肠道病毒71疫苗临床前过敏性评价
摘要：目的评价肠道病毒71（enterovirus 71,EV71）疫苗的临床前过敏性反应。方法将Hartley豚鼠随机分为EV71疫苗低剂量（320 EU/只）组、高剂量（640 EU/只）组、阴性对照组（生理盐水）和阳性对照组[牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）]。各组豚鼠均经头背部皮下注射相应药物进行致敏,隔天致敏1次,共3次,并于末次致敏后第10天,经耳缘静脉注射相应药品进行激发,测定不同给药时期各组豚鼠的体重变化,观察记录临床反应及相关症状出现和消失的时间。结果在实验期间,各组动物体重均呈增长趋势;致敏给药期间至激发给药前,各组豚鼠均未发现异常临床症状;激发后,阳性对照组豚鼠过敏症状的阳性率达100%,其中5只为极强阳性,1只为强阳性,而阴性对照组、EV71疫苗低、高剂量组均未见过敏症状。结论在拟定的临床给药剂量下,豚鼠对EV71疫苗全身过敏反应为阴性,本实验为该疫苗进行Ⅰ期临床试验提供了实验依据。CpG ODN、氢氧化铝和大肠埃希菌不耐热肠毒素无毒突变体联合佐剂对猪轮状病毒△VP8亚蛋白免疫效果的影响
摘要：目的评价Cp G ODN、氢氧化铝[Al（OH）3]和大肠埃希菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin,LT）无毒突变体联合佐剂对猪轮状病毒（porcine rotavirus,PRV）△VP8＊亚蛋白免疫效果的影响。方法将LT A亚基上63位丝氨酸突变为赖氨酸,构建LT的无毒突变体重组表达质粒p ET-30a（＋）-LTK63,于E.coli表达重组蛋白LTK63,并进行纯化。将小鼠随机分为LTK63＋Al（OH）3组、Cp G ODN＋Al（OH）3组、Cp G ODN＋LTK63＋Al（OH）3组及Al（OH）3对照组,将P2-SB-1AΔVP8＊抗原蛋白分别与各组相应佐剂共同免疫小鼠,均经颈部皮下注射,隔2周免疫1次,共3次,于每次免疫后14 d采血,分离血清,间接ELISA法检测血清抗体效价及Ig G亚型;末次免疫2周后,MTT法检测小鼠特异性淋巴细胞的增殖。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒p ET-30a（＋）-LTK63构建正确;表达和纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析,均可见相对分子质量约33 000（A亚基）和13 000（B亚基）的目的蛋白条带。二免后,Cp G ODN＋LTK63＋Al（OH）3组的抗体滴度显著高于LTK63＋Al（OH）3组、Cp G ODN＋Al（OH）3组和Al（OH）3对照组（P〈0.05）;末次免疫后2周,Cp G ODN＋Al（OH）3组抗体滴度显著高于Al（OH）3对照组、Cp G ODN＋LTK63＋Al（OH）3组和LTK63＋Al（OH）3组（P〈0.001）;Cp G ODN＋LTK63＋Al（OH）3和LTK63＋Al（OH）3组小鼠血清中Ig G2a和Ig G1水平相当,Cp G ODN＋Al（OH）3组血清抗体以Ig G2a为主,Al（OH）3对照组血清Ig G以Ig G1为主;Cp G ODN＋Al（OH）3组小鼠特异性淋巴细胞的增殖能力最强。结论 Cp G ODN＋Al（OH）3联合佐剂表现出明显的协同效应,可显著提高小鼠对PRV△VP8＊亚蛋白的体液免疫和细胞免疫应答。狂犬病病毒PV-2061株基因序列测定及其抗原性和免疫原性分析
摘要：目的测定狂犬病病毒（rabies virus,RV）PV-2061株全基因组序列,并分析其抗原性及免疫原性。方法 RTPCR法对RV PV-2061株基因组进行分段扩增,分别克隆至p MD18-T Simple Vector,转化感受态E.coli TOP10,挑取阳性克隆,进行测序。应用DNAstar Meg Align软件对测序结果进行拼接和分析;ELISA法检测PV-2061株的抗原性;用主种子批毒种制备的原疫苗免疫小属,检测PV-2061株的免疫原性。结果 RV PV-2061株的基因组全长11 932 bp,由3′端至5′端依次排列着N、P、M、G、L 5个结构基因,每个基因由3′端到5′端的非编码区及中间的编码区构成。与Gen Bank中已知全基因组序列的毒株比较,基因组前端3′先导序列和N基因的非编码区均无长度变化,从P基因开始,基因非编码区的长度开始出现差异,导致各毒株基因组长度不同。RV PV-2061株的抗原值为7.46 IU/ml;主种子批毒种制备原疫苗保护指数为1 585。结论确定RV PV-2061株全基因组序列为基因1型,且具有RV特有的抗原性和良好的免疫原性,为狂犬病疫苗的设计和毒株的筛选提供了实验依据。人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定
