也发生同样病变，发展为髌股关节骨性关节炎。由于其病因尚不十分清楚，临床治疗效果不佳。近年来，国内外学者对其研究颇多，现综述如下。
1病因
1.1生物力学因素
1.1.1创伤学说在髌骨软化症致病因素中，创伤学说渐趋公认，包括直接创伤、间接创伤及各种反复作用超过关节软骨生理范围的物理应力，导致关节软骨的"薄壳结构"和"拱形结构"破坏，软骨细胞失去它们的保护而坏死，软骨基质合成减少，导致关节软骨进行性破坏。孔祥清[1]等调查了996名体育系大学生髌骨软化症患病率与运动创伤的关系，认为创伤是髌骨软化症的重要病因。
1.1.2髌骨不稳定学说髌骨不稳定主要是指高位髌、低位髌、髌骨倾斜、髌骨半脱位或脱位。髌骨不稳可造成髌骨关节面上压力增大、分布异常，引起软骨损伤。盛蕾[2]等在研究运动员髌骨软化症的CR片后认为髌骨软化症患者髌骨软骨在慢性损伤的基础上，继发关节囊及关节周围肌肉改变，使关节面上生物力学平衡失调，出现不同程度的髌股关节对位、对线及运动轨迹异常，使髌股关节负荷加大，加重软骨损伤。
1.1.3髌股压力学说近年来随着髌股关节生物力学研究的进展，对髌股压力与髌骨软化症的关系出现了不同认识。长期来大多数学者都强调接触高压对髌骨软骨软化症的影响。但用压力过高学说难以解释临床上髌骨内侧偏面为髌骨软骨软化症高发区的现象。因此，有学者通过兔髌骨外侧支持带紧缩造成髌骨内侧应力降低，致使深层软骨细胞和周围基质变性。近年来髌股关节压力分布不均也受到重视，甚至有学者认为应力失衡是软骨退变的原因，纠正应力失衡状态，恢复关节面的均匀接触是治疗各种病理力学因素导致软骨退变的根本方法。
1.2生物化学因素
1.2.1自身免疫学说关节软骨表面能阻止抗胶原抗体进入软骨深层组织而对其有保护作用。在关节软骨损伤病人的关节液中发现有抗Ⅱ型胶原的抗体，免疫荧光方法检查髌骨软化症患者的病变标本，发现软骨组织损坏区域及残存的软骨细胞上有免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3附着。由此推断在软骨损伤过程中有自体免疫反应参与。
1.2.2软骨营养障碍各种致伤因素（特别是机械刺激）使关节液的分泌及其成分（如酶的活性、各种营养物质的含量、关节液的渗透压等）发生异常变化，影响髌软骨正常的营养和生理生化过程，促使软骨变性而发病[3]。由于关节骺软骨复合体中骺软骨的生存力高度依赖于软骨血管的血流供应，故血供不足也是髌骨软化症的病因之一[4]。
1.2.3软骨溶解学说关节滑膜受伤后渗透压改变，血浆中的酶进入滑液增多、活性增强，进而溶解软骨。我国学者亓建洪发现：①髌骨软骨软化过程中，软骨细胞合成大量的胶原酶并释放到软骨基质中造成严重破坏；②胶原酶含量与应力降低的髌骨内侧面软骨变性的严重程度呈正相关。因此，胶原酶在接触应力降低的髌骨内侧面软骨软化过程中起重要作用。
目前，多数学者倾向于认为髌骨软化症是多种因素综合作用的结果，各种因素致髌股关节压力改变是外因，自身免疫反应、软骨营养障碍是髌骨软化症发生的内因。
2治疗
2.1非手术治疗包括使用抗炎镇痛药物、理疗、针灸、封闭或关节腔注射、按摩、功能锻炼及中药治疗。传统抗炎镇痛药物如阿斯匹林、布洛芬及双氯芬酸钠等肠胃刺激大，长期服用副反应显著。封闭治疗因局部注射激素会抑制糖蛋白及胶原的合成，对软骨修复不利，故不宜推广。理疗可选用高中低频电疗、磁疗、物理分子波等。玻璃酸钠关节腔注射[4-5]可起并修复关节软骨的作用。功能锻炼治疗可选用股四头肌收缩练习、蹲马步练习、夹球练习[6-7]以及选择性股内侧肌训练等[8]。中药治疗可选阳和汤、右归丸等为基础方随证加减，手法上有松筋法、抓髌震髌法、提髌捻揉法等。硫酸氨基葡萄糖不仅抑制对软骨产生破坏作用的酶，而且是关节软骨生物合成透明质酸、聚氨基葡萄糖和蛋白多糖的生理必需物质，不但能减轻骨关节炎的临床症状，同时能延缓疾病的进展[9]。
2.2手术治疗
2.2.1传统术式根据具体病情的不同有外侧支持带松解、髌韧带止点内移、髌韧带重叠缝合、髌骨关节面清理术、胫骨结节前移髌股关节减压术、髌骨切除术、人工髌骨、髌骨关节面置换术等多种手术方式。
2.2.2关节镜治疗关节镜治疗髌骨软化症具有损伤小、效果好、恢复快，并发症少的优点。近年来，随着腔镜技术的发展，其手术方式和适应症范围逐渐扩大[10-11]，在治疗髌骨软化症方面具有广阔的前景。
