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中国生物制品学 2017年第05期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志疫苗研究

吸附无细胞百日咳-白喉-破伤风-乙型肝炎-Sabin株灭活脊髓灰质炎联合疫苗的免疫持久性449-454

摘要：目的观察不同剂量配比及制备工艺的吸附无细胞百日咳-白喉-破伤风-乙型肝炎-Sabin株灭活脊髓灰质炎联合疫苗（DTa P-Hep B-s IPV）免疫大鼠后的免疫持久性。方法以中、低剂量s IPV与铝佐剂相互配伍的不同配方设计4个DTa P-Hep B-s IPV实验组,即中剂量含铝佐剂s IPV组（A组）、中剂量不含铝佐剂s IPV组（B组）、低剂量含铝佐剂s IPV组（C组）、低剂量不含铝佐剂s IPV组（D组）,并设各组分相应的对照组和上市联合疫苗的参考组。以已完成3剂DTa P-Hep B-s IPV全程基础免疫的Wistar大鼠为研究对象,在全程基础免疫后第1、2、4、7、10、12个月釆血,检测各组大鼠血清中各组分抗体阳性率及抗体水平（GMT值）。结果基础免疫后观察全程,A组各型别脊灰病毒中和抗体阳性率持续保持在100%,B组为90%~100%,C组为80%~100%,D组为55.6%~100%。A、C组所诱导的各型别脊灰病毒中和抗体GMT均高于同等剂量不含铝佐剂的B、D组,且均达到或超过参考组;B、D组所诱导的Ⅰ型脊灰病毒中和抗体GMT均低于同等剂量的相应对照组,但Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗体GMT均能达到同等剂量相应对照组的水平。各组百白破抗体阳性率在观察全程均为100%,GMT与对照组相比总体上差异无统计学意义（P〉0.05）。全程基础免疫后第12个月,乙肝抗体阳性率B组为70%、乙肝对照组为55.6%、A组为50%、C组为42.9%、D组和上市疫苗参考组均为30%,各组Anti-HBs Ag水平两两相比差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 s IPV中剂量含铝佐剂的DTa P-Hep B-s IPV所诱导的各组分抗体水平较稳定持久,可作为未来疫苗配比的参考。

细胞工厂培养箱与普通培养箱用于生产水痘疫苗的比较455-458

摘要：目的比较细胞工厂培养箱及普通培养箱用于生产水痘疫苗的差异。方法对两种培养箱进行温度测试。比较两种培养箱内培养人胚肺成纤维MRC-5细胞的生长情况及活细胞数量,并对制备出的相应水痘疫苗原液进行无菌检查及病毒滴度测定。结果与普通培养箱比较,细胞工厂培养箱的温度更稳定;培养MRC-5细胞的贴壁范围更大,活细胞数更高,且批内及批间的均一性更好;其制备水痘疫苗原液的病毒滴度略高,批内及批间的均一性更好,且无菌检查均合格。结论应用细胞工厂培养箱制备水痘疫苗,可提高疫苗的批间均一性,降低人工劳动强度及污染风险,适用于大规模疫苗生产。

乙型脑炎减毒活疫苗对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫效果459-461

摘要：目的研究乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫反应。方法将乙型脑炎减毒活疫苗（SA14-14-2）免疫8~12月龄健康儿童,采集免疫前及免疫后28 d静脉血,分离血清,采用蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test,PRNT）分别检测血清中对不同基因型乙型脑炎病毒毒株的中和抗体,计算血清中和抗体阳转率。结果乙型脑炎减毒活疫苗免疫后对基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型乙型脑炎病毒毒株均产生了显著水平的中和抗体,血清中和抗体阳转率分别为94%、92%和94%。结论乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后,对不同基因型的乙型脑炎病毒均产生良好的免疫应答。

