摘要：[目的]预测母猪 Kiss1(GenBank Gene ID: 100145896)上游区域潜在的转录因子结合位点,并验证部分转录因子在猪卵巢颗粒细胞中对 Kiss1 基因的调控作用,为研究 Kiss1 基因在母猪卵巢颗粒细胞中的分子调控机制提供理论基础。[方法]参考 NCBI 数据库中 Kiss1 基因上游区域的序列,通过生物信息学网站预测的Kiss1 基因上游区域潜在转录因子结合的位点,结合文献阅读与资料查询,在转录因子 CEBPα和 p53 与 Kiss1 基因上游区域潜在结合位点附近设计引物,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,验证转录因子 CEBPα和 p53 与 Kiss1基因上游区域的结合情况;参照 NCBI 数据库相关转录因子 CEBPα和 p53 的 mRNA 序列,使用软件 Primer Premier5 设计引物,PCR 分别扩增转录因子 CEBPα(带有 Kpn I 和 Xho I 限制性内切酶的酶切位点)和 p53(带有 Kpn I和 Hind III 限制性内切酶的酶切位点)的 CDS 区序列,并进行测序鉴定,连接到真核表达载体 pcDNA3.1(+)上,构建含有潜在转录因子 CEBPα和 p53 CDS 区序列的真核表达载体,并获得无内毒素质粒,分别命名为pcDNA3.1-CEBPα和 pcDNA3.1-p53;化学合成目标转录因子 CEBPα和 p53 的干扰 siRNA 片段。屠宰场采集猪的卵巢,快速分离并培养原代猪的卵巢颗粒细胞,阳离子脂质体转染法分别将转录因子 CEBPα和 p53 真核表达载体(pcDNA3.1-CEBPα和 pcDNA3.1-p53)或 siRNA 片段(CEBPα-siRNA 和 p53-siRNA)转染进母猪卵巢颗粒细胞,使用实时荧光定量 PCR 和 Western Blot 技术分别验证预测的转录因子 CEBPα和 p53 对 Kiss1 基因 mRNA 水平和蛋白水平的影响。[结果]生物信息学预测结果表明,Kiss1 基因上游区域(-850 +221)存在 p53(肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53)、CCAAT 增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, CEBP)、信号传导及转录活化家族 Stat4(signal transducer and activator of transcription 4, Stat4)等转录因子的潜在结合位点,其中转录因