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中国生物制品学 2016年第06期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志疫苗研究

两种H7N9流感病毒裂解疫苗的稳定性561-564

摘要：目的分析有佐剂和无佐剂H7N9流感病毒裂解疫苗的稳定性,为确定这两种疫苗的有效期提供数据支持。方法采用WHO推荐的来自NIBSC的H7N9病毒株,按照流感疫苗生产工艺,制备含佐剂和无佐剂H7N9流感病毒裂解疫苗各3批,按照企业注册标准进行成品检定,合格后,分别于2～8℃和37℃条件下放置不同时间,进行稳定性试验。结果两种H7N9流感疫苗于2～8℃保存18个月,血凝素（hemagglutinin,HA）含量下降缓慢,其中无佐剂H7N9流感病毒裂解疫苗组HA含量下降均值为12.58%,含佐剂组HA含量下降均值为9.55%;两种H7N9流感疫苗于37℃保存21 d,HA含量均有下降,其中无佐剂H7N9流感病毒裂解疫苗组HA含量下降均值为13.69%,含佐剂组HA含量下降均值为8.64%;两种H7N9疫苗成品检测均符合企业注册标准。结论两种H7N9流感病毒裂解疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部（2010版）流感疫苗检定质量标准,HA含量下降幅度低于企业注册标准,疫苗稳定性良好。

鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株冻存条件的优化及冻存菌株的遗传稳定性565-570

摘要：目的优化鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株冻存条件,并检测冻存菌株的遗传稳定性。方法采用平板活菌计数方法检测添加不同保护剂（5%蔗糖水溶液、5%蔗糖脱脂乳液、5%蔗糖脱脂奶粉液、1.5%明胶水溶液）,并于不同温度（常温、4℃、-20℃）及不同保存时间（常温冻存0、15和30 d,4及-20℃冻存0、30、60、90、120、210和540 d）条件下冻存的减毒疫苗候选株S06004Δspi C的活菌数,确定最佳冻存条件。检测经体内、外传代5、10、15、20代及原代减毒疫苗候选株S06004Δspi C的生化特性,并对经体内、外传代20代及原代减毒疫苗候选株S06004Δspi C进行PCR及测序鉴定。结果最佳冻存条件为：添加5%蔗糖脱脂奶粉溶液,于-20℃下冻存,保存时间至少可达1.5年。经体内、外传代后,减毒疫苗候选株S06004Δspi C的生化特性与原代一致,其目的基因序列均未发生变化。结论成功优化了鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株的冻存条件,该候选株具有良好的稳定性,为后期研究其安全性及免疫学特性奠定了基础。

中国生物制品学杂志基础研究

小鼠Fancd2os基因真核表达质粒的构建及其对人胚肾上皮细胞增殖和凋亡的影响571-575

摘要：目的构建小鼠Fancd2os基因的真核表达质粒,并分析Fancd2os基因对人胚肾上皮细胞（HEK293T）增殖和凋亡的影响。方法以小鼠睾丸组织DNA为模板扩增Fancd2os基因c DNA全长片段,并克隆至真核表达载体p3×FLAG-CMV-14,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os。经Lipofectamine TM 2000将重组真核表达质粒瞬时转染HEK293T细胞,分别采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中Fancd2os基因m RNA转录及蛋白表达情况;经CCK8法和流式细胞术分别检测过表达Fancd2os对HEK293T细胞增殖能力及紫外线诱导HEK293T细胞凋亡的影响。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os构建正确;转染p3×Flag-CMV-14-Fancd2os的HEK293T细胞可见Fancd2os基因m RNA转录及其蛋白表达;过表达Fancd2os的HEK293T细胞的增殖活性显著下降（P〈0.05）;过表达Fancd2os可显著促进紫外线诱导的HEK293T细胞凋亡（P〈0.01）。结论成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-Fancd2os,过表达Fancd2os可抑制HEK293T细胞的增殖,促进其凋亡。

