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中国生物制品学 2017年第06期杂志 文档列表

含前S1、前S2和S抗原的重组乙型肝炎疫苗在小鼠中的免疫原性561-565

CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂对狂犬病疫苗免疫效果的影响566-570

白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达571-576

摘要：目的 构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法 参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体p LV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒p LV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果 重组慢病毒表达质粒p LV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×108 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论 成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。

毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性分析577-581

摘要：目的 对毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性进行分析。方法 应用疏水层析和C18反相制备,对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、质谱相对分子质量分析,并进行C-末端和N-末端测序。结果 SDS-PAGE测定为单一条带,SEC-HPLC测定为单一峰,但RP-HPLC检测结果出现2个峰;峰2相对分子质量为5 959,是正常的胰岛素前体,峰1为两种混合物,相对分子质量分别为5 716和5 816,可能是缺少了1~2个氨基酸产物;N-末端分别缺少了1个氨基酸(Phe)和2个氨基酸(Phe-Val),C-末端未发生降解。结论 利用毕赤酵母得到的人胰岛素前体存在不均一现象,为胰岛素制备提供了新思路。

人T-bet和HBV-L共表达质粒的构建及体外表达582-586

摘要：目的 构建人转录因子T-bet基因与乙肝病毒表面抗原大蛋白全长基因(hepatitis B virus surface antigen large protein,HBV-L)的共表达载体,并检测其在体外的表达。方法 利用PCR及基因重组技术,以人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的c DNA为模板,扩增获得人T-bet全长基因,以含有HBV-L的质粒pc DNA3.1-HBV-L为模板,扩增获得HBV-L基因,将上述2个基因克隆至真核表达质粒p IRES中,获得共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L。将该质粒转染293T细胞,经RT-PCR、ELISA和细胞免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。结果 限制性酶谱分析及测序证实重组质粒p IRES-T-bet-HBV-L构建成功;该质粒在体外转染293T细胞后,可表达T-bet与HBV-L两者的m RNA;细胞免疫荧光试验和ELISA检测结果证实,该质粒转染293T细胞后可表达T-bet和HBV-L蛋白。结论 成功构建了共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L,该质粒能在293T细胞中表达。

转氨酶基因的克隆及序列分析587-591

摘要：目的 克隆Lactobacillus plantarum LY-78芳香族氨基酸转氨酶基因arat,并对其基因序列进行生物信息学分析。方法 利用PCR技术克隆得到芳香族氨基酸转氨酶基因arat的完整序列,测序后运用生物信息学软件预测arat基因对应蛋白的理化性质和结构特征。结果 克隆得到了Lactobacillus plantarum LY-78的arat基因,分别命名为arat1和arat2。arat1基因全长为1 188 bp,编码395个氨基酸,蛋白相对分子质量为43 888.9,p I 5.23;arat2基因全长为1 173 bp,编码390个氨基酸,蛋白相对分子质量为43 042.6,p I 5.64;两者均为亲水、热稳定及非分泌型蛋白,具有高度保守性,均属于天冬氨酸转氨酶家族。结论 通过基因克隆技术获得了2个arat基因完整序列,为今后Lactobacillus plantarum LY-78 arat基因改造及PLA合成提供了理论支持。

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析592-595

摘要：目的 对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株g C基因进行克隆及序列分析。方法 取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增g C基因,与p MD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的g C基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-g C基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株g C蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。

云南大理某农村猪星状病毒分子流行病学调查596-599

摘要：目的 了解云南大理某农村猪群中星状病毒(astrovirus,Ast V)感染情况,为Ast V的防控提供理论依据。方法利用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nested PCR)技术,对云南大理某农村采集的42份猪粪便样品进行PAst V799 bp基因部分片段扩增、克隆,并测序;利用NCBI BLAST进行数据库比对,Mega 4.1软件进行序列同源性比较和系统进化树构建。结果 Trizol试剂提取42份猪粪便样品上清总RNA,经RT-nested PCR扩增,5份样品可见799 bp的目的基因片段,阳性率为11.90%;PAst V 799 bp片段同源性分析显示,5个毒株与PAst V-1、2、3、4和5的同源性为46.3%~87.9%,与PAst V-4的同源性最高,为75.5%~87.9%;PAst V 799 bp片段的系统进化分析显示,分离的毒株属于PAst V-4,同源性为80.0%~99.5%。结论 云南省PAst V-4流行病学调查将有利于中国Ast V的预防及治疗。