中国生物制品学杂志基础研究

我国鼠诺如病毒的分离培养及其基因组序列分析462-466

摘要：目的分离我国鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）（命名SH1603）,并进行基因组序列测定和分析。方法利用RAW264.7细胞分离MNV SH1603,参考国外已发表的MNV4（DQ223043）基因组序列设计引物,经重叠的反转录PCR扩增全基因组,利用生物信息学软件对全基因组序列进行分析。结果 MNV SH1603引起RAW264.7细胞病变,其基因组全长7 238个核苷酸,包括4个开放阅读框（open reading frames,ORF）,预测的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4编码蛋白大小分别为186 000、58 000、22 000和23 000,其中ORF1和ORF2之间有14个核苷酸重叠,ORF2和ORF3之间有1个核苷酸重叠,ORF4包含在ORF2中。NCBI Blast比对发现,SH1603基因组与MNV4同源性最高（94%）。衣壳蛋白区的进化分析发现,SH1603与MNV4（DQ223043）和Berlin0606（EF531291）亲缘关系最近。衣壳蛋白区氨基酸比对发现,SH1603与MNV4比较,有4个位点突变,分别为aa211S→A、aa358I→V、aa404E→L、aa534V→A。结论已分离到1株MNV,与国外报道的MNV4具有高度的进化亲源关系,为我国进一步研究MNV流行和致病机制奠定了基础。

恶性疟原虫PfEMP1蛋白N-末端片段与铜绿假单胞菌去毒外毒素的偶联构建467-471

摘要：目的将恶性疟原虫红细胞膜表面蛋白1（Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,Pf EMP1）N-末端区段（N-terminal segment,NTS）共价偶联到重组铜绿假单胞菌去毒外毒素（recombinant exoprotein A,r EPA）上,构建NTS-r EPA偶联蛋白,以提升NTS的免疫原性。方法用偶联试剂Sulfo-EMCS将马来酰亚胺基团加到r EPA上,利用NTS所携带的1个自由巯基将NTS共价连接到马来酰亚胺化的r EPA上,形成NTS-r EPA偶联蛋白,通过分子排阻层析从偶联反应产物中去除未偶联的蛋白。采用Ellman反应测定r EPA上所携带的马来酰亚胺基团数量以及NTS-r EPA偶联蛋白的偶联比,SDS-PAGE鉴定纯化的偶联蛋白。结果通过偶联试剂Sulfo-EMCS在每摩尔r EPA上加上了4.3摩尔的马来酰亚胺基团;NTS与马来酰亚胺化的r EPA反应生成了NTS-r EPA偶联蛋白,偶联比为4.1;通过分子排阻层析去除了未偶联的蛋白,得到了纯化的偶联蛋白。结论成功构建了NTS-r EPA偶联蛋白,为今后针对NTS的研究奠定了基础。

1型单纯疱疹病毒经不同途径感染小鼠建立病理模型的比较分析472-476

摘要：目的比较分析1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）经不同途径感染小鼠所建立的病理模型。方法将成年鼠分别经眼角膜、牙龈、鼻黏膜、皮下及尾静脉感染HSV-1,50μl/只,临床观察60 d,感染后第3和6天,取脑组织及脊髓,进行组织病理学观察,并检测病毒载量。将乳鼠经脑内和后肢注射感染HSV-1,10~7 CCID_（50）/（ml·g）,临床观察2周,感染后第3天,取脑及后肢肌肉组织,进行组织病理学观察,并检测病毒载量。结果鼻黏膜组成年鼠感染20 d后,面部皮肤溃烂,眼角膜组感染47 d后,眼部出现红肿、充血;除尾静脉组和牙龈组外,其他组小鼠体重均呈升高趋势;未出现死亡情况。各组成年鼠脑组织和脊髓中均出现出血及炎性细胞浸润,感染后第3天脑中病毒载量最高。1、3、7日龄乳鼠经脑及后肢注射后均出现后肢麻痹症状,经脑部注射后死亡率分别为100%、100%和91.7%,经后肢注射后死亡率分别为90.9%、78.5%和72.7%。病毒感染后第3天,各组乳鼠均出现脑出血、血管袖套及少量炎性细胞浸润,个别乳鼠脑部见针迹灶;后腿肌肉仅见少量炎性细胞浸润现象,大脑和后腿肌肉组织中的病毒滴度为3.5~4.5 1og10CCID50/100 mg。结论乳鼠对HSV-1普遍易感,且病理损伤与成年鼠相似,本研究建立的乳鼠模型可用于疫苗株或减毒株的筛选和评价,为HSV-1疫苗的研发奠定了基础。