摘要：目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut＋型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。胰岛素样生长因子结合蛋白-3在白藜芦醇抑制脑胶质瘤C6细胞增殖中的作用
摘要：目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3（insulin like growth factor binding protein-3,IGFBP-3）在白藜芦醇（resveratrol,Res）抑制脑胶质瘤C6细胞增殖中的作用。方法将脑胶质细胞和脑胶质瘤C6细胞分为脑胶质细胞组、Res＋脑胶质细胞组、脑胶质瘤C6细胞组及Res＋脑胶质瘤C6细胞组,采用MTT和Western blot法分别检测Res对各组细胞增殖及细胞中IGFBP-3和ERK蛋白表达水平的影响。将脑胶质瘤C6细胞分为空白对照组、Res组、si RNA-IGFBP-3组和Res＋si RNA-IGFBP-3组,采用MTT法、流式细胞术、Transwell试验及Western blot法分别检测Res联合si RNA-IGFBP-3对脑胶质瘤C6细胞增殖、凋亡、侵袭能力及细胞中IGFBP-3和ERK蛋白表达水平的影响。结果各组细胞培养48 h后,Res＋脑胶质细胞组与脑胶质细胞组的细胞增殖抑制率及细胞中IGFBP-3和ERK蛋白的表达水平均无明显变化（P〉0.05）;Res＋脑胶质瘤C6细胞组与脑胶质瘤C6细胞组比较,细胞增殖抑制率和细胞中ERK蛋白的表达水平均明显降低（P〈0.05）,而IGFBP-3蛋白的表达水平明显升高（P〈0.05）。与空白对照组比较,Res组细胞增殖抑制率、凋亡率、IGFBP-3蛋白表达水平明显升高（P〈0.05）,侵袭能力、ERK蛋白表达水平明显降低（P〈0.05）;而si RNA-IGFBP-3组和Res＋si RNA-IGFBP-3组细胞增殖抑制率、凋亡率、IGFBP-3蛋白表达水平明显降低（P〈0.05）,侵袭能力、ERK蛋白表达水平明显升高（P〈0.05）。结论 Res可能是通过增强IGFBP-3的表达来抑制ERK信号通路的活性,进而发挥促进脑胶质瘤细胞凋亡的作用。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。白藜芦醇衍生物TMS对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞中一氧化氮、血管细胞间黏附分子-1及核转录因子-κB表达的影响
摘要：目的探讨白藜芦醇衍生物TMS（trans-3,5,4′-trimethoxystilbene）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）中一氧化氮（nitric oxide,NO）、血管细胞间黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）及核转录因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）表达的影响。方法取P3代HUVECs,采用CCK-8法检测不同TMS浓度（0、5、10、20、50、100μmol/L）对HUVECs细胞存活率的影响。将P6代HUVECs分为正常对照组、LPS组、TMS（高、中、低浓度）＋LPS组及PDTC＋LPS组,Griess法检测各组细胞产生NO浓度;Real-time PCR法检测各组细胞中VCAM-1、NF-κB p65基因m RNA的转录水平;Western blot法检测各组细胞中VCAM-1、NF-κB p65和IκBα蛋白的表达水平;免疫细胞化学染色法检测各组细胞中VCAM-1和NF-κB p65蛋白的表达水平。结果 5、10μmol/L浓度组TMS对细胞存活率影响较小,50、100μmol/L浓度组中细胞生存率明显下降（P〈0.05）,且呈时间、剂量依赖性。