发酵处理对小米粉物化特性的影响600-606

摘要：目的 探讨自然发酵筛选的优势菌种对小米粉物化特性的影响,为分析自然发酵小米粉的品质及开发小米发酵新途径提供参考。方法 按照小米与水1∶1.2 g/ml的比例加入蒸馏水,30℃下自然发酵96 h后,从发酵液中筛选出优势菌种(乳酸菌和酵母菌),扩大培养后,分别在最适温度(乳酸菌37℃,酵母菌28℃)下培养96 h进行发酵,并制备发酵小米粉。扫描电镜观察不同发酵小米粉的颗粒特性;X-射线粉末衍射仪测定其结晶度;RVA4500型快速黏度分析仪测定其黏度;TA.XT Express质构仪测定其淀粉凝胶的质构特性;并利用DSC1型差示扫描量热仪分析其热特性。结果 3种发酵所得小米粉均有明显的淀粉颗粒,而小米原粉则无,且乳酸菌、酵母菌发酵小米淀粉的受损程度高于自然发酵;发酵未使小米淀粉的晶型改变,依然为A型,但乳酸菌、酵母菌发酵小米粉的结晶度较自然发酵增加了3.04%和1.58%;发酵96 h时,乳酸菌、酵母菌发酵的热焓值分别较自然发酵上升2.32和1.27 J/g,峰值黏度降低179和180 m Pa·s,衰减值下降102和349 m Pa·s,回生值下降229和50 m Pa·s;乳酸菌、酵母菌发酵小米粉的凝胶硬度较自然发酵分别降低34.95和28.45 g,胶着性分别下降25.75和33.203 g。结论 自然发酵中乳酸菌、酵母菌对小米粉品质起主要作用。

人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选607-612

NIRF蛋白对妊娠早期绒毛滋养细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制613-617

姜黄素对睡眠剥夺小鼠学习记忆力的影响618-622

黄芪苷对丙型肝炎病毒的抑制作用623-627

摘要：目的 研究黄芪苷对丙型肝炎病毒(HCV)的抑制作用。方法 MTT法检测不同浓度黄芪苷对Huh7.5.1细胞的抑制作用;间接免疫荧光试验检测不同浓度的黄芪苷、利巴韦林和干扰素(IFN)的抗HCV效果;Western blot法检测不同浓度黄芪苷、利巴韦林、IFN作用的Huh7.5.1细胞中HCV NS5A蛋白的表达情况。结果 不同浓度黄芪苷对Huh7.5.1细胞的抑制率不同,并呈剂量依赖性。在最佳细胞密度1×104个/孔、最适MOI为1的条件下进行试验,利巴韦林对细胞的毒性呈剂量依赖性;IFN无明显的细胞毒性,其抗病毒滴度为7×101.77 PFU/ml;黄芪苷的细胞毒性较小,其抗病毒滴度为7×103.67 PFU/ml。黄芪苷能降低NS5A蛋白的表达,且随浓度增加抑制作用越明显。结论 黄芪苷具有抗HCV的能力,其作用机制是通过抑制NS5A来实现的。

甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体的制备及其初步应用628-632

摘要：目的 制备甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。方法 用甲醛灭活的甲型副伤寒沙门菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出稳定分泌甲型副伤寒沙门菌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对克隆纯化后的阳性细胞扩大培养后,免疫BALB/c小鼠,收获腹水,间接ELISA法检测抗体效价,并进行Ig类和亚类鉴定;腹水经辛酸-硫酸铵盐析法纯化后,采用间接ELISA法、玻片凝集试验、SDSPAGE法、免疫扩散试验进行检测。将纯化后的2株单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA法的建立,并用自制配对抗体检测甲型副伤寒患者血浆、乙型副伤寒患者血浆、伤寒患者血浆和正常人血浆。结果 共筛选出2株持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H4和2A9,腹水抗体效价为1∶107和1∶106,分别为Ig G1和Ig G3亚类,轻链均为κ型。纯化后的单克隆抗体1H4、2A9效价分别为1∶107和1∶103,1H4纯度大于85%,2A9纯度小于60%。2株单克隆抗体与甲型副伤寒沙门菌50503、50973可产生凝集反应,与伤寒沙门菌50096不产生反应;1H4在稀释度为1∶8时可与甲型副伤寒沙门菌菌体特异多糖(organism specific polysaccharide,OSP)产生凝集反应,而2A9在每个稀释度与OSP均不发生反应。将1H4和2A9用于双抗体夹心ELISA检测法建立,确定1H4/HRP-2A9的组合为最佳配对,用该配对抗体检测阳性样本检出率为100%,正常人血浆样本检出率为0。结论 获得2株甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,可用于甲型副伤寒沙门菌的快速鉴定。