小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备576-581

摘要：目的对小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）弱毒疫苗株血凝素蛋白（H）主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其主要抗原表位区域（去掉信号肽及跨膜区）;将扩增产物克隆至表达载体p ET-30a（＋）后,转化E.coli Transetta（DE3）,经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定;将纯化的H蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫昆明鼠,3次免疫2周后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光试验进行鉴定。结果质粒p ET-30a（＋）-H经双酶切鉴定证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约60 000,能同时被抗His标签抗体和PPRV阳性绵羊血清识别,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的48%,纯度可达90%以上;制备的多克隆抗体能够识别PPRV全病毒抗原以及杆状病毒表达的重组PPRV H蛋白。结论成功构建了质粒p ET-30a（＋）-H,并表达了PPRV H蛋白,制备的鼠源多克隆抗体为建立针对PPRV H蛋白的ELISA抗体检测方法及研制新型亚单位疫苗奠定了基础。

不同储存条件对结核亚单位疫苗参考品免疫原性的影响582-587

摘要：目的评价不同储存条件对结核亚单位疫苗参考品（简称参考品）免疫原性的影响。方法按以下抗原与佐剂比例配制1人份疫苗参考品：[10μg Ag85b蛋白＋10μg EC蛋白＋50μg Ploy IC＋0.2 mg Al（OH）3]/0.2 ml。将疫苗参考品于-70及4℃分别保存1、6、9、12个月,并于每个时间点免疫BALB/c小鼠,实验分4组：PBS组、冷藏组（4℃保存参考品）、冻存组（-70℃保存参考品）及现配组,均经小鼠后肢内侧肌肉注射,0.2 ml/只,共免疫3次,每次间隔10 d,末次注射10 d后,收集小鼠脾淋巴细胞,并经眼球采血,分离血清。ELISPOT法检测抗原特异性的IL-2、IFNγ水平,CCK-8法检测细胞增殖水平,间接ELISA法检测血清Ig G抗体效价。结果经Ag85b和EC刺激,现配组各月间的斑点形成细胞数（spot forming cells,SFCs）及脾细胞增殖指数（stimulating indox,SI）差异无统计学意义（P〉0.05）,且均显著高于PBS组（P〈0.05）,表明免疫学检验模型成立且稳定,各试验组与现配组结果具有可比性。经4℃冷藏12个月,参考品的Ag85b及EC特异性IL-2、IFNγ相对水平及脾淋巴细胞相对增殖水平均显著低于冷藏1个月的参考品（P〈0.01）,经-70℃冻存12个月,参考品的Ag85b、EC特异性IL-2、IFNγ相对水平及脾淋巴细胞相对增殖水平与冻存1个月的参考品差异无统计学意义（P〉0.05）。与现配组比较,冷藏组及冻存组Ag85b和EC特异性抗体水平相对平稳,各月间差异均无统计学意义（P〉0.05）,且两组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 -70℃冻存12个月内的参考品的细胞及体液免疫水平均未明显降低,可作为该参考品的长期保存条件。不同保存条件对疫苗免疫保护力的影响需进一步考察。

中国生物制品学杂志消息

2016第四届上海国际生物发酵产品与技术装备展览会暨国际生物制药生产工艺与技术论坛＆设备展587-587

摘要：展会介绍 BIO CHINA 2016（上海发酵展）作为亚洲规模最大、专业性最强生物发酵行业展会,由发酵行业权威单位中国生物发酵产业协会倾力打造,18 000平方米展示面积,20 000名专业观众,400家企业参加,来自20多个国家和地区参与。

中国生物制品学杂志基础研究

副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定588-591

摘要：目的构建副流感病毒5型（parainfluenza virus 5,PIV5）CC-14株核衣壳蛋白（nucleoprotein,NP）、磷蛋白（phosphoprotein,P）和聚合酶蛋白（large protein,L）基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础。方法根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pc DNA3.1＋真核表达载体（或p MD18-T）上,构建辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况。结果经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段。结论成功构建了PIV5 CC-14株pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础。