低、中、高浓度TMS＋LPS组与PDTC＋LPS组细胞中NO浓度显著下降（P〈0.05）;中浓度TMS＋LPS组和PDTC＋LPS组细胞中VCAM-1、NF-κB p65基因m RNA转录和蛋白表达水平均明显低于LPS组（P〈0.05）,IκBα蛋白表达水平明显高于LPS组（P〈0.05）;正常对照组细胞胞质中有弱VCAM-1蛋白荧光表达,未见NF-κB p65蛋白荧光表达,LPS组可见VCAM-1和NF-κB p65蛋白的强荧光表达,中浓度TMS＋LPS组和PDTC＋LPS组中VCAM-1和NF-κB p65蛋白荧光表达均弱于LPS组。结论白藜芦醇衍生物TMS可抑制LPS诱导HUVECs表达NO、VCAM-1和NF-κB p65,且其抑制VCAM-1效应可能是通过NF-κB细胞信号通路而发挥作用的,本研究为临床治疗血管内皮功能紊乱相关疾病提供了实验依据。酶联免疫双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗体试剂的质量评价
摘要：目的评价酶联免疫双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）抗体试剂的质量。方法采用3个厂家间接酶联免疫法的HCV抗体试剂各1批（A-1、A-2、A-3）和酶联免疫双抗原夹心法的HCV抗体试剂各1批（B-1、B-2、B-3）,分别检测经Ortho和Dia Sorin公司抗HCV EIA试剂、CHIRON公司RIBA HCV 3.0 SIA及MP Biomedicals Asia Pacific Pte公司确证试剂检测的304份血浆样本（抗-HCV阳性139份及抗-HCV阴性165份）;并经HCV BLOT 3.0确证试剂检测HCV假阴性样本的抗体谱。结果试剂A-1、A-2、A-3的阳性检出率分别为95.0%、97.8%、97.1%,阴性检出率分别为98.2%、92.7%、95.2%;试剂B-1、B-2、B-3的阳性检出率分别为98.6%、98.6%、99.3%,阴性检出率分别为95.8%、95.8%、96.4%,总符合率分别为96.7%∶97%、95.1∶97%、96.1%∶97.7%,不同厂家酶联免疫双抗原夹心法的HCV抗体试剂灵敏度均有提高,两种酶联免疫法的6种HCV抗体试剂检测均有不同份数的假阳性样本出现,该6种HCV抗体试剂的特异性无显著差异（P〉0.05）。HCV假阴性样本抗体谱分析结果表明,各HCV抗体试剂均有漏检现象。结论酶联免疫双抗原夹心法检测HCV抗体试剂具有较高的灵敏度和特异性,可在献血源筛查中推广应用。高效液相色谱串联三重四级杆质谱法检测重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白质原液中氨苄西林残余量
摘要：目的建立高效液相色谱串联三重四级杆质谱法检测重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA）蛋白原液中氨苄西林残余量。方法用乙腈沉淀蛋白质,离心后收集上清,采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法上样分析,色谱条件：色谱柱Zorbax SB-C18 Rapid Resolution HT,1.8 Micron2.1 mm×100 mm,流动相30%乙腈,流速0.1 ml/min;质谱检测条件：多重反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）,正离子模式,ESI电压3 500 V,碎裂电压110 V,碰撞能10,气体流速8 L/min,母离子的质荷比（mass to charge ratio,m/z）=350.1,定量子离子m/z=105.8,定性子离子m/z=159.9。对建立的方法进行系统适用性、专属性、精密度、稳定性验证,确定该方法的线性范围及最低检出限、定量限,并进行基质效应试验。结果该方法试验参数符合检测要求,对氨苄西林的检测专属性强,当氨苄西林浓度在10~100 ng/ml范围内,r2〉0.999 00,最低检出限为5 ng/ml,最低定量限为10 ng/ml。氨苄西林加标试验的回收率在98%~110%之间,重复性及日间精密度RSD均小于5.5%;冻融稳定性、样品前处理后的稳定性、短期稳定性试验中,样品回收率均在95%~120%之间;以超纯水5倍稀释的r EPA蛋白原液作为溶剂配制的3个不同浓度的氨苄西林对照品溶液的回收率均接近120%,RSD值在3%~5%之间,准确度和精密度良好。结论该方法系统适用性好,灵敏度高,专属性强,准确度和精密度好,检测时间短,是一种易于实现仪器自动化分析的方法。单抗制品中CHO细胞宿主蛋白残留双抗夹心ELISA检测方法的建立
