血液的化学元素篇（1）

【关键词】 异黄酮苷元滴丸;异黄酮苷元片剂;高效液相色谱法;药代动力学;相对生物利用度

abstract:objective to investigate the pharmacokinetic and relative bioavailability of isoflavone aglycone dripping pills and tablets in healthy sd rats,and evaluate the pharmacokinetic effects of the two dosage forms of isoflavone aglycone. methods 36 sd rats were intragastrically administered with the suspension solution of isoflavone aglycone dripping pills and tablets at single dose,and changes in plasma concentration were determined by hplc. pharmacokinetic data were processed with 3p97 software and the pharmacokinetic parameters and relative bioavailability were calculated. results for dripping pills of isoflavone aglycone:auc=46.30 μg·min·ml-1,cmax=0.89 μg·ml-1,tmax=18.03 min; and for tablets of isoflavone aglycone:auc=36.01 μg·min·ml-1，cmax=0.41 μg·ml-1，tmax=31.43 min. the relative bioavailability of dripping pills and tablets was 128%. conclusion the pharmacokinetics of dripping pills and tablets of aglycone isoflavone were in accordance with single compartment model，and the relative bioavailability of dripping pills of aglycone isoflavone was higher.

key words:isoflavone aglycone drippping pills; isoflavone aglycone tablets; hplc; pharmacokinetics; relative bioavailability

异黄酮苷元(isoflavone aglycone)是一种来源于豆类植物的游离苷元，包括染料木素、黄豆苷元、黄豆黄素3种活性成分，其中染料木素的结构与雌二醇相似，且含量最高，生物活性最强[1]。异黄酮苷元是一种具有较强的抗氧化活性和神经保护作用的植物雌激素，在防治老年性痴呆和由于雌激素缺乏导致的骨质疏松等方面有良好的应用前景[2]。但异黄酮苷元难溶于水，生物利用度低，影响了其在体内的生物活性。本实验通过考察自制异黄酮苷元滴丸[3]和片剂[4,5]的药代动力学特征，为异黄酮苷元滴丸的临床应用提供依据。

广东药学院学报 第25卷 第6期 杨红,等.异黄酮苷元滴丸和片剂在大鼠体内的相对生物利用度研究

1 材料与仪器

1.1 材料

异黄酮苷元滴丸和片剂是由本实验室从大豆中提取制备的游离苷元研制而成(平均丸重25.03 mg·丸-1，染料木素含量为133.2 mg·g-1;平均片重453.84 mg·片-1，染料木素含量为5.40 mg·g-1);染料木素对照品(上海同田生化技术有限公司);无水甲醇(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);磷酸(分析纯,沈阳 经济 技术开发区试剂厂);甲醇(色谱纯,tedia公司);异黄酮苷元滴丸灌胃液(精确称取0.05 g滴丸细粉，0.5%羧甲基纤维素钠定容到100 ml，得到含染料木素66.6 μg·ml-1的灌胃液);异黄酮苷元片剂灌胃液(精确称取1.234 剂细粉，0.5%羧甲基纤维素钠定容到100 ml，得到含染料木素66.6 μg·ml-1的灌胃液);其余试剂均为分析纯。

1.2 动物

sd大鼠36只，鼠龄8～12周，体质量(200±10)g，广州中医药大学实验动物中心，许可证号：scxk(粤)2008?0020，粤监证字2008a002。

1.3 仪器

p680a高效液相色谱仪(美国戴安公司);re52cs旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);低sh2?d循环水试真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);数显恒温水浴锅(江苏省宏华仪器厂);xw?80型旋涡混合器(上海第一医学院仪器厂);高速离心机(日本日立公司)。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

取空白血浆6份,分别精密加入染料木素对照品制得质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 μg·ml-1的对照品溶液，4 ℃保存备用。

2.2 色谱条件

参照 文献 [6,7]进行改进：色谱柱为diamonsil c18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);柱温为25 ℃;流动相为甲醇?0.3%磷酸溶液(体积比48∶52);流速为0.7 ml·min-1;测定波长为254 nm;进样量为20 μl。

2.3 血浆样品预处理

取血浆1 ml， 加入1 ml乙酸乙酯， 涡旋振荡

2 min，3 000 r·min-1离心5 min，移取上层有机相于另一试管中;将下层溶液重复上述步骤，合并有机相溶液，通风橱中挥干，残留物加无水甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，用无水甲醇定容于2 ml容量瓶，得血浆样品溶液。

2.4 方法专属性

在“2.2”项色谱条件下，测得空白血浆、对照品血浆(含染料木素)、样品血浆(含异黄酮苷元)的色谱图见图1。从图1可见，血浆中的杂质不干扰测定。

2.5 标准曲线[8]

取“2.1”项下的对照品溶液，按“2.3”项下处理并进样测定，以染料木素溶液的质量浓度为横坐标,相对应的染料木素的峰面积为纵坐标,用最小二乘法进行线性回归 计算 ，得回归方程为y=3272.06 x-1.87，r=0.999 9。表明染料木素对照品的质量浓度在0.05～1.60 μg·ml-1(n=6)范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取空白血浆1.0 ml，按“2.3”项下处理，制得高、中、低3种浓度(1.60、0.80、0.40 μg·ml-1)的样品溶液，分别于1 d内和3 d内连续进样5次测定，并计算rsd值，结果见表1。表1 精密度试验结果

2.7 相对回收率试验

精密吸取血浆样品3份，按“2.3”项下操作处理，得血浆样品溶液并根据标准曲线计算样品溶液浓度，将所得浓度与实际浓度的比值即相对回收率，见表2。表2 相对回收率结果

2.8 稳定性考察

取“2.1”项下的3种浓度(1.60、0.80、0.40 μg·ml-1)的溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样分析，结果显示溶液中染料木素的rsd为0.83%，表明样品溶液在4 ℃避光条件下12 h内稳定。

2.9 血浆样品测定

取sd大鼠36只，随机分成2组，隔夜禁食，分别灌胃给予异黄酮苷元滴丸灌胃液或异黄酮苷元片剂灌胃液(2 ml·只-1),于灌胃后0、5、10、15、30、45、60、75、90、105、120、150 min对大鼠进行眼眶取血(约1.5 ml·只-1)， 置肝素试管中抗凝， 5 000

r·min-1离心5 min，分离上清液，得血浆样品。按“2.3”项下方法处理得到血浆样品溶液并进行测定，利用回归方程求出血药浓度。

3 结 果

3.1 血药浓度测定结果

按不同时间点求出平均血药浓度，并绘制血药浓度-时间曲线，见图2、3。由图可见：15 min时滴丸的血药浓度为0.706 μg·ml-1，片剂的血药浓度为0.405 μg·ml-1，相比其他时间点，此采血点的血药浓度最高。