Aurora-A高表达对食管癌细胞与细胞间黏附能力的影响477-480

摘要：目的探讨Aurora-A高表达对食管癌KYSE150细胞与细胞间黏附能力的影响。方法体外培养人食管癌KYSE150细胞,在Lipofectamine 2000介导下,分别转染高表达质粒p EGFP-C1-Aurora-A及载体p EGFP-C1,同时设空白细胞对照组（未转染）。通过Western blot法检测人食管癌KYSE150细胞中Aurora-A的表达;采用细胞缓慢聚集及细胞分离试验观察Aurora-A高表达对细胞与细胞间黏附能力的影响。结果 Aurora-A高表达组可见相对分子质量约72 000的GFP-Aurora-A融合蛋白条带,而空载体对照组及空白细胞对照组未见该蛋白条带。Aurora-A高表达组、空白细胞对照组及空载体对照组细胞团数分别为（71.0±9.4）、（25.3±0.6）和（28.5±4.0）个,N_（TC）/N_（TE）值分别为0.162±0.026、0.087±0.016和0.080±0.008,Aurora-A高表达组细胞团数及NTC/NTE值明显高于空白细胞对照组及空载体对照组（P〈0.05）。结论 Aurora-A高表达能显著降低食管癌细胞与细胞间的黏附能力,进而增加肿瘤细胞的恶性表型。

^60Co γ-射线辐照新生牛血清对细胞培养的影响481-484

摘要：目的研究新生牛血清（newborn calf serum,NBCS）经^60Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy^60Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Vero细胞的传代培养结果与未辐照前接近,生长曲线峰值略低于未辐照组,辐照前后细胞的最大增殖密度为73.38×10^4和65.33×10^4个/ml（P〉0.05）,倍增时间为24.38和25.33 h（P〉0.05）;CHOK1细胞传代培养无未辐照组致密,生长曲线较未辐照组平缓,辐照前后细胞的最大增殖密度为80.03×10^4和79.3×10^4个/ml（P〉0.05）,倍增时间为19.73和23.62 h（P〈0.05）。结论 NBCS经20 k Gy ^60Coγ-射线辐照后,对Vero细胞影响不明显,使CHO-K1细胞生长速度变慢。

中国生物制品学杂志消息

2017第五届上海国际生物发酵产品与技术装备展览会484-484

摘要：由中国生物发酵产业协会主办、上海信世展览服务有限公司承办的2017第五届上海国际生物发酵产品与技术装备展览会（BIO CHINA）,将于2017年10月25~27日在上海新国际博览中心举行。BIO CHINA已成为全球发酵行业年度盛会,业界有识之士汇聚一堂,新观点新思想荟萃一处。

中国生物制品学杂志基础研究

人A组和B组鼻病毒3C蛋白表达、纯化及酶切活性验证485-487

摘要：目的在大肠埃希菌中表达人A组和B组鼻病毒（rhinovirus,RV）3C蛋白,纯化后检测其酶切活性。方法分别将A组鼻病毒RV1B和B组鼻病毒RV6的3C蛋白编码基因克隆至原核表达载体p ET-30a中,构建重组原核表达质粒p ET-30a-1B-3C和p ET-30a-6-3C,转化至E.coli BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化。利用具有3C蛋白酶切位点的15VP1-6P蛋白,分析不同温度（4和37℃）下3C蛋白的酶切活性。结果原核表达的目的蛋白为带His标签的可溶性蛋白,RV1B-3C蛋白相对分子质量约25 000,RV6-3C蛋白相对分子质量约23 000,纯度可达约70%。RV1B-3C和RV6-3C蛋白对15VP1-6P蛋白均具有酶切作用,而且在4和37℃均有酶切活性。结论在大肠埃希菌中成功表达了具有酶切活性的A组和B组鼻病毒3C蛋白,为进一步研究鼻病毒的致病机制奠定了基础。

中国生物制品学杂志治疗性制剂

与A549细胞相关的旋毛虫抗原蛋白7TR单链抗体的筛选488-493

摘要：目的筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体。方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体p ET-32a,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson（I＋J）人源噬菌体单链抗体库,筛选并纯化阳性抗体,免疫荧光试验检测抗体与A549细胞的结合活性。结果重组表达质粒p ET-32a-7TR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的旋毛虫7TR蛋白相对分子质量约50 000。共获得2株稳定分泌抗旋毛虫7TR蛋白单链抗体的E.coli HB2151菌株,命名为4C7和8G5;8G5可与重组7TR蛋白发生特异性结合,具有良好的反应原性,也可与A549细胞发生特异性结合。结论筛选出了与A549细胞具有结合活性的抗7TR单链抗体,为后续的临床应用奠定了基础。