2.2.3其他治疗近年来，组织工程、细胞因子、基因治疗等方面的研究为髌骨软化症的治疗提供了新的思路和方法。Chang SC等[12]用藻酸珠作为载体在羊体内注射经软骨诱导的MSCs复合物进行成软骨实验获得良好结果。Ge W等[13]利用人MSCs诱导分化后与纤维蛋白黏合剂复合注入裸鼠背部，单独纤维蛋白黏合剂和MSCs作为对照组，6～12周处死后组织学和免疫组化观察实验组有软骨组织形成。Hoemann CD等[14]将壳聚糖凝胶软骨细胞复合注射入兔软骨缺损处，术后观察有明显修复作用。富血小板血浆能阻止细胞流失的同时在骨缺损区释放一些生长因子和蛋白质促进骨愈合[15-16]。细胞因子、基因治疗目前虽还处于试验阶段，但初步研究显示，它们对软骨病变的治疗具有有效性和可靠性。随着研究的进一步深入，它们必将成为重要的治疗手段。
总之，髌骨软化症治疗方法虽多，但无特效手段，临床上大都依据具体情况选用不同的方法进行综合治疗。
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12Chang SC, TobiasG, Roy AK, et al. Tissue engineering of autologous cartilage for craniofacial recon-struction by injectionmolding. PlastReconstrSurg, 2003, 112(3): 793-799.
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关节软骨的生物力学特性篇（10）
[中图分类号]Q819[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）10-1337-03
Experimental study of the articular cartilage regeneration on the surface of the freeze-dried bone joint
WANG Yong-chun,SHEN Zun-li,SHEN Hua,QIAN Jun,ZHANG Zhao-feng,JIA Wan-xin,CAI Yan-xian
(Department of Plastic Surgery,Affiliated First People's Hospital of Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200080,China)
Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of new cartilage formation on the surface of a freeze-dried bone joint by tissue engineering approach.MethodsThe chondrocytes-scafford constructs by tissue engineering were implanted into the rabbit joint defects. Samples were harvested 3 months post implantation to detect the cartilage formation.ResultsNew cartilage-like tissue can be seen on the surface of cell-PLGA constructs, however, it can not be found on the freeze-dried bone joint with only cell seeded. The defects of articular cartilage hole-model can be repaired with cell-PGLA chaff constructs.ConclusionAlthough chondrocytes-PLGA chaff constructs can be used in cartilage tissue engineering, they can not produce functional articular cartilage on the surface of the freeze-dried bone joint.