冷应激对大鼠肝脏组织中Rap1b表达的影响592-594

摘要：目的探讨冷应激对大鼠肝脏组织中Rap1b表达的影响。方法将20只Wistar大鼠随机分为常温饲养组和冷应激组,每组10只,正常饲养温度为（24.0±0.1）℃,冷应激温度为（4.0±0.1）℃。经12 h冷刺激后,采集大鼠肝脏组织,提取总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果冷应激组大鼠肝脏组织中Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白表达水平均显著高于常温饲养组（P〈0.01）。结论冷应激可显著提高大鼠肝脏组织中Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白表达水平。

C基因型牛副流感3型病毒分离株全基因组测序及分析595-599

摘要：目的对宁夏地区分离得到的1株C基因型牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）进行全基因组测序,并进行同源性及进化树分析。方法参考Gen Bank上登录的BPIV3中国分离株SD0835基因组序列设计5对引物,覆盖病毒基因组全长,提取BPIV3总RNA,以其为模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物与p MD誖18-T Vector连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,将阳性克隆进行核苷酸测序,测序结果通过分子生物学软件进行拼接,并与Gen Bank上登录的参考序列进行比较,构建系统进化树。结果成功分离得到1株BPIV3,命名为NX49,NX49株全基因组核酸序列为15 474 nt,提交至Gen Bank的序列号为KT071671。NX49与中国山东C型分离株SD0835的同源性最高,为99.3%;与中国内蒙古A型分离株NM09的同源性为82.5%;与澳大利亚B型分离株Q5592的同源性为81.4%。结论 NX49与SD0835同属一个进化分枝,但由于地域及时间上的不同,可能造成它们之间在基因水平上存在差异。

中国生物制品学杂志治疗性制剂

载阿霉素透明质酸纳米粒的制备及其抗肿瘤活性600-605

摘要：目的以组氨酸（histidine,His）修饰的透明质酸（hyaluronic acid,HA）为载体,阿霉素（doxorubicin,DOX）为模型药物,制备纳米粒DOX/His-HA,并分析其理化性质和体内外抗肿瘤活性。方法通过化学交联法将组氨酸与HA进行结合,采用超声法制备纳米粒DOX/His-HA。用DAWN HELEOSⅡ动态激光光散射仪测定His-HA纳米粒的粒径和Zeta电位,透射电镜观察其形态;紫外-可见分光光度计测定DOX/His-HA纳米粒中DOX的吸光度值,计算其包封率、载药量和DOX的体外释放度。采用MTT法检测DOX/His-HA对Hep G2细胞的生长抑制作用;摄入试验观察Hep G2细胞对DOX/His-HA的摄入情况;抑瘤试验分析DOX/His-HA的体内抗肿瘤活性。结果 His-HA纳米粒呈球形,粒径为230-480 nm,分散度良好,Zeta电位为-19.3--13.5 m V。DOX/His-HA的载药量和包封率分别达到（8.14±0.09）%和（91.37±0.69）%。在前4 h内,DOX/His-HA纳米粒均存在明显突释现象;4 h后,DOX/HisHA纳米粒逐渐表现出一定的缓释性。随着组氨酸取代度的增加,DOX/His-HA的Hep G2细胞毒性增强。组氨酸取代度越高,DOX/His-HA越易被细胞摄入。DOX/His-HA具有更强的抑瘤效果,且对正常组织无明显的毒副作用。结论制备的DOX/His-HA纳米粒是一种缓释性和肿瘤靶向性良好的给药系统。

中国生物制品学杂志诊断制剂

抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及鉴定606-609

摘要：目的制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并进行鉴定。方法以细粒棘球绦虫Ediag A864蛋白为抗原,经皮下多点免疫BALB/c小鼠,共免疫4次。末次免疫3 d后制备小鼠脾细胞,在聚乙二醇（PEG）的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株进行克隆,检测其染色体数及分泌的单克隆抗体亚型。采用体内培养法大量制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并经正辛酸-饱和硫酸铵法和Hi Trap Protein G HP亲和层析结合法纯化。结果经筛选克隆共获得4株可产生细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体的杂交瘤细胞株：2D12、3H4、4A6和6E5,细胞染色体数分别为97、101、98和96,重链亚型均为Ig G1,轻链亚型均为Kappa。2D12、3H4腹水效价为2×10^5,4A6和6E5腹水效价为1×10^5。纯化后的2D12抗体可见相对分子质量为46 000和26 000的重链和轻链条带。结论本实验获得的2D12是一株稳定的杂交瘤细胞株,且可产生高效价细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,为细粒棘球绦虫病的免疫诊断奠定了基础。