环巴胺对子宫内膜癌HEC-1A细胞迁移、周期及自噬的影响494-499

摘要：目的探讨环巴胺（cyclopamine,CYP）对子宫内膜癌HEC-1A细胞迁移、周期及自噬的影响。方法分别用0、5、10、20、40μmol/L CYP处理HEC-1A细胞24和/或48 h,瑞氏吉姆萨染色后观察细胞形态改变,划痕试验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞周期及自噬微管相关蛋白轻链3B（light chain 3B,LC3B）的表达,Western blot法检测LC3-B蛋白表达水平。结果随着CYP浓度的增加,HEC-1A细胞数目减少,细胞密度逐渐降低,出现空泡化、核碎裂等现象逐渐加重;HEC-1A细胞的迁移率显著下降（P〈0.05）;HEC-1A细胞处于G0/G1期的比例显著增加（P〈0.05）;表达LC3B蛋白的HEC-1A细胞百分比显著上升（P〈0.05）,且HEC-1A细胞中的LC3B蛋白表达水明显增高（P〈0.05）。结论 CYP可阻滞子宫内膜癌HEC-1A细胞周期运转,引发细胞自噬,从而抑制细胞存活及迁移。

中国生物制品学杂志消息

《中国生物制品学杂志》移动版上线了499-499

摘要：为深度推进《中国生物制品学杂志》数字化转型,使期刊的资源得到广泛传播和利用,本刊已入北京世纪超星信息技术发展有限责任公司的移动＂域出版＂平台,旨在更好地为业内同仁提供快捷的学习方式。扫描二维码,下载＂超星学习通＂,点击＂移动图书馆→期刊＂,输入＂中国生物制品学杂志＂即可浏览,敬请关注指导。

中国生物制品学杂志治疗性制剂

白藜芦醇对人腺泡横纹肌肉瘤细胞株PLA-802增殖和凋亡的影响及其分子机制500-504

摘要：目的观察白藜芦醇（Resveratrol,Res）对人腺泡横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS）细胞株PLA-802增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法体外培养PLA-802细胞,用不同浓度的Res（25、50、100、200μmol/L）作用不同时间（24、48、72 h）。MTT法检测Res对PLA-802细胞增殖活力的影响;流式细胞术检测Res对PLA-802细胞周期和凋亡的影响;采用Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3酶的活性;Western blot法检测PLA-802细胞中与凋亡密切相关的Bax、Bcl-2、Survivin和Caspase-3酶蛋白的表达水平。结果 Res可明显抑制PLA-802细胞的增殖（P〈0.05）及提高Caspase-3酶活性（P〈0.001）,且呈剂量-时间依赖性;同时可明显提高处于G0/G1及G2/M期的细胞比例（P〈0.01）,减少S期细胞比例（P〈0.001）,促进PLA-802细胞的凋亡,且可显著增加促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达水平（P〈0.05）,降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表达水平（P〈0.05）。结论 Res可通过上调Bax、Caspase-3及下调Bcl-2和Survivin蛋白的表达水平及激活Caspase-3酶活性,诱导PLA-802细胞的凋亡并抑制其增殖,为治疗RMS提供了实验依据。

中国生物制品学杂志诊断制剂

HCV基因分型试剂盒评价血清盘的构建与应用505-508

摘要：目的构建HCV基因分型试剂盒评价血清盘,对国内HCV基因分型试剂盒进行评价与应用,以评估我国HCV基因分型试剂盒的质量。方法收集全国不同省份、不同人群疑似HCV的样本,首先对样本进行筛查试验和病毒载量检测,选取样本的病毒载量大于1 000 IU/ml,再用测序法确定样本的HCV基因型,对确定基因型的样本进行分析,每个基因亚型选择2支,再加上2支病毒载量为阴性的样本,构建成1套HCV基因型试剂盒评价盘,分装并评价其稳定性,并利用评价盘对HCV基因分型试剂盒进行质量评估。结果 HCV NS5B区、CORE区测序基因型结果与血清盘参考预期结果的准确性均为100%（7/7）;828份样本中共检测出7种基因亚型,分别为1a、1b、2a、3a、3b、6a、6n,未检测到其他罕见型别（4型、5型）,综合考虑各方面因素,每个基因亚型选择2支样本再加上2支HCV阴性样本共16支样本,组成HCV基因型试剂盒评价盘;经反复冻融3次后检测基因型,其稳定性无影响;利用构建的HCV基因型评价盘对分型试剂盒进行评价,其基因型检出准确性为9/14,其中试剂盒检测范围之内的5种型别有1个样本未检测（3b）,而对于检测范围之外的基因型（1a、6n）,将基因型1a均错判为1b（2/2）。结论本实验室构建的HCV基因分型评价盘充分考虑了我国HCV基因型的流行情况及国内HCV基因分型试剂盒的检测范围,能够对国内HCV基因分型试剂盒的质量进行有效评价。