3.2 药动学参数

血药浓度数据经药代动力学软件3p87拟合处理后，药动学参数结果见表3。从表3可见：异黄酮苷元滴丸和片剂均符合一室模型;滴丸和片剂的主要药代动力学参数具有明显的差别，滴丸在18.03 min时达到血药浓度峰值0.89 μg·ml-1，而片剂出现2个峰值，分别在15 min和75 min，血药浓度峰值为0.41 μg·ml-1和0.365 μg·ml-1;滴丸的auc为46.30 μg·min·ml-1，而片剂的为36.01 μg·min·ml-1，滴丸的相对生物利用度约为片剂的128%。表3 异黄酮苷元滴丸和片剂药代动力学参数

4 讨 论

异黄酮苷元具有苯并吡喃酮结构，有较强的紫外吸收，3种活性成分均难溶于水[9]，影响了其在体内的吸收利用。本实验对自制异黄酮苷元滴丸和片剂的药代动力学特征和生物利用度考察，结果显示滴丸的血浆药物浓度-时间曲线为单峰，而片剂表现为双峰，说明片剂可能在大鼠体内存在肝肠循环;异黄酮苷元滴丸生物利用度为片剂的1.28倍，说明滴丸可显著改善和提高异黄酮苷元在体内吸收和代谢，在一定程度上解决了异黄酮苷元难溶于水，生物利用度低的问题。本文结果为进一步的体内研究提供了依据。

血液的化学元素篇（2）

【关键词】  脑微血管内皮细胞; 神经元; 脑缺血; 大鼠; 中药

近年来中药调节脑微血管内皮的研究日益受到人们的重视［1～3］，但整体动物实验无法将内皮细胞与脑细胞分离开来进行研究，本实验室采用大鼠大脑皮质微血管内皮细胞和神经元分离纯化培养的方法，可使其纯度分别达到98%，是研究二者之间关系的一种可靠的实验方法。通络救脑注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）是治疗缺血性脑病的中药新药。初步实验证实，TNJNI在缺血内皮细胞损伤状态下具有可靠的维护脑微血管内皮功能的作用［4，5］。这种对脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）的保护作用是否启动进一步的脑保护效应有待探知。本实验通过观察CMECs缺血损伤及通络救脑注射液干预后的不同条件培养液（conditioned medium， CM）抗缺血神经元损伤的效应，探讨CMECs与神经元的功能联系，并进一步阐明通络救脑注射液的“解毒通络”作用机制，对于深化“毒损脑络”病机［6］的生物学理论内涵具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠18只，体质量 60～80 g ，用于同一批CMECs原代培养。新生SD大鼠（24 h内）4只，用于同一批原代神经元培养。动物合格证号为SCXK京2002-0003，清洁级，购自北京维通利华实验动物中心。

1.1.2 药物 通络救脑注射液，批号为04061011，购自内蒙古康源药业有限公司。 药物组成为栀子和三七，提取分离有效成分栀子苷和三七总皂苷，配伍制成注射液，该注射液含原药有效成份为 7.7 mg/ml。

1.2 实验方法 通过乳酸脱氢酶（lactate dehydro-genase， LDH）的检测，观察正常、缺血及缺血再灌不同状态的脑微血管内皮细胞条件培养液（condi-tioned medium of cerebral microvascular endotheli-al cells， CMECs-CM）和 TLJNI干预后的CMECs-CM抗缺血及缺血再灌皮质神经元损伤的特征效应。

血液的化学元素篇（3）

[Abstract] Objective: To explore the relativity between the contents of traces element and the HCMV infection in newborns. Methods: Determined by PCR and ELISA， 80 samples with CMVIgM positive serumn and FQCMVDNA positive in serum and urine were recruited as subject group and 102 samples with those of negative were enrolled as control group. The contents of traces element in the all the samples were determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry(ICPAES) method. Result: The content of serum Zn、Fe、Mg、Ca in subject group was distinctly lower than that in control group(P

[Key words] human cytomegalovirus; the newborn; trace element

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)流行广泛，是危害人体健康最严重的病毒之一，血清IgG阳性波动率50%～100%[1]，可引起先天性及围产期感染，胎儿早期宫内感染可引起出生缺陷，病死率10%～30%[2]。新生儿先天性HCMV感染的发病率为0.15%～2.0%[3]，可造成新生儿的先天性小头畸形、视网膜脉络炎、智力障碍等。研究人员发现在病毒感染期间，许多微量元素下降，血清和病毒靶器官组织的微量元素均有显著变化，尤其发现血清中的显著变化优先于靶器官组织受累的初期阶段。同时，微量元素的改变与疾病并发症的发生密切相关[4]。本研究旨在探讨新生儿巨细胞病毒感染与血液中微量元素含量的相关性，为临床提供一项新的辅助诊治依据。

1 临床资料

1.1 一般资料

(1) HCMV感染阳性组为2007年2月至2008年10月我院新生儿病房收治的HCMV感染的足月新生儿80例(其中男46例，女34例;日龄1～12 d，平均5 d;体质量2 230～3 340 g，平均2 722 g)，均血清CMVIgM抗体阳性、血清及尿液FQCMVDNA>1.0×103拷贝·ml-1。对照组足月新生儿102例(其中男57例，女45例;日龄1～18 d，平均7 d;体质量2 255～3 370 g，平均2 783 g)，均血清CMVIgM抗体阴性、血清及尿液FQCMVDNA

(2) HCMV感染组中出现病理性黄疸71例，占88.8%;ALT升高48例，占60%;体温增高(>38 ℃)33例，占41.3%;贫血38例，占47.5%;肝大61例，占76.3%;皮疹22例，占27.5%。

1.2 试验条件

(1) 德国欧蒙医学实验诊断有限公司(EUROIMMON)提供TORCH检测试剂盒测定血清CMVIgM抗体。

(2) 美国BioRad伯乐iclycler全自动PCR分析仪。血液：EDTA2K抗凝血1.5 ml;尿液：取2～3次尿液放入经处理容器中，离心后取1 ml标本。分别提取DNA，中山安达基因股份有限公司提供试剂进行荧光定量PCR扩增，PCR仪做结果分析。>1.0×103拷贝·ml-1为阳性。

