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中国生物制品学 2017年第04期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志疫苗研究

不同载体蛋白对18C型肺炎多糖结合疫苗稳定性影响的比较337-341

中国生物制品学杂志消息

2017第五届上海国际生物发酵产品与技术装备展览会341-

中国生物制品学杂志疫苗研究

首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品的研制342-345

摘要：目的制备我国首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品。方法委托北京天坛生物制品股份有限公司制备1批经全面检验合格的黄热减毒活疫苗作为候选国家标准品(批号为:20111201)。由3家实验室采用空斑法对黄热减毒活疫苗病毒滴度标准品进行协作标定,以黄热病疫苗国际标准品为溯源,确定本国家标准品以LgIU/ml为标示单位的病毒滴度,并分析标准品的分装精度、稳定性、均匀性。结果制备的国家标准品分装精度为-0.68%~0.95%。3家实验室20次协作标定结果显示,标准品病毒滴度的IU赋值为5.4 LgIU/ml。37℃2周加速破坏试验病毒滴度下降0.5 LgPFU/ml;长期稳定性考察(-30℃),病毒滴度2年内下降0.5 LgPFU/ml,而第3、4年病毒滴度基本无下降。均匀性参考量值——pH的CV值为0.17%、卵清蛋白含量的CV值为4.4%,病毒滴度CV值为2.0%。结论研制的黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品符合国家标准品要求,可作为国家标准品进行发放和使用。该国家标准品批准文号为(2016)国生标字0032,其批号编码为250017-20111201。

中国生物制品学杂志基础研究

人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性346-350

摘要：目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。

呈现埃博拉病毒包膜糖蛋白抗原表位重组病毒样颗粒的构建351-356

摘要：目的构建呈现埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原表位的病毒样颗粒(viruslike particles,VLPs)。方法通过EBOV GP抗原性预测,并结合其功能结构域分析获得潜在的B细胞表位,经基因重组将该抗原表位插入至乙肝核心抗原(HBcAg)的优势表位区域,SDS-PAGE法分析重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的表达。重组菌体破碎上清经硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心纯化后,通过电镜观察VLPs形态。将VLPs与Alum佐剂按1∶1的比例混合,经背部皮下免疫小鼠。ELISA及Western blot法检测小鼠血清的特异性。结果重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的相对分子质量约19 300,纯化后蛋白浓度为1.244 mg/ml,镜下可见其以VLPs形式存在。VLPs免疫小鼠血清可与GP发生特异性免疫反应。结论成功构建了呈现EBOV GP抗原表位的VLPs,其可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。本实验为EBOV基因重组疫苗的研究及特异性抗体的制备奠定了基础。

融合蛋白FliC-Pfs25在trxB和gor基因双突变大肠埃希菌中的表达357-361

摘要：目的检测恶性疟原虫表面蛋白25(Plasmodium falciparum surface protein 25,Pfs25)与鼠伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白(phase 1 flagellin of Salmonella enterica serovar Typhimurium,FliC)的融合蛋白FliC-Pfs25,在硫氧还蛋白还原酶基因(thioredoxin reductase gene,trxB)和谷胱甘肽还原酶基因(glutathione reductase gene,gor)双突变大肠埃希菌Origami2(DE3)中的表达。方法将含有Pfs25和FliC基因的重组质粒pET28a(+)-fliC-pfs25转化Origami2(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白FliC-Pfs25,破菌上清经Ni-Sepharose纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的融合蛋白配制成不同的疫苗制剂免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠免疫血清中抗Pfs25抗体水平。结果融合蛋白FliC-Pfs25在Origami2(DE3)中以可溶性形式表达;纯化的融合蛋白可被两个抗Pfs25的单抗mAb 1A6和mAb 4D10识别;融合蛋白与铝佐剂结合在小鼠中激发出抗Pfs25的抗体应答,但Origami2(DE3)表达的FliCPfs25与抗Pfs25单抗的反应以及在小鼠中激发抗Pfs25抗体的能力,均弱于大肠埃希菌BL21(DE3)表达的FliCPfs25。结论融合蛋白FliC-Pfs25在大肠埃希菌Origami2(DE3)中成功获得表达,但trxB和gor两个基因的突变未显示出能够提高该融合蛋白在大肠埃希菌中的表达量。