北京市东城区2013~2015年手足口病病原学实验室检测结果及其流行病学特征分析633-636

摘要：目的 分析北京市东城区2013~2015年手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)病原学实验室检测结果及其流行病学特征。方法 制备2013~2015年北京市东城区的HFMD疑似病例的咽拭子样本312份(包含监测样本225份及疫情样本87份),采用HFMD核酸检测试剂盒检测样本中的肠道病毒(enterovirus,EV)的型别,并采用细胞培养法对部分EV阳性样本进行病毒分离。结合实验室结果及病例的流行病学特征进行统计学分析。结果 225份HFMD监测样本中,EV阳性112份,其中EV71型阳性20份,柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus 16,CA16)阳性37份,其他EV型阳性55份。2013年发生HFMD聚集性疫情3起,均由EV71型引起;2014年发生3起,分别由EV71、CA16和其他型EV引起;2015年发生22起,6起由CA16型引起,3起由EV71型引起,4起由CA6型引起,6起由其他型EV引起,3起由非EV引起。经病毒分离获得EV71阳性菌株10株,CA16型阳性菌株20株。结论北京市东城区2013~2015年HFMD仍以EV71和CA16为主要致病原,CA6阳性率呈上升趋势。应扩展病毒分型检测项目,更好地发现本地区HFMD病原的流行和变异趋势。

长春市预防接种后4例婴儿死亡病例分析637-639

摘要：目的 分析婴儿接种疫苗后死亡原因及其与疫苗的相关性,为减少偶合症及预防接种安全提供参考。方法收集长春市2010年1月至2016年12月4例因注射疫苗后死亡的预防接种异常反应专家组诊断资料,对注射疫苗后死亡的婴儿的接种、死亡情况及尸体解剖报告进行综合分析。结果 4例死亡病例中,2例属于偶合症,诊断为间质性肺炎;2例为预防接种异常反应,由过敏性休克导致死亡。结论 偶合症是预防接种后死亡比较常见的类型,及时进行尸体解剖有利于准确判断接种后死亡病因,也有助于解决此类纠纷。

聚肌苷酸胞苷酸在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活干扰素β荧光素酶报告基因系统实验条件的优化640-644

摘要：目的 优化不同长度聚肌苷酸胞苷酸[polyinosinic acid:polycytidylic acid,poly(I∶C)]在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活Ⅰ型干扰素(IFNβ)荧光素酶报告基因系统的实验条件。方法 将质粒IFN-β-luc分别转染HEK293T及BEAS-2B细胞后,HEK293T细胞转染不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5和2.0μg/孔)的高分子量(HMW)poly(I∶C)和低分子量(LMW)poly(I∶C),检测其对HEK293T细胞中IFNβ启动子激活的影响;BEAS-2B细胞直接加入不同浓度(0.1、1.0、10.0、20.0和50.0μg/孔)及转染不同浓度(同HEK293T细胞)的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C),检测其对BEAS-2B细胞中IFNβ启动子激活的影响。结果 poly(I∶C)转染HEK293T细胞激活IFNβ启动子的最佳实验条件为:0.5μg/孔的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C)转染24 h。poly(I∶C)直接加入BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的最佳实验条件为:50μg/孔的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C)作用6 h;poly(I∶C)转染BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的最佳实验条件为:0.25μg/孔的HMW poly(I∶C)转染12 h,0.5μg/孔的LMW poly(I∶C)转染12 h。结论 成功优化了poly(I∶C)在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活IFNβ启动子的实验条件,为poly(I∶C)激活免疫反应机制的研究提供了实验依据。

AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌联合疫苗多糖含量免疫速率比浊检测方法的建立及验证645-648

摘要：目的 建立AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)联合疫苗(Men ACHib)多糖含量免疫速率比浊检测方法,并进行验证。方法 采用免疫速率比浊法测定联合疫苗中A群、C群脑膜炎球菌及Hib多糖含量,绘制不同多糖抗原含量的标准曲线,并对方法的检测低限、精密度、准确度和特异性进行验证。结果 3种不同多糖抗原浓度在2~8μg/ml之间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.98;建立的方法检测A群、C群脑膜炎球菌和Hib多糖的检测低限分别为0.847、0.043和0.507μg/ml;检测各组分多糖抗原含量的批内和批间变异系数均小于5%,平均回收率在88.30~104.40%之间;各组分特异性多糖抗体仅与各自多糖抗原反应,且各组分多糖抗原共同存在时无相互干扰。结论 成功建立了准确、特异的AC群脑膜炎球菌与Hib联合疫苗的多糖含量检测方法。