(3) 法国JY公司ULTIMA2型电感耦合等离子体原子发射光谱仪。高频发生器频率40.68 MHz，测定高频输出功率1.0 kW，反射功率

(4) 感染组和对照组的患儿均于清晨空腹4 h以上，股静脉抽取血标本，送检;清晨留取尿液标本，1 h内送检。

1.3 统计学处理

采用SPSS 14.0统计学软件作两独立样本t检验，P

1.4 结果

HCMV感染组与新生儿对照组比较，血清Zn、Fe、Mg、Ca均均减低(P

2 讨 论

本研究显示，新生儿HCMV感染时伴有低锌、低铁、低镁、低钙、高铜、高铅的微量元素失衡表现，血清锌水平明显低于新生儿对照组(P

铜也是人体的重要物质，铜和血浆铜蓝蛋白具有酶和氧化活性，能增强机体的防御能力。新生儿HCMV感染时，血清铜的含量较对照组明显增高(P

缺铁可直接损伤淋巴细胞的生成，使外周血内T细胞数目减少，中性白细胞杀菌能力减低，细胞清除率降低。引起铁的损失同时也造成了镁的吸收障碍。钙在机体生理活动的调节上具有重要的作用。新生儿HCMV感染时，钙元素含量显著低于对照组(P

微量元素的变化与病毒感染性疾病发病机制、疾病转归之间的关系正成为研究的热点之一[9]。研究发现，发生HCMV感染会导致血液微量元素的失衡;同时，微量元素的变化也导致了HCMV感染的进一步发展以及并发症的发生，对疾病的治疗和预后有一定的影响。重视微量元素异常与病毒感染的关系研究，对患儿病毒性疾病的防治将具有重要的意义。

参考文献

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[2] 陈平洋，谢宗德，王涛.更昔洛韦治疗新生儿先天性巨细胞病毒感染的临床研究[J].中国医师杂志，2003，5(4)：502504.

[3] 李易娟，曾瑜，庄思齐，等.不同实验方法在诊断和监测新生儿先天性巨细胞病毒感染中的临床研究[J].中华围产医学杂志，2005，8：l87190.

[4] ILBACK N G，BENYAMIN G，LINDH U， et al.Trace element changes in the pancreas during viral infection in mice[J]. Pancreas， 2003，26:190196.

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血液的化学元素篇（4）

目的 探讨体外模拟缺血再灌注后大鼠皮质神经元内质网应激诱导凋亡的机制及丹红注射液对其的干预作用。方法 体外培养大鼠皮质神经元，神经元特异性烯醇酶（NSE）鉴定神经元纯度。建立体外培养大鼠皮质神经元模拟缺血再灌注模型，随机分为对照组（始终正常培养）、缺血再灌注组（体外模拟缺血再灌注）、治疗组（缺血再灌注加丹红注射液干预），应用免疫组织化学、免疫荧光染色方法鉴定神经元纯度；流式细胞术Annexin V、PI双标检测神经元凋亡率及活性半胱天冬酶(Caspase)3、Caspase8、Caspase9蛋白表达；Westernblot免疫印迹分析法检测活性Caspase12、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、Bcl2及细胞色素C蛋白表达。结果 大鼠皮质神经元可纯化体外培养。皮质神经元体外模拟缺血6 h再灌注24、 48 h细胞凋亡率分别为（17.95±1.03）％、（22.62±0.98）％，丹红治疗组（8 mL/L)分别为（9.74±0.56）％、 （3.93±0.23）％，两组比较差异有统计学意义（χ2=7.164、10.650，P0.05）。神经元缺血再灌注后细胞色素C表达增加，Bcl2表达减少，活性Caspase3、Caspase8、Caspase9表达增加，丹红注射液治疗后细胞Bcl2表达增加，细胞色素C释放减少，活性Caspase3、 Caspase8、Caspase9含量降低，两组比较差异有显著性（t=8.374～25.235，P

【关键词】 神经元 再灌注损伤 内质网 应激 半胱天冬酶 丹红注射液 大鼠 Sprague Dawley

［ABSTRACT］ Objective To study the protection effect of danhong injection on rat cortical neurons during apoptotic induction of simulated ischemia/reperfusion in vitro. Methods Rat cortical neurons were cultured in vitro and identified by NSEimmunohistological staining and immunofluorescence staining. Neuronal ischemia/reperfusion models in vitro were established as followings: cultures were rinsed twice with PBS， then subjected to ischemia for 6 h in Earle’s without glucose by placing culture wells into an anaerobic chamber with an atmosphere of 0.05 CO2， 0.95 N2 at 37 ℃， reperfusion was performed by removing neuronal culture wells from the anaerobic chamber and adding normal medium to an incubator with an atmosphere of 0.05 CO2、 0.95 air at 37 ℃. Percentage of apoptotic cells and expression levels of active Caspase3，9，8 were determined by flow cytometric analysis. Protein levels of GRP78， Bcl2， Cyt C and active Caspase12 were assessed by immunoblotting. Results The apoptosis rate induced after reperfusion 24 h and 48 h was (17.95±1.03)% and (22.62±0.98)% respectively and was decreased to (9.74±0.56)% and (3.93±0.23)% after treated by danhong injection (8 mL/L) respectively (χ2=7.164，10.650;P

［KEY WORDS］ Neurons; Reperfusion Injury; Endoplasmic reticulum; Stress; Caspases; Salvia miltiorrhiza injection; Rats， SpragueDawley

凋亡是脑缺血后神经元死亡的一种重要形式。线粒体功能受损，细胞色素C自线粒体腔释放到胞浆是脑缺血后神经元凋亡关键的一步[1]。内质网是细胞表面蛋白及分泌蛋白合成、折叠、修饰和运输的场所。内质网应激引起的生理功能失调可发生在多种疾病中，如阿尔茨海默病、帕金森病、神经元缺血损伤、朊病毒病、囊性纤维病、糖尿病等[2]。近年来研究认为，内质网应激持续存在可迅速导致细胞凋亡[3]。Caspase12为半胱天冬酶家族成员之一，位于内质网，可特异性被内质网应激激活[4]。各凋亡信号转导途径及各细胞器之间存在着复杂的相互联系。脑缺血再灌注后神经元凋亡的发生机制目前还不十分清楚。本实验旨在探讨大鼠皮质神经元原代培养体外模拟缺血再灌注后细胞凋亡发生的机制，了解线粒体功能及内质网应激之间的相互关系，以及丹红注射液对其的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