中国生物制品学杂志临床研究

国产和进口冻干水痘减毒活疫苗两针免疫程序在12岁以上中国健康人群中的安全性和免疫原性比较610-615

摘要：目的比较国产和进口冻干水痘减毒活疫苗两针免疫程序在12岁以上中国健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机（2∶1）、盲法、阳性对照设计,在广西金城江区选择930名12岁以上健康人群,按照0,（6±1）周两针免疫程序,分别接种国产和进口冻干水痘减毒活疫苗,进行为期6周的安全性观察;分别于第1、2剂免前和全程免后42 d采集静脉血,采用膜抗原荧光抗体法检测抗体水平,并计算抗体几何平均滴度（GMT）。结果 928名受试者完成安全性观察,国产疫苗组（619名）和进口疫苗组（309名）全身反应发生率分别为28.76%和33.33%,组间差异无统计学意义（P=0.172 4）,常见症状为发热;局部反应发生率分别为8.24%和16.50%,组间差异有统计学意义（P=0.000 2）,以疼痛和瘙痒为主。867名受试者完成免疫原性观察,国产疫苗组（575名）和进口疫苗组（292名）抗体阳转（4倍增长）率分别为98.78%和97.95%,国产疫苗组-进口疫苗组率差为0.84%（95%CI：-1.02%,∞）;免后抗体GMT分别为1∶148.82和1∶111.80,组间差异有统计学意义（P=0.000 2）。结论国产冻干水痘减毒活疫苗两针免疫程序的免疫原性非劣效于进口对照疫苗,同时具有更高的安全性。

新车间生产的乙型脑炎减毒活疫苗免疫原性的批间一致性及其对旧车间产品的非劣效性616-619

摘要：目的验证新车间生产的不同批次乙型脑炎减毒活疫苗免疫原性的批间一致性及其对旧生产车间产品的非劣效性。方法在安徽省合肥市及马鞍山市招募1 723名未接种过乙脑疫苗,无乙型脑炎病史的8-12月龄儿童,随机、双盲法分为4组,分别接种旧生产车间生产的1批及新车间的3批乙型脑炎减毒活疫苗。采集免疫前及免疫后28 d的静脉血,分离血清,采用50%噬斑减少中和抗体试验法检测血清中抗乙型脑炎病毒中和抗体效价,比较不同批次及不同车间生产的疫苗的血清保护率,并对其免疫原性的等效性及非劣效性进行统计学分析,同时评价其安全性。结果 4批疫苗的抗乙脑中和抗体血清保护率为90.14%-92.93%,抗乙型脑炎病毒中和抗体效价的GMT为142.40-191.07,新车间生产的3批疫苗两两比较血清保护率差异的95%可信区间的上、下限均在预设的±10%区间内,新车间生产的疫苗总血清保护率与旧车间生产的疫苗的差异区间下限不超过-10%。4批疫苗的安全性均良好。结论新车间生产的不同批次乙型脑炎减毒活疫苗免疫原性具有良好的批间一致性,且新车间生产的疫苗对旧车间生产的疫苗具有非劣效性。

白细胞介素-6基因启动子区-572位点多态性与EV71感染疾病严重程度的相关性分析620-622

摘要：目的探讨白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）基因启动子区-572位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）与儿童肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）感染疾病严重程度的相关性。方法提取87份EV71重症感染患者和57份无症状隐性感染儿童血液样本基因组DNA,进行PCR扩增及测序,检测IL-6基因启动子区-572位点多态性,利用Logistic回归分析基因型频率。结果 EV71重症感染患者IL-6基因型频率与对照组相比,差异有统计学意义（OR=2.605,95%CI：1.117～6.074,P=0.027）。IL-6多态性与EV71感染严重程度有关（OR=2.411,95%CI：1.236-4.706,P=0.010）。结论 IL-6多态性与中国儿童EV71重症感染可能具有相关性,对确定影响疾病严重程度的宿主遗传因素和增强治疗效果具有重要意义。