摘要：目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检测低、中、高浓度HCP标准品及抗TNF-α单抗原液、抗VEGF单抗纯化工艺样品中的HCP。结果建立的双抗夹心ELISA法最佳抗体包被浓度为1.5μg/ml,酶标抗体浓度为1μg/ml,160 r/min,37℃孵育2.5 h;TMB 37℃孵育15 min;以630 nm为参比波长,450 nm为测定波长。该方法的线性范围为3.125~100 ng/ml,最低检测限为3.125 ng/ml;试验内变异系数（CV）和试验间CV均小于15%,回收率为85.3%~115.1%。与商品化试剂盒检测结果基本一致,可用于检测纯化工艺样品。结论已成功建立单抗制品中CHO细胞HCP残留双抗夹心ELISA检测方法,该方法可代替市售试剂盒用于CHO细胞HCP残留检测,可使检测成本降低30倍。用于ACYW 135群脑膜炎球菌多糖-CRM 197结合物分子量检测的SEC-RI-MALS联用方法的建立及验证
摘要：目的建立分子筛层析（size exclusion chromatography,SEC）-示差检测（refractive index,RI）-多角度激光光散射（multi-angle laser light scattering,MALS）联用方法检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物的分子量,并对方法进行验证。方法首先单机测定ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中各血清群多糖-CRM97结合物的dn/dc值（折射率增量）,再采用SEC-RI-MALS联用技术,以0.9%Na Cl为流动相,TSKgel G5000PWxl为色谱柱,在流速0.4 ml/min的条件下,对结合物的分子量进行测定。对方法的重复性和日间精密性进行验证,并通过对样品进行高温或冻融处理,分析SEC-RI-MALS法在监测分子量变化上的应用。结果各血清群多糖-CRM197结合物的高、中、低浓度样品平行测定3次重均分子量的相对标准偏差（RSD）均小于10%,不同浓度下测定的分子量大小无显著差异,其分子量分布曲线重合性好;连续5日检测各血清群多糖-CRM197结合物分子量的RSD值均小于10%,其分子量分布曲线重合性好。经沸水浴处理,各血清群多糖-CRM197结合物的分子量分布情况均发生了明显的变化;冻融处理对A、C群多糖-CRM197结合物的分子量无太明显的影响,W135和Y群多糖-CRM197结合物在冻融过程中出现了一定的分子聚集现象。结论建立的SEC-RI-MALS联用测定多糖-CRM197结合物分子量的方法具有良好的重复性和日间精密性,能够用于ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中结合物分子量的检测,并可对结合物在不同保存条件下的稳定性进行监测。蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化
摘要：目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量（600、700和800 ml）时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间（2、3和4 h）条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。人巨细胞病毒培养条件的优化及快速病毒滴度检测方法的建立
摘要：目的优化人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）的培养条件,并建立一种快速检测HCMV滴度的方法。方法以人胚肺二倍体细胞（MRC-5）为病毒传代和滴度测定用细胞,对病毒接种量、培养温度、保护剂种类等条件进行优化。将本实验室建立的快速微量中和试验-感染细胞核染色法用于病毒滴度检测,并与蚀斑形成法及微量细胞病变法进行比较,采用Behrens-Karher法计算病毒滴度。结果 HCMV接种MRC-5细胞后在37℃培养可出现明显病变;MOI为1.0时,病毒滴度基本达到平台;病毒收获时加入1%人血白蛋白或10%FBS保护剂可维持病毒滴度稳定。同一病毒液经蚀斑形成法检测病毒滴度为5.707 lg PFU/ml,微量细胞病变法和感染细胞核染色法检测病毒滴度分别为5.633和5.667 lg CCID50/ml,3种方法的检测结果差异无统计学意义（P〉0.05）。结论HCMV接种MRC-5的最佳培养条件为：病毒接种量1.0 MOI,在37℃培养,加入1%人血白蛋白或10%FBS作为保护剂。建立的感染细胞核染色法可用于HCMV滴度的快速测定,为抗病毒物质的开发及效果评价提供了一种新的技术手段。离子色谱法测定脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中的1,4-丁二胺含量