新生SD大鼠(出生24 h内)由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；高糖DMEM、Neuronbasal培养液、B27、胎牛血清、马血清等均购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶、L多聚赖氨酸购自Sigma公司；Annexin VFITC 购自Bender Med Systems公司；AntiCaspase12、AntiGRP78多克隆抗体分别购自Stressgen公司；Active Caspase3、Caspase9、 Caspase8试剂盒购自BioVision公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司；NSE组化检测试剂盒购自北京中山公司；其他试剂均为市售分析纯。CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220， USA)；荧光倒置显微镜（Olympus， JAPAN)；全自动酶标分析仪 (Thermo Electron Corporation Multiskan MK3， USA)；流式细胞仪（FACSCLSR，BectonDickton，USA)；激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluoview FV 500 Imaging System，日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 皮质神经元培养与鉴定 取出生24 h以内SD大鼠皮质于冷解剖液（4 ℃）中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成小于1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，37 ℃水浴消化20 min， 加种植培养液(DMEM 中添加体积分数0.10胎牛血清及体积分数0.10马血清，pH 7.2～7.4) 终止消化并吹打，细胞悬液经200目滤网过滤，获得单细胞悬液，将1×106个细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天更换维持培养液（Neuronbasal加体积分数0.02 B27），培养3～5 d半量换液，7～10 d用于实验。NSE免疫组织化学染色和IgG 免疫荧光染色(FITC 标记的兔抗鼠IgG 1∶200稀释) 鉴定神经元。

1.2.2 丹红注射液对原代神经元活力的影响 采用MTT法检测。取前述原代神经元（细胞密度1×106/L），按每孔100 μL接种于96孔板，培养5 d后随机分为空白对照组、阴性对照组、实验组，每组5个平行孔。实验组神经元加丹红注射液，终浓度分别为0.8、8.0、80.0 mL/L，分别继续培养1、2、3 d，每孔加入MTT 15 μL，37 ℃孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO100 μL，室温下放置10 min，待镜下观察紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR 400 ELISA 读数仪测定波长570 nm处吸光度（A）值。

1.2.3 神经细胞体外模拟缺血再灌注模型的建立参照GOLDBERG等[5]的方法，取培养7～10 d 的神经元细胞，吸去原培养液，使用无糖Earle’s液洗2次后，加入无糖Earle’s液， 然后将细胞培养瓶或培养板置于可通气低氧罐内，向罐内持续缓慢通入含有体积分数0.95的N2和0.05的CO2混合气体以排除含氧的空气。通气30 min后，罐内含氧量低于0.01，夹闭低氧罐的进口与出口，置培养箱内密闭6 h（体外模拟缺血）。然后取出低氧罐，吸去无糖Earle’s液，换回维持培养液，放入恒温培养箱中继续培养24 h或48 h（再灌注）。

1.2.4 神经元凋亡检测 取上述分组培养的神经元胰蛋白酶消化后在4 ℃离心5 min， 去上清后细胞沉淀用冷PBS液洗2次， 加195 μL 结合缓冲液悬浮细胞， 然后加入Annexin VFITC 5 μL， 室温避光孵育10 min， 结合缓冲液洗3次，用190 μL结合缓冲液重悬细胞，加10 μL(20 mg/L)PI(终浓度1 mg/L)。流式细胞分析仪检测，重复3次。

1.2.5 活性Caspase3、Caspase9、Caspase8蛋白表达检测 前述各组及阴性对照组（正常培养的细胞培养液中加1 mL/L各种Caspase抑制剂共孵育）细胞（1×109/L）经消化、重悬，取300 μL细胞悬液于EP管中，每管分别加1 μL应用FITC标记的Caspase3、 Caspase9、 Caspase8，37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育1 h。以3 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入0.5 mL缓冲液重悬细胞，再以3 000 r/min离心5 min，弃上清，300 μL缓冲液重悬细胞，流式细胞分析仪检测，重复3次。

1.2.6 Caspase12、GRP78、细胞色素C和Bcl2表达检测 采用Westernblot免疫印迹分析法。各组细胞按照总蛋白提取试剂盒方法操作提取总蛋白，按蛋白定量试剂盒说明定量。免疫印迹操作参照ELYAMAN等[6]的方法进行。每组实验至少重复3次。利用激光扫描光密度分析法半定量测定细胞活性ActiveCaspase12、GRP78、细胞色素C以及Bcl2水平变化。

1.3 统计学处理

计量资料以±s表示。两组数据间比较采用t检验，多组数据间比较采用双因素方差分析，应用SPSS 12.0统计学软件进行数据计算。

2 结果

2.1 原代神经元培养

培养7 d的皮质神经元经NSE染色后， NSE阳性细胞占细胞总数的（92.69±4.10）%(n=5)。故可认为是纯神经元培养。

2.2 不同浓度丹红注射液对原代神经元活力影响

丹红注射液8.0 mL/L组第1～3天神经元的吸光度值高于对照组，80.0 mL/L组第2～3天神经元的吸光度值低于对照组，差异有显著性（F=35.551，q=3.081～5.326，P

表1 不同浓度丹红注射液对神经元活力的影响（略）

与对照组比较，F=35.551，*q=3.081～5.326，P

2.3 体外模拟缺血再灌注诱导的神经元凋亡

用Annexin VFITC和PI联合染色，可以区分正常细胞(两种染色均阴性)、早期凋亡细胞(Annexin VFITC阳性，PI阴性)、晚期凋亡或死亡细胞(两种染色均阳性)。通过流式细胞仪测定，正常培养大鼠皮质神经元经体外模拟缺血再灌注后，细胞凋亡明显增加，24 h凋亡率为（17.95±1.03）％，至48 h凋亡率为（22.62±0.98）％；治疗组在缺血的的同时加用8 mL/L丹红注射液，再灌注至24 h凋亡率为（9.74±0.56）％，48 h凋亡率为（3.93±0.23）％，两组比较，差异均有显著意义（χ2=7.164、10.650，P

2.4 活性Caspase3、 Caspase9、 Caspase8表达

原代培养的神经元经体外模拟缺血6 h后再灌注24、48 h，活性Caspase3、 Caspase9、 Caspase8的表达明显，加用8 mL/L丹红注射液，三者表达均显著下降(t=8.374～22.107，P

2.5 Caspase12、 GRP78、细胞色素C、Bcl2免疫印迹分析

免疫印迹分析显示，神经元缺血再灌注24、48 h后，神经元GRP78免疫活性明显增加，丹红治疗组GRP78活性减低，两组相比差异无显著性（t=0.976、1.750，P>0.05）。在缺血再灌注损伤24 h后，活性Caspase12表达增加，48 h时Caspase12表达下降；丹红治疗组活性Caspase12表达与对照组相似，两组比较差异无显著性（t=0.591、1.772，P>0.05）。缺血再灌注损伤神经元细胞色素C表达增加，而丹红治疗组表达减低；神经元Bcl2免疫活性在缺血再灌注后有较低表达，丹红治疗组Bcl2表达明显增强，治疗前后相比，差异有统计学意义（t=13.536～25.235，P