Key words: freeze-dried bone; PLGA; tissue engineering; cartilage
骨关节软骨面的完好对关节功能的正常发挥有重要意义。经冻干消毒处理的同种异体冻干骨移植后经爬行替代作用可逐渐被自体骨取代[1]，但同种异体冻干关节软骨组织冻干处理后软骨细胞已基本灭活，移植后软骨面会破坏吸收融合，无法供患者长期使用。我科室自20世纪80年代开始应用冻干异体骨关节加拇甲瓣法再造手指280余例[2]，术后经长期随访摄片观察发现异体冻干骨可通过爬行替代作用逐渐被自体骨取代；而异体冻干关节软骨大多破坏吸收[3-5]，致使再造指关节功能大多丧失，再造手指的功能受限，故此种方法一直得不到有效的临床推广。笔者设想应用组织工程方法将软骨种子细胞种植于同种异体冻干骨平台上，植入实验动物体内观察能否形成关节软骨样结构，探讨这一方法的可行性。
1材料和方法
1.1 实验材料:3月龄日本大耳白兔40只及2周龄日本大耳白兔幼兔4只，雌雄不限（复旦大学动物实验中心提供）。胰蛋白酶、II型胶原酶及DMEM培养基购自GIBCO公司。PLGA膜片购自Synthecon公司（连峰硕士惠赠）。兔抗II型胶原多克隆抗体和生物素标记的羊抗兔 IgG购自武汉博士德。
1.2 实验方法
1.2.1 冻干骨关节的制备和PLGA膜片的粘合：供体兔过量麻醉处死，取兔前足趾骨关节头48个，其中10个截除关节面软骨层，加工制成冻干骨关节[6]后环氧乙烷消毒塑料袋密封常温保存备用。PLGA膜用0.01%多聚赖氨酸中浸泡处理，裁剪成4mm×4mm大小膜片，取完整冻干骨关节及截除软骨层冻干骨关节各8个，用生物蛋白胶粘合剂将PLGA膜片粘合在关节面端表面，环氧乙烷消毒塑料袋密封常温保存备用。
1.2.2 种子软骨细胞获取、扩增及软骨细胞-材料复合物的体外构建：采用林荔军[7]法获取种子软骨细胞，进行细胞培养。细胞贴满皿底后传代扩增。重复该过程至第三代细胞融合。将第三代软骨细胞消化、计数、台盼蓝染色检测扩增的关节软骨细胞活力95%以上，制成细胞浓度为5×107/ml的悬液备用。将经环氧乙烷消毒后的四组材料(见表1) 分别置入四个培养皿中,用少量培养液湿化，用上述细胞悬液各5ml均匀滴在每个材料上，6h后加入培养液，以后每2天换液一次,培养至1周。
1.2.3 软骨细胞-支架材料复合物动物体内植入及观察：成年日本大耳白兔32只，随机分为A、B、C、D共4组，每组8只，分别植入相对应组别的软骨细胞-支架材料复合物。植入物种植于取左后足第2趾跖骨头位置。A、B、C组实验兔自跖骨头下5mm水平咬骨钳咬除跖骨关节头，造成缺损长度在0.8cm左右，将相对应的A、B、C组软骨细胞-支架材料复合物按原解剖位置植入关节缺损处，39号医用钢丝骨断端处环扎内固定，关节复位，修复肌腱，关闭切口，酒精纱布包裹。D组实验兔保留自体跖趾关节，跖骨关节头软骨全层用电钻毁损，形成孔洞模型，直径4mm,深度5mm,将软骨细胞-PLGA材料复合物置入孔洞内，关节复位，修复肌腱，关闭切口，酒精纱布包裹。术后四组实验兔均予青霉素80万单位肌注，1天2次，共3天。实验兔单只笼内放养，伤口均愈合良好，于3月后处死动物取材观察及检测。
2结果
2.1 大体观察：A组表面未见明显新生软骨样结构。B组和C组关节腔内可见新生物出现，呈较典型的半透明类软骨样结构形成；关节腔内的新生物与冻干骨平台无紧密粘连（图1）。D组所有样本关节面表面均基本修复完整，原孔洞处出现白色新生物，新生物外观光滑，探针触感质地似软骨样，与周边组织无明显肉眼边界（图2）。
2.2 显微镜下观察：HE染色可见A、B组冻干异体骨关节面表面软骨组织吸收、裂解，局部破碎，软骨陷窝处未见软骨细胞存活，关节面处无新生软骨层。B、C组关节腔内获得的类软骨样结构镜下可见典型软骨光镜下结构特点，软骨陷窝内见活性细胞结构，细胞周边为均匀的软骨基质成分，软骨样结构边缘可见纤维结缔组织成分（图3）。D组镜下可见新生软骨样结构修复原自体关节面软骨层孔洞缺损，新生软骨样组织与原自体关节孔洞缺损边缘有较明显组织学外观差异，细胞形态较幼稚，但两者粘合紧密（图4）。II型胶原免疫组化染色均观察到B、C组及D组HE染色显微镜下观察到的软骨结构II型胶原棕褐色反应，为阳性染色结果，证实新生物中存在特异性软骨基质成分。