摘要：目的采用离子色谱法测定脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中的1,4-丁二胺含量,并对方法进行验证。方法采用Ion Pac CS17（4 mm×250 mm）分析柱,上样量25μl,以10 mmol/L甲基磺酸淋洗液进行等度洗脱,流速1.0 ml/min,电导检测器检测,Chromeleon色谱工作站记录并分析数据。对该方法进行专属性、线性、准确性、重复性验证,并确定该方法的最低检出限和最小定量限。结果该方法检测1,4-丁二胺专属性较强;在40μg/L~1 mg/L范围内,1,4-丁二胺浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系,r2均大于0.999;向A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物原液中分别添加低、中、高浓度的1,4-丁二胺,重复测定5次的回收率在97.23%~104.94%之间,重复测定10次的相对标准偏差（RSD）在0.8%~1.8%之间;该方法的最低检出限为5μg/L（信噪比3∶1）,最小定量限为40μg/L（信噪比10∶1）。结论离子色谱法简便、快速,灵敏度高,可用于检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中1,4-丁二胺的含量。紫外诱变季也蒙毕赤酵母原生质体筛选木糖醇高产菌株
摘要：目的通过对季也蒙毕赤酵母原生质体进行紫外诱变,筛选遗传性稳定的木糖醇高产菌株。方法制备季也蒙毕赤酵母DQ11的原生质体,计算原生质体生成率及再生率,并对制备过程中的酶浓度（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）、酶解温度（26、28、30、32和34℃）及酶解时间（1、2、3、4和5 h）进行优化。对采用最佳酶解条件制备的原生质体进行紫外诱变,分别检测诱变30、60、90、120和150 s时原生质体的致死率,经重复筛选,采用高效液相色谱法测定菌株发酵液的木糖醇含量,并检测筛选出的木糖醇高产菌株的遗传稳定性。结果最佳酶解条件为：酶浓度1.5%,酶解温度30℃,酶解时间3 h,该条件下制备的原生质体经紫外诱变90 s（最佳诱变时间）后,获得1株高产木糖醇诱变菌株YZ-57,其发酵液的木糖醇含量为9.78 g/L,比出发菌株DQ11提高了186%,且具有良好的遗传稳定性。结论季也蒙毕赤酵母原生质体经紫外诱变,成功获得一株季也蒙毕赤酵母木糖醇高产菌株YZ-57,且具有良好的遗传稳定性。低氧应激在细胞和分子水平的研究进展
摘要：应激是机体受到体内外非特异性有害因子的刺激表现出的机能障碍和防御反应。应激反应是生命体为了生存和发展所必需的机体防护机制的重要组成部分,当机体处于低氧状态下时,细胞作为机体的基本结构单元,会首先产生应激反应,而这种反应会因为细胞类型以及应激原刺激强度和时间的不同而不同。本文主要从细胞和分子水平阐述了低氧对细胞活力、增殖、凋亡以及某些基因表达调控的影响。溶血栓药物的发展概况
摘要：近年来,对溶血栓药物的研究取得了较大进展。本文对包括尿激酶（urokinase,UK）、链激酶（streptokinase,SK）、组织型纤溶酶原激活剂（tissue type plasminogen activator,t PA）、葡激酶（straphylokinase,Sa K）、纳豆激酶（nattokinase,NK）、重组型纤溶酶原激活物在内的历代溶血栓药物的发展历程、基本性质、优缺点、溶血栓机制及发展方向作一综述。抗体分子内不配对半胱氨酸的研究进展
摘要：Ig G抗体分子由两条重链和两条轻链通过链间二硫键共价交联,重链和轻链的每个结构域各含有1对链内二硫键。但在极少数天然免疫球蛋白或重组抗体分子中,存在不与其他半胱氨酸形成二硫键的非典型半胱氨酸。本文对Ig G分子内的不配对半胱氨酸对细胞表达和稳定性的影响、其半胱氨酸化修饰的鉴别以及修饰的去除手段等作一综述。