3 讨论

多种细胞信号途径、应激状态可以引起细胞凋亡。近年来，内质网作为线粒体凋亡途径的调节器越来越受到重视[7]。作为内质网应激标志物的分子伴侣GRP78在内质网发生应激时表达上调[8]。内质网对氧化应激十分敏感[9]。人们还发现，内质网和线粒体位置很密切，可以通过分子弥散影响彼此的功能。内质网损伤和线粒体细胞色素C的释放可能存在关联性。本文结果显示，体外培养的大鼠皮质神经元在缺血6 h再灌注24、48 h后，GRP78免疫活性明显增加，提示神经元发生了内质网应激，各实验组神经元凋亡发生率均显著高于对照组。为了探讨培养神经元凋亡发生的机制，本文分别应用FCM、Western blot检测活性Caspase3、Caspase9、Caspase8、Caspase12的表达，实验结果显示，实验组Caspase12活性在再灌注24 h明显增强，而到了48 h则有所降低。提示Caspase12在内质网应激凋亡早期起到很大作用。神经元缺血再灌注后活性Caspase3、Caspase9以及Caspase8均明显增加，说明Caspase3、Caspase8、Caspase9、Caspase12均参与了缺血再灌注后的神经元凋亡。细胞凋亡是复杂的过程，线粒体途径、死亡受体途径、内质网应激等细胞器途径之间存在着复杂的相互联系。

表2 丹红注射液治疗前后各种Caspase表达比较（略）

与缺血再灌注组比较，*t=8.374～22.107，P

表3 丹红注射液治疗24 h免疫印迹分析结果（略）

与缺血再灌注组比较，*t=13.536、18.936，P

表4 丹红注射液治疗48 h免疫印迹分析结果（略）

与缺血再灌注组比较，*t=13.76、25.235，P

Bcl2蛋白家族，包括 Bcl2、 Bclx、Bad等，对凋亡起着重要的调节作用[10]。促凋亡因子Bax 和Bak通过促进线粒体释放细胞色素C而促进凋亡，Bcl2作用正相反。最近有证据表明，Bax 、 Bak和Bcl2也定位于内质网，并被内质网应激激活[11]。本实验显示，在内质网应激时，Bcl2免疫活性降低，细胞色素C表达增加。可能在细胞遭受应激反应时，内质网应激激活的相关Caspase是凋亡的早期事件，随后导致线粒体外膜通透性增加，细胞色素C释放到胞浆，进而促进凋亡复合体的形成，激活效应Caspase，引起凋亡。但体外培养大鼠皮质神经元凋亡中各途径之间的联系还有待进一步研究。

丹红注射液由中药红花和丹参科学提取精制而成，主要成分为红花黄色素、丹参酮和丹参酚等。丹参可扩张脑动脉，降低血管阻力，降低血液黏度，增强红细胞变形能力，并能清除氧自由基，拮抗Ca2+内流，改善ATP酶活性， 同时也可提高脑组织耐低氧能力， 对脑组织具有明显的保护作用。红花具有活血通络、祛瘀止痛的作用，红花提取物在体内、体外均能明显抑制血小板聚集，对内源性凝血系统的激活有一定的抑制作用，有增加脑动脉血流量及营养脑细胞的作用[12]。给予体外培养的大鼠皮质神经元8 mL/L丹红注射液作用24、48 h后，细胞活力明显高于对照组，而80 mL/L浓度组细胞活力显著低于对照组。说明适当浓度丹红注射液对神经元存活有促进作用。丹红注射液是中药制剂，高浓度时可能存在细胞毒性，反而抑制细胞活性，具体机制尚需进一步研究。本文结果显示，丹红注射液作用于缺血再灌注损伤神经元24、48 h，细胞凋亡率明显减少，同时Bcl2免疫活性增强，细胞色素C表达减少，活性Caspase3、Caspase8、Caspase9表达均显著下降。但免疫印迹分析显示，GRP78及活性Caspase12的表达与对照组比较无显著差异。因此，我们认为丹红注射液对体外培养大鼠皮质神经元凋亡有抑制作用，其作用可能是通过上调Bcl2、抑制细胞色素C表达而实现的。

【参考文献】

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血液的化学元素篇（5）

世界上竟有蓝色的人种？考察队员们决定进一步调查。最后发现这些蓝色皮肤的人，竟是一个庞大的家族。他们居住在洞穴之中，过着狩猎和穴居的原始生活。他们不但肤色是蓝色的，而且连血液也是蓝色的。

在这之后不久，美国著名运动生理专家韦西，到南美洲探险时，在奥坎基尔查峰海拔6600米的高处，又发现了适应力极强的浑身皮肤发着蓝光的人种。韦西说在这样的山峰上，空气中的含氧量比海平面少50%，就是身强力壮的登山运动员也感到行动吃力。但这种奇的蓝色人，却能进行各种剧烈的体力劳动和奇特运动，真是令人咋舌。

此外，据报道，美国肯塔基州和非洲的撒哈拉沙漠中，也生活着一批为数不多的蓝色人。他们几乎与外界隔绝，长期进行家族内通婚，不愿同其他人种接触。一位美国生理学家在考察喜玛拉雅山时，在空气异常稀薄，呼吸十分困难的6000米以上高度，也曾意外地发现了一些蓝皮肤的僧侣，最令人惊异的是，这些蓝面僧侣，竟然谈笑自若，还能做一些粗重的工作。

黄色人种、白色人种、黑色人种、棕色人种，不管其肤色如何，血液却都一样，是鲜红色的血液，而蓝色人的血为什么会呈现出蓝色呢？

科学家经过旷日持久的研讨，对此提出了不同的理论和假说。

一种说法是，皮肤的颜色和血液的成分关系密切。血液是由血细胞和血浆两部分组成。血浆的主要成分是水和多种化学物质。血细胞形态不同，数量很多。包括红细胞、白细胞和血小板之类。白细胞和血小板是无色的，而红细胞中含有一种叫血红蛋白的红色蛋白质，因而使血液呈现红色。而蓝色人的血液中有一种“超高血型蛋白”，却缺乏一种控制这种蛋白增长的酶，所以他们的血液呈蓝色，致从事铍肤也呈蓝色。

一些美国科学家提出了不同的看法，他们认为，在血细胞内，血红蛋白负责输送氧气。当氧气充足时，血红蛋白会呈现红色，所以常人的血液皆为红色；但当缺乏氧气时，血红蛋白就会变成蓝色。蓝色人全身蓝色，可能就是高山缺氧所致。