中国生物制品学杂志临床研究

北京市朝阳区健康人群水痘-带状疱疹病毒抗体水平调查509-513

摘要：目的调查北京市朝阳区健康人群血清中水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）抗体水平,为带状疱疹防控策略的制定提供流行病学数据。方法采用城乡分层随机抽样的方法,于2016年5月在北京市朝阳区6个社区31~70岁健康人群中抽取320人作为调查对象,采用ELISA法检测每名调查对象血清中VZV-Ig G抗体水平,利用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。结果 320份血清样本中,VZV-Ig G抗体阳性309人,阳性率为96.56%,抗体平均浓度为（1092.48±4.73）m IU/ml。除66~70岁年龄组健康人群的VZV-Ig G抗体阳性率明显低于其他各年龄组（P〈0.05）外,其他各年龄组健康人群VZV-Ig G抗体阳性率差异均无统计学意义（P〉0.05）;各年龄组不同性别健康人群VZV-Ig G抗体阳性率差异也无统计学意义（均P〉0.05）;61~65岁年龄组健康男性人群和51~55岁年龄组健康女性人群VZV-Ig G抗体平均浓度最高,分别为（2 405.56±3.75）和（1 683.77±3.46）m IU/ml;城区和乡区健康人群VZV-Ig G抗体阳性率和抗体平均浓度差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论北京市朝阳区31~70岁健康人群血清中VZV-Ig G抗体阳性水平较高,提示北京市朝阳区健康人群带状疱疹防控形势严峻。

北京市朝阳区2011～2015年流行性腮腺炎流行病学特征分析514-518

摘要：目的了解北京市朝阳区2011~2015年流行性腮腺炎的流行现状,为做好流行性腮腺炎疫情的预防和控制工作提供科学依据。方法采用描述性研究方法,对北京市朝阳区2011~2015年流行性腮腺炎个案进行流行病学分析。结果朝阳区2011~2015年流行性腮腺炎发病率由17.07/10万降至8.44/10万;病例以春夏季多发,主要集中在5~8月,占总病例数的46.37%;发病年龄主要集中在5~9岁,发病率144.52/10万;病例中以学生和托幼儿童居多,占60.89%;15岁以下有免疫史病例从71.87%增加至95.42%;发热、头痛、双肿、单肿临床症状在有无免疫史病例间的差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 5岁以下人群仍是流行性腮腺炎防控重点人群,需进一步提高免疫覆盖率;流行性腮腺炎好发于学生和托幼儿童,可对学校或托幼等集体单位加强流行性腮腺炎监测;有免疫史的病例临床症状较无免疫史的病例相对较轻,表明接种疫苗即使不能阻止发病,但也可能对减轻流行性腮腺炎的临床症状有一定作用。

中国生物制品学杂志技术方法

两种Lowry法检测百日咳疫苗原液蛋白含量的比较519-524

摘要：目的比较《中国药典》三部（2015版）收录的两种Lowry法测定百日咳疫苗原液蛋白定量的差异,为原液蛋白准确定量和新版药典Lowry法的适用性确认提供依据。方法 9个实验室分别按照现行药典收录的两种Lowry法,对4家15批百日咳疫苗原液蛋白含量进行测定。并与凯氏定氮法检测结果进行比较。结果方法 1（未经酸沉淀Lowry法）实验室内测定结果的变异系数（CV）均值在1.7%~8.9%之间,实验室间测定结果的CV值在3.9%~9.3%之间;方法 2（酸沉淀Lowry法）实验室内测定结果的CV均值在3.6%~7.4%之间,实验室间测定结果的CV值在3.9%~18.1%之间。同一样品两种方法测定结果差异有统计学意义（P〈0.001）,结果呈相关性（R2=0.944 9）。在与部分样品测得的凯氏定氮法结果的比较中,方法 1差异有统计学意义（P〈0.001）,方法 2差异无统计学意义（P〉0.05）。结论所有样品采用同一种Lowry方法测定时所得结果实验室内和实验室间一致性较好,采用方法 2测定结果明显低于方法 1,更接近凯氏定氮法结果真实值,表明酸沉淀对Lowry法百日咳原液蛋白定量有显著影响。与Lowry方法 1相比,Lowry方法 2更能准确反映百日咳疫苗原液的真实蛋白含量,且精密度、适用性均符合要求。