登革病毒感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞CPE的比较及病毒检测362-365

摘要：目的比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测。方法将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞,同时将Vero和C6/36细胞来源的DV,分别以5 MOI感染C6/36细胞,连续观察CPE至第10天,并利用DV通用引物,RT-PCR法鉴定细胞培养上清中的病毒。结果C6/36细胞对DV最敏感并有明显的病变,细胞几乎100%聚集、破碎并呈网格状;Vero、BHK-21细胞至第5天出现脱落、破碎和悬浮等病变,对DV有一定的敏感性;THP-1细胞至第10天未出现CPE。PCR核酸检测发现,感染DV的C6/36、THP-1、BHK和Vero细胞培养上清中可检测到DV,而Vero细胞来源DV感染的C6/36细胞未检测到DV。结论 DV对不同细胞系的感染能力和感染DV后CPE的表现形式存在较大差异。

两种因素对体外聚合β淀粉样蛋白寡聚体的影响366-371

摘要：目的探讨β淀粉样蛋白（amyloid-β,Aβ）起始聚合浓度及PBS体系中添加SDS对Aβ寡聚体生成的影响。方法 Aβ40、Aβ42经六氟异丙醇（1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol,HFIP）单体化处理后,分别溶于PBS及添加0.05%SDS的PBS中,Aβ样本250、125、62.5、31.2、15.6及7.8μmol/L梯度聚合,37℃恒温,100 r/min聚合72 h后,进行SDS-PAGE分析。结果 Aβ40、Aβ42聚合的寡聚体生成量随着Aβ起始浓度的升高而增加。Aβ40在无SDS制备条件下能生成大量二聚体、三聚体及少量十二聚体;SDS制备条件下生成二聚体及少量十二聚体。无SDS制备条件250、125及62.5μmol/L浓度的Aβ42能生成三聚体及中、高相对分子质量的寡聚体弥散带;SDS制备条件250、125、62.5μmol/L浓度的Aβ42可生成三聚体及中等相对分子质量的寡聚体,31.2μmol/L浓度的Aβ42可生成低、中、高相对分子质量的寡聚体。结论适合的起始聚合浓度有利于Aβ40、Aβ42寡聚体的生成;PBS中添加0.05%SDS有利于生成稳定的Aβ42寡聚体,但不利于Aβ40寡聚体的生成。

一种siRNA药物载体薄膜的稳定性与基因沉默效应评价372-376

摘要：目的分析一种siRNA药物载体薄膜在溶液中的稳定性,并评价其基因沉默效应。方法利用层层自组装(layer-by-layer self-assembly,LBL)技术制备壳聚糖(chitosan,CHS)-透明质酸(hyaluronic acid,HA)-siRNA多层薄膜。通过UV-vis吸光度法对siRNA在薄膜上的生长过程以及在不同缓释液中的稳定性分别进行验证。结合荧光图像和流式细胞术,采用直接与细胞接触的方式检测该siRNA载体薄膜的HEK293T细胞转染效应。结果 CHS-HA-siRNA多层薄膜在260 nm处有很强的吸收峰,且随着含siRNA的组装层数的增加,在260 nm的吸光度值越大。该siRNA载体薄膜在1 mol/L NaCl溶液中释放效果最好,在pH 7.4的PBS缓冲液中次之,在纯水中稳定性最好。过低或过高的盐离子浓度对促进薄膜的崩解无优势。阳性对照组7-eGFP-siRNA和2-eGFP-siRNA具有较好的沉默绿色荧光蛋白基因的效应;在细胞培养2 d后的转染试验中,阳性对照组7-eGFP-siRNA较2-eGFP-siRNA组显示出更强的基因沉默效应。结论成功构建了一种非病毒siRNA递送载体系统,为未来实现siRNA局部给药开辟了一条可行的途径。

真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN的构建及其在HEK 293-6E细胞中的表达377-380

摘要：目的构建真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,并在HEK 293-6E细胞中进行表达。方法合成融合基因CTP-PTEN,定向克隆至真核表达载体pTT5中,构建重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,进行双酶切及测序鉴定。在Lipofectamine 2000的介导下,将鉴定正确的重组表达质粒转染至HEK 293-6E细胞,Western blot法检测细胞中融合蛋白CTP-PTEN的表达。结果经双酶切及测序鉴定,证明重组表达质粒pTT5-CTPPTEN构建正确。转染48 h后,HEK 293-6E细胞中可见相对分子质量约49 700的CTP-PTEN融合蛋白条带。结论成功构建了重组质粒pTT5-CTP-PTEN,并于HEK 293-6E细胞中表达了CTP-PTEN融合蛋白。