还有一些科学家则提出新的看法。他们认为，蓝血是一种病理状态，是由于血液中某些化学成分发生了异常变化，而使血液呈现蓝色。按照遗传学说，决定生物性状的是遗传基因。这些人的血液之所以呈现蓝色，就是由于某种“特殊病态基因”造成的。这种含有错误遗传信息的基因，指导和决定了细胞中蛋白质的合成，使细胞蛋白质的结构发生差错。人体细胞合成血红蛋白的过程分为好几个阶段，所以节外生枝的机会很多。在病态基因的指挥下，很容易出现合成上的错误。蓝色人的血液变蓝很可能是这些方面出现了差错。

血液的化学元素篇（6）

【关键词】 应激

应激是机体对各种外界应激原作用的反应，适度的应激是机体保护机制的一部分，有益于健康。但过度的应激往往成为疾病的诱因〔1〕。研究证实，应激能够影响动物和人体的免疫功能〔2，3〕。机体免疫系统功能的紊乱又是感染性疾病、肿瘤等发生或恶化的直接原因〔4，5〕。实验研究表明，应激可引起机体细胞因子、蛋白、酶等的变化〔6，7〕，而有关应激与元素之间关系的研究较少。铁、锌、钙和镁是人体中的必需元素，在人体生理生化过程中起着重要作用。因此，研究应激与元素之间的关系有重要意义。原子吸收光谱法具有灵敏度高、选择性好、精密度高、分析速度快等优点。本文采用原子吸收光谱法测定了束缚应激后小鼠全血中铁、锌、钙和镁4种元素的含量，旨在探讨束缚应激对全血中元素的影响。

1 材料与方法

11 动物与分组 选用32只健康C57BL/6纯系小鼠，体重20～25g，雌雄兼用，随机分为对照组和束缚组，每组16只。

12 应激模型的制备 应激模型的制备按文献［8］进行。将小鼠装入带有通气孔的可以限制其各个方向的束缚器中，室温下维持12h。正常对照组小鼠留置原饲养笼中正常饲养。实验期间2组小鼠均禁食禁水。

13 标本采集 解除束缚后恢复2h，摘除眼球采血，肝素抗凝。

14 全血元素含量测定

141 样品处理 取肝素抗凝血05ml用去离子水稀释定容，测定铁、钙、镁稀释100倍，锌稀释30倍。

142 标准溶液的配制 铁、钙、锌的工作液（100μg/ml）及镁的工作液（50μg/ml）分别由1mg/ml的铁、镁、钙、锌储备液稀释而成。用工作液稀释成不同浓度的标准溶液。标准溶液系列：铁标准溶液为10，20，30，40，60μg/ml；钙标准溶液为01，02，04，08，12μg/ml；锌标准溶液为005，01，02，03，04μg/ml；镁标准溶液为005，01，02，03，04μg/ml。

143 元素测定 用AA370MC原子吸收分光光度计测定样品中4种元素的含量，优化后的仪器工作条件为空气流量：7L/min；乙炔流量：17L/min；灯电流：铁和锌为6mA，钙和镁为4mA；狭缝宽度：铁为02mm，锌、钙和镁为07mm；波长：铁为2483nm，锌为2139nm，钙为4227nm，镁为2852nm。对标准溶液进行测定，绘制标准曲线，各元素线性关系良好。各元素回归方程为铁：C=1383A-04848；锌：C=5815A-002241；钙：C=1613A+001452；镁：C=1038A-002035。相关系数铁：09942；锌：09979；钙：09994；镁：09996。

15 统计分析 应用SPSS 100 统计软件进行分析，测得数据经SPSSexplore去除奇异值后得到有效数据（即分组时各组均为16只，去奇异值后有的少于16只）采用独立样本t检验分析2组差异，检验水平为P＜005。

2 结果

21 小鼠全血铁含量测定 应激后16只小鼠全血中铁含量为(35123±3522)μg/ml，与对照组〔15只小鼠结果为(39120±1601)μg/ml〕比较，显著降低，差异有统计学意义(P＜005)。

22 小鼠全血锌含量测定 应激后16只小鼠全血中锌含量为(505±070)μg/ml，与对照组〔15只小鼠结果为(590±056)μg/ml〕比较，显著降低，差异有统计学意义(P＜005)。

23 小鼠全血钙含量测定 应激后16只小鼠全血中钙含量为(5968±740)μg/ml，与对照组〔16只小鼠结果为(5944±107)μg/ml〕比较，钙含量略微升高，差异无统计学意义(P＞005)。

24 小鼠全血镁含量测定 应激后小鼠15只全血中镁含量(4399±431)μg/ml，与对照组〔15只小鼠结果为(4512±388)μg/ml〕比较，镁含量降低，差异无统计学意义(P＞005)。

25 实验组元素间相关分析 采用Pearson进行相关分析。元素间相关性分析结果表明，相关性Fe-Zn，Fe-Ca，Fe-Mg，Zn-Ca，Zn-Mg，Ca-Mg的r值分别为0877，0135，0770，0073，0493，0388；P值分别为0000，0617，0001，0788，0062，0153。

3 讨论

钙、镁都参与水盐代谢，对维持内环境的稳定有重要作用。应激可能通过影响这些元素的代谢，重新维持内环境的平衡〔9〕，这可能是本文中引起钙镁变化的原因。铁主要用于合成血红蛋白，构成各种金属酶的必需成分或活化某些金属酶和它的辅助因子，在机体运送氧和细胞内电子传递中发挥极其重要的作用。在应激条件下，肌肉处于紧张的运动，代谢率增加，耗氧量随之增加〔10〕，而运载氧及氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)的生成均需要大量铁的参与，这可能是血中铁水平下降的原因。锌是多种酶的组成成分，在激素的产生、储存和分泌中起着重要作用。有研究表明，锌有应激保护作用。其应激保护机制可能与其参与构成机体抗氧化防御系统有关。锌可能通过提高机体抗氧化能力来实现其应激保护作用〔11〕。有研究表明，应激会引起体内锌的损耗〔12〕。应激小鼠血中锌下降可能是因为应激机体对锌的需求量增加，血中锌转移到发挥其生理作用的靶器官。对4种元素进行相关性分析，发现铁与镁、铁与锌有显著的相关性，可能应激对铁与镁及对铁与锌的影响机制相同。综上分析，微量元素铁、锌在应激中有着重要作用，其具体机制有待进一步探讨。

【参考文献】

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血液的化学元素篇（7）

我们在日常饮食中所吃的食物，如海带、菠菜、西瓜、萝卜、香蕉、梨、苹果、胡萝卜、草莓、莴苣、黄瓜、洋葱、藕、红薯、大豆等蔬菜、水果类、茶叶、牛奶等，含有较多的金属元素，如钙、钾、钠、铁、镁、锌等，经身体吸收代谢后生成带阳离子的碱性氧化物，可缓冲酸性代谢物，故称为碱性食品，而粮食谷类、禽畜、肉类、蛋类、鱼类、还有白糖、甜食、白酒、啤酒等含磷、硫、氯等酸性元素较多，在体内经消化和代谢，其最终产物呈酸性，故称为酸性食品。