3讨论
支架材料是构建组织工程软骨的物质基础。软骨种子细胞的培养与扩增对微环境有特殊的要求。支架材料要能为种子细胞提供一个三维生长环境，使种子细胞在其中繁殖、生长、代谢，发挥细胞间的信号调控作用，不断分泌细胞外基质，以逐步取代降解的支架材料，最终形成有活性的软骨组织。
关节软骨为透明软骨，组织学特点为软骨陷窝周边为大量软骨基质成分，形成较均匀紧密的结构，故即使经深低温冷冻干燥处理，冻干骨关节的关节软骨面组织仍然无法形成组织工程细胞培养所需的三维腔隙结构，总体孔隙率不足以提供细胞生长、增殖、物质交换所需的三维空间需求。故在单纯冻干骨表面种植软骨细胞进行动物体内实验，笔者认为形成新生组织工程化关节软骨难度大。PLGA[8-9]材料由PGA和PLA共聚而成，具有优良的生物相容性，无毒、可生物降解，可控性良好。本实验选用的PLGA降解周期为6～8周。已有很多学者报道应用PLGA支架材料在体外或实验动物体内再造形成各种组织工程化软骨[10]。前期试验中，笔者观察到冻干骨和聚羟基乙酸聚乳酸共聚物(PLGA)材料表面软骨细胞均有粘附增殖及基质分泌，但后者明显优于前者[11]。因此，笔者考虑在冻干骨支架上粘合PLGA材料使软骨细胞获得良好的生存环境，以利再造形成类关节软骨样结构。
A组没有产生新生软骨样组织。B组和C组关节腔内产生了经切片检查证实的类关节软骨样组织。D组植入自体关节孔洞缺损3月后，取材观察见所有样本缺损处均基本修复，新生组织具有软骨样外观及质地。显微镜下见较典型的单一的软骨组织。和A组相比较，这表明软骨细胞-PLGA膜片在类关节软骨样组织的形成过程中起了决定性的作用。笔者分析，在冻干骨关节面表面由于没有出现三维立体空间结构，无法满足软骨细胞的营养代谢和物质交换需求，故植入实验兔体内后软骨细胞无法长期存活，难以重建软骨层；与此相对应，PLGA膜片为种植的软骨细胞提供了需要的三维立体空间结构，故在体内产生了类关节软骨样组织。但是，笔者在显微镜下同时也观察到B、C组关节腔内出现的并不是典型的关节软骨层结构，其与纤维结缔组织共同出现，故笔者只是称之为类关节软骨样组织；况且，这种类关节软骨样组织与冻干骨表面没有产生紧密的组织学联系，所以它们可能不具备关节软骨层的组织学功能。
本实验中异体软骨细胞-PLGA支架材料复合物可修复D组的自体软骨缺损，但在冻干骨支架上未能形成笔者预期的有组织学功能的新生关节软骨层。A、B、C组植入术后形成的关节均为半自体、半异体所组成的复合关节，其营养供给必然受限；而D组的营养供给则要明显充裕，有利于细胞的功能发挥和软骨重建，故实验结果理想。笔者认为冻干骨的致密的组织形成的单层界面导致种植的软骨细胞无充足营养供给也是其可能原因。
对此，笔者设想对冻干骨材料进行一些改进或许能实现之前的实验目的。虽然关节头处软骨层结构致密，但软骨层下方即为具有三维多孔疏松网状结构的松质骨；之前笔者制备去关节软骨面冻干骨（C组）时在关节颈水平截骨，软骨层下方的松质骨也同时丢弃，骨断面为致密皮质骨，软骨细胞或细胞支架材料复合物粘附生长不佳。笔者制备冻干骨支架时仅将致密软骨层磨去而将软骨层下方的松质骨保存，或可脱钙处理去除骨内沉积的钙盐使支架材料结构更为疏松，脱钙骨基质中含有骨形态发生蛋白具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力。以此为细胞载体，可能这样的冻干骨支架有助于形成有功能意义的关节软骨层[12-13]。这些设想需留待今后的实验进一步验证。
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