人骨形态发生蛋白-7在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达381-385

二十八烷醇缓解小鼠体力疲劳的作用386-389

植物激素诱导对小球藻Chlorella vulgaris细胞生物量和油脂合成积累的影响390-394

摘要：目的探讨植物激素诱导对小球藻Chlorella vulgaris细胞生物量、油脂含量及内生激素浓度的影响规律。方法分别以天然植物源脱落酸(abscisic acid,ABA)、工业合成萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)和二氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)诱导培养小球藻Chlorella vulgaris细胞,细胞干重法检测藻细胞生物量及油脂含量,气相色谱-质谱(GC-MS)分析脂肪酸组成,高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)测定内生激素浓度。结果 NAA诱导对藻细胞生长和脂质合成积累表现出显著的促进效应,其最大油脂产率为418.6 mg/(L·d),分别为2,4-D和ABA诱导藻细胞的1.48和1.83倍;NAA诱导有效调整了小球藻胞内饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸比例,使其组成和含量更易于制备高质量生物柴油;NAA作为激素合成前体参与内生激素(吲哚乙酸、茉莉酸和水杨酸)生物合成,促进内生激素水平升高,而提高浓度的内生激素可能通过一定的信号途径刺激藻细胞生长和合成脂质。结论植物类激素NAA可作为植物源激素替代物用于低成本微藻油脂生产,为制备经济可行的、高质量生物柴油提供了新的途径。

中国生物制品学杂志治疗性制剂

皮下植入医用几丁糖对大鼠免疫系统的影响395-402

中国生物制品学杂志消息

征稿402-

中国生物制品学杂志治疗性制剂

八肽胆囊收缩素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364活化蛋白-1活性和JunB表达的影响403-407

摘要：目的研究八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)活性和JunB表达的影响。方法分别采用凝胶迁移试验、Western blot法和RT-PCR法检测CCK-8对TNF-α诱导RSC-364细胞中AP-1活性、JunB蛋白表达和JunB基因mRNA水平的影响。结果 TNF-α可激活RSC-364细胞中AP-1,CCK-8对其具有抑制作用。静息的RSC-364细胞中JunB蛋白表达很少;经TNF-α处理2 h,JunB表达增加,而CCK-8对TNF-α的上述效应具有明显的促进作用;FsK(一种cAMP诱导剂)与CCK-8作用类似,对TNF-α的上述效应亦有促进作用;CR1409(CCK-A受体)、CR2945(CCK-B受体结抗剂)和H89(PKA特异性抑制剂)均可部分逆转CCK-8的上述作用。CCK-8可促进TNF-α引起JunB基因mRNA表达的增加。结论 CCK-8引起AP-1活性降低,促进TNF-α诱导JunB蛋白和基因表达增加,该作用是由CCK-A受体和CCK-B受体共同介导的,cAMP/PKA通路可能参与其信号转导途径。

中国生物制品学杂志消息

《中国生物制品学杂志》移动版上线了407-

中国生物制品学杂志诊断制剂

水痘带状疱疹病毒IgG抗体检测试剂国家参考品的研制408-411

摘要：目的制备水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)IgG抗体检测试剂的国家参考品。方法利用国内外5个厂家ELISA试剂和膜抗原免疫荧光抗体检测(fluorescent-antibody-to-membrane-antibody,FAMA)试验,对候选样本进行筛选,确定水痘检测试剂国家参考盘;利用VZV WHO免疫球蛋白标准品对检测限参考品进行标定,通过不同厂家的协作标定最终确定国家参考品的质量标准,并对其稳定性和均匀性进行考察。结果参考品由8支阴性参考品、10支阳性参考品、1份重复性参考品和6支检测限参考品组成。质量标准为:阴性参考品符合率至少为7/8;阳性参考品符合率至少为9/10;检测限的浓度不高于127 mIU/ml;重复检测重复性参考品10次,其A值的变异系数不高于15.0%。该参考盘存放于不同条件下,相对稳定且均一性较好。结论成功建立了1套用于评价VZV IgG抗体检测试剂盒国家参考品。