血液的化学元素篇（8）

维持性血液透析(maintenance hemodialysis, MHD) 是终末期肾衰竭(end stag e renal disease, ESRD) 患者重要的肾脏替代疗法之一。目前大多数尿毒症患者依靠透析疗法维持生命, 尿毒症血透患者的5年生存率达75%以上。随着人们健康观念的逐步提高，终末期肾脏疾病的治疗目的不仅仅局限于维持生命和缓解症状, 而是从生理、心理和社会活动多方面改善和恢复患者的生活状态。本文采用Logistic 多元回归分析法，回顾性分析90例维持性血液透析患者生活质量及其影响因素，旨在为提高维持性血液透析患者生活质量和保持其健康身心状态提供参考依据。

1材料与方法

1.1资料来源收集维持性血液透析( maintenance hemodialysis, MHD)90 例。所有病例均记录年龄、睡眠、血红蛋白水平、肌肉骨骼疾病、婚姻情况、糖尿病和心脏疾病。

1.2测评方法采用SF-36 量表( the MOS 36-item Shor t Form Health Survey ) ，结合患者一般情况调查问卷。

1.3统计学处理采用Logistic 多元回归分析法确定影响维持性血液透析患者生活质量的独立影响因素。P

2结果

2.1维持性血液透析患者生活质量影响因素Logistic多元回归分析，按照SF-36 量表的计分规则, 分别计算量表8 个维度的得分, 并与杭州常模作比较。依据SF-36 量表的结构模型, 通过因子分析法, 将8 个维度的得分转换成生理健康总分( Physical Component Summary , PCS)和心理健康总分( Mental Component Summary, MCS)。

多因素Logistic 回归分析结果显示：年龄、睡眠、血红蛋白水平进入回归方程。此结果提示，年龄、睡眠、血红蛋白水平是影响维持性血液透析患者生活质量的关键因素。

表1 维持性血液透析患者生活质量影响因素Logistic多元回归分析

3讨论

1993 年世界卫生组织定义生活质量为: 不同文化和价值体系中的个体对他们生活目标、期望、标准以及所关心的事情有关的生存状况的体验, 它包含了个体的生理健康、心理状态、独立能力、社会关系、个人信仰和与周围环境的关系。生活质量通过患者对自身健康的主观感觉, 包括生理健康、精神健康和社会适应等方面的测评, 逐渐成为综合评价透析治疗效果的可靠指标。姜敏敏等[2] 通过对181 例血液透析患者的生活质量进行研究, 发现与普通人群相比, 血透患者的生活质量显著下降, 尤其在躯体功能、总体健康和社会功能等3 个维度。而且, 与生理健康相关密切维度的得分下降幅度明显高于与心理健康相关密切的维度。朱晓峰等[3] 研究证实, 重组人红细胞生成素的合理应用可以提高患者的血红蛋白水平及血液的氧合水平, 限制或逆转心血管并发症的进展, 缓解心脏及外周的缺氧状态等, 以提高患者的生活质量。

我们的研究结果提示，年龄、睡眠、血红蛋白水平、肌肉骨骼疾病、婚姻情况、糖尿病和心脏疾病均为影响维持性血液透析患者生活质量的因素。多因素Logistic 回归分析结果显示年龄、睡眠、血红蛋白水平进入回归方程，此结果提示年龄、睡眠、血红蛋白水平是影响维持性血液透析患者生活质量的关键因素。

临床医护人员应充分重视维持性血液透析患者生活质量，针对性采取相应措施改善其生活质量。患者家属也应给予患者充分的关怀和照顾，令其保持良好的生理和心理状态，并重返社会[4,5]。

参考文献

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血液的化学元素篇（9）

HP是公认的慢性活动性胃炎的致病菌，是消化性溃疡重要的致病因子，并与胃癌及胃粘膜相关的恶性淋巴瘤密切相关。通过PCR检测及细菌培养发现ROU同样有大量HP的存在，其形态学、生化特性、免疫特性与胃粘膜HP相似[2]。又通过72例ROU患者口中不同牙位，龈上、龈下菌斑进行HP-PCR检测，其中轻型43例，疱疹样23例，重型6例，HP阳性率分别为53.49%、56.52%和83.23%。结果表明HP阳性率随着溃疡程度的加重而增高，HP与ROU有着密切不可分的联系。故抗HP治疗是治疗ROU的一种有效方法。

2 EB病毒（EBV）

PCR法对13例ROU口腔损害检测中，有5例检测出EBV-DNA。为检测EBV是否同时存在于外周血中，从PCR阳性患者中取2例外周血淋巴细胞及3例浆细胞中检测到EBV-DNA，提示淋巴细胞可能EBV潜伏感染的贮留地。EBV-DNA，EB核抗原，EBV/C3d受体出现在部分基底及基底周围细胞血管内及固有层淋巴细胞核中，提示溃疡前期的上皮细胞可能通过感染EBV的淋巴细胞而受到感染[3]。

3 免疫因素[4]

此项研究对唾液中6个指标，血中细胞免疫的8个指标，体液免疫的7个指标，微量元素的5个指标，应用非条件回归分析法，进行综合研究分析。明确提出ROU众多复杂致病因素中，EXRFE、T8、血液LGA、Cu是致病的危险因素，而b淋巴细胞、血清Zn、唾液C3和体液中LYZ则是重要的保护因素。ESRFE每增加一个等级，溃疡发病危险性增加14倍，T8每增加一个等级，溃疡危险性增加3倍。

这2个高危免疫指标的出现，使免疫活性细胞亚群不平衡及免疫活性细胞功能缺陷，导致机体免疫调节紊乱而致口腔溃疡。

4 微量元素

血液中的微量元素Zn和Fe呈现保护效应，而Cu为危险因素，Cu/Zn比值表现明显的危险效应，提示缺Zn，高Cu是口腔溃疡发病的重要因素，同时为ROU的治疗找到了依据[4]。

5 血液流变学

检测血液流变学指标，结果发现血浆粘度、全血高切还原粘度、红细胞刚性指标及红细胞聚集指数和ROU有密切关系。血液流变学的这些指标改变引起全血血浆粘度升高，血流速度减慢，有利于t淋巴细胞的浸润和免疫活性物质如粘附分子、免疫球蛋白及细胞因子的浸出，使它们能够介导与口腔黏膜发生特异性的免疫反应，引起一系列自身免疫反应，最终导致口腔溃疡的发生[5]。