中国生物制品学杂志技术方法

a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法的建立及验证623-627

摘要：目的建立a型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type a,Hia）结合物游离多糖含量测定方法,并对方法进行验证。方法利用脱氧胆酸钠（Na DC）盐酸法和蒽酮硫酸法测定Hia结合物的游离多糖含量。通过检测Na DC盐酸法沉淀破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）、TT ADH衍生物（ADH derivative of TT,TTAH）及TT琥珀酰化衍生物（succinic anhydride derivative of TT,TTSA）的最大能力以及沉淀多糖降解物（depolymerized polysaccharide,de-PS）或降解多糖ADH衍生物（ADH derivative of de-PS,de-PSAH）与相应载体蛋白质混合物的最佳离子强度,并利用最佳离子强度检测混合物中多糖与蛋白质质量的最小比例,以确定Hia结合物游离多糖含量的测定条件。通过添加回收试验验证方法的准确度,多次测定结合物的游离多糖含量验证方法的精密度。结果 Na DC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量几乎无影响;Na DC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力分别为402.8、352.5和691.0μg/ml;在0.6 mol/L NaCl的离子强度下,Na DC盐酸法沉淀多糖与蛋白质混合物,当de-PS与TT或TTAH的质量比≥1∶2、dePSAH与TT的质量比≥1∶4、de-PSAH与TTSA的质量比≥1∶5时,多糖回收率均在95%以上。向结合物添加6、12、35和56μg/ml的de-PS或de-PS_（AH）时,多糖回收率均在80%-100%之间;游离多糖含量检测结果的CV值均在10%以内。结论建立的方法适用于不同结合方法制备的Hia结合物游离多糖含量的测定。

人凝血因子Ⅷ活性生物检定统计法（显色法）的建立628-631

摘要：目的依据《欧洲药典》8.0版规定的生物统计检定法原理,建立检测人凝血因子Ⅷ（FⅧ）活性的显色法。方法采用斜率比模型中随机区组设计显色法实验,进行数据统计分析及结果计算。以FⅧ国际标准品及FⅧ原液、成品为测试样品,确定其线性范围,并验证其重复性、中间精密度、专属性;用《中国药典》三部（2010版）规定的一期法和建立的方法进行比较。结果当FⅧ效价在0-17.85 IU/L范围内时,标准品和样品的线性相关系数（r）均大于0.99;重复性相对标准偏差（RSD）为2.1%;2位实验人员测定结果经t检验,差异无统计学意义（P〉0.05）;该方法置信限范围为80%-120%。两种方法检测结果差异无统计学意义（P〉0.05）。结论该方法操作简便、快速,测定结果稳定、准确,检测水平符合《欧洲药典》要求,可用于FⅧ活性检测。

重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证632-636

摘要：目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA）含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为（102.32±4.18）%、（102.77±4.94）%和（95.04±16.41）%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。

交叉引物扩增技术在肺外结核早期诊断中的价值637-640

摘要：目的探讨交叉引物扩增技术（crossing priming amplification,CPA）在结核病诊断中的临床应用价值。方法对237例初治结核病患者标本（包括结核性腹膜炎70例,泌尿生殖道结核24例,结核性胸膜炎80例,骨结核13例,淋巴结核16例,结核性脑膜炎34例,其中115例临床确诊为肺外结核）分别进行抗酸染色法、固体培养法及TBCPA法检测,以固体培养法和临床诊断结果为金标准,分析TB-CPA法检测标本中结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。结果以固体培养法和临床诊断结果为金标准,TB-CPA法以及抗酸染色法总体敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别为91.86%（79/86）、87.42%（132/151）、80.61%（79/98）、92.05%（139/151）和0.81,以及53.49%（46/86）、96.03%（145/151）、88.46%（46/52）、122.52%（185/151）和0.54。结论 TB-CPA法可快速检测肺外结核分枝杆菌,具有良好的应用前景。