6 细胞遗传学

应用现代细胞遗传技术，文献报道60名ROU患者中40名有家族遗传史。对外周血淋巴细胞的SCE、微核发生率、染色体畸变进行研究，与正常对照组相比，均有极显著性差异。因此ROU患者可能先天即有DNA修复缺陷和固有的不稳定染色体结构，这与疾病的发生存在一定的因果关系[4]。

7 雌孕激素受体

应用ABC法对10例健康女性黄体期口腔黏膜作ER和PR的检测，结果7例雌激素受体阳性，8例孕激素受体阳性，证明了口腔黏膜亦是性激素的靶器官之一，正常的性激素受体数量及功能状态是口腔黏膜促使正常生理功能的重要保证，倘若性激素受体数量和功能状态发生改变，或者性激素的分泌出现异常，均可导致口腔黏膜发生病理变化。此项研究有助于阐明性激素受体改变相关的口腔黏膜病的发病机理，进而通过调节性激素受体及其性激素水平达到治疗目的[6]。

ROU为人群中的常见病、多发病，治疗后复发率较高。因此，ROU的诱发因素至关重要，通过对幽门螺杆菌、EBV、微量元素、雌孕激素受体的检测，对免疫学、血液流变学、遗传学等研究，发现了与致病相关的因素，从而为临床诊治提供了依据。因此，应用抗HP、抗病毒、抗免疫，调节性激素和血液流变学，加适量微量元素，注意遗传因素，将是治疗ROU的最佳方案。

参 考 文 献

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血液的化学元素篇（10）

中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）02（a）-0221-02

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是继阿尔茨海默病之后第二位最常见的痴呆症，是指大脑功能衰退，特别是与智能有关的功能全面衰退，致其发生的主要原因是脑血流量减少，引起脑组织生化代谢障碍[1]。葛根素（Puerarin，Pur）化学名为4，7一二羟基-8-D葡萄糖基异黄酮，近年来被广泛用于心脑血管疾病等急性期的治疗，包括心绞痛、心肌梗塞，心律失常、脑缺血等[2]。本实验从行为学、形态学角度，观察葛根素注射液对血管性痴呆小鼠皮层、海马神经元的保护作用。

1 材料和方法

1.1 血管性痴呆模型建立

成年昆明小鼠，18～22 g，雌雄不限，购自齐齐哈尔医学院动物研究中心。采用双侧颈总动脉持久性结扎法，并对该方法进行改良。用0.5%戊巴比妥钠麻醉并固定小鼠，钝性分离暴露右侧颈总动脉，结扎右侧颈总动脉，术后给予青霉素2万U/天，4d；于术后7 d进行第二次手术，同法结扎另一侧颈总动脉，腹腔注射青霉素2万U/天，4d，于二次手术后7 d采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立。

1.2 动物分组

模型建立后小鼠随机分为（1）假手术组；（2）模型组；（3）葛根素组。各组立即给予相应药物。正常组和模型组：腹腔注射生理盐水，1次/日，注射14d。葛根素组：腹腔注射葛根素注射液（1 mg/mL），0.1 mL/10 g，1次/日，注射14d。

1.3 HE染色

在末次给药后1h后取材，各组小鼠脑组织在4%多聚甲醛固定液中固定12 h后，室温梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，将组织附于用防脱剂处理过的载玻片上，60 ℃恒温烘箱烘片12 h，备用于HE染色。石蜡切片经二甲苯逐级脱蜡水化后，入苏木素染色液中10 min，盐酸酒精分化数秒后入伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。光镜下观察皮层、海马组织结构变化。

2 结果

2.1 行为学观察

本实验采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立，跳台实验结果提示，模型组小鼠存在着明显的学习记忆障碍，模型建立成功。与模型组比较，葛根素注射液组小鼠的反应时间明显缩短，潜伏期显著延长，错误次数减少，改善了血管性痴呆小鼠学习记忆能力。

2.2 HE染色

光镜下，假手术组小鼠皮层、海马神经元染色清晰，排列规则整齐，形态完整，多呈锥形、星形，核大而圆，着色较浅，位于细胞中央，偶尔可见嗜酸性核仁。模型组皮层、海马神经细胞排列紊乱，数目减少，周围有三角形或扁圆形小胶质细胞和星形胶质细胞增生，染成红色，形态异常，许多细胞出现体积缩小，核浓染，出现核溶解、固缩、破裂等。葛根素注射液治疗组与模型组相比较，海马、皮层神经元细胞形态异常、损伤的情况明显减轻。见图1。

3 结语

建立理想的VD动物模型对于探明VD的发病机制，开发防治血管性痴呆的新药有着重要意义。双侧颈总动脉永久性结扎模型是血管性痴呆研究中常用的模型之一。传统方法因同时永久性结扎双侧颈总动脉，对动物打击过大，导致动物死亡率高，标本获取困难，实验周期延长。有文献报道报道，传统2VO法动物存活率仅为12.5%，本实验对传统方法进行改良，先后分次结扎双侧颈总动脉，分次结扎，有利于脑部血流重新分配，脑部血供重新建立，机体逐渐代偿适应。同时，更接近临床上常见的脑部慢性缺血的病理过程。实际观察也发现，改良模型组小鼠术后苏醒较快，死亡率也明显减少。

葛根素注射液是由从豆科植物野葛以及甘葛藤的干燥根中提取的有效成分而制成的注射液。临床应用，发现葛根素能明显降低脑梗死患者的梗死灶面积，降低急性脑梗死患者的血流变和提高神经功能学评分，明显改善红细胞变形能力，降低血液粘滞度，改善微循环，增加脑灌注，从而改善VD患者的认知功能[3]。许多脑结构都参与学习和记忆，无论是大脑皮层的不同区，还是海马，都不是独特的学习中枢或记忆中枢，对于不同模式的学习记忆过程发挥关键作用的脑结构不同。海马在简单空间定向和分辨学习与记忆中起着重要作用；前额叶皮层在复杂精细的时间、空间因素的综合学习和记忆过程中最为重要。本研究采用HE染色方法，在光镜下观察到VD模型小鼠皮层、海马区神经数目明显减少，排列紊乱，周围有三角形或扁圆形小胶质细胞和星形胶质细胞增生，染成红色，形态异常。提示永久性脑缺血VD模型小鼠皮层、海马区锥体细胞减少，而幸存的锥体细胞结构破坏不足以代偿其病理损伤而出现功能障碍，可能是其智能障碍的机制之一。葛根素注射液组小鼠跳台试验数据以及皮层、海马区锥体细胞的形态及损伤情况均得到了一定程度的改善，提示葛根素注射液对血管性痴呆小鼠的皮层、海马神经元存在一定的保护作用，但具体保护机制尚有待进一步研究。

参考文献