以白喉毒素无毒变异体蛋白CRM197和破伤风类毒素为载体的Y群脑膜炎球菌多糖结合物对小鼠的免疫原性
摘要：目的探讨以天然白喉毒素无毒变异体蛋白CRMl97和破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）为载体的Y群脑膜炎球菌多糖（group Y meningococcal polysaccharide，MenYPS）结合蛋白对小鼠的免疫原性。方法将MenYPS用1，6.己二酰肼（1，6-adipic acid dihydrazide，ADH）进行衍生，制备Men Yps-ADH衍生物，将Men YPS-ADH衍生物在碳二亚胺[N-（3-DimethyIaminopropyl）-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDAC]的作用下，分别与CRM197和TT共价结合，制备3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物，采用琼脂双扩散法检测结合物中多糖抗原的血清型特异性。经BALB／c小鼠大腿内侧皮下注射制备的衍生物及结合物，2.5μg／只，0、14、28d各免疫1次，分别于第7、21和35天经小鼠眼眶采血，分离血清，ELISA法检测小鼠血清GMT。参考《中国生物制品规程》（2000版）进行无菌试验及异常毒性试验。结果制备的3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物可与MenYPS诊断血清产生沉淀线。MenYPS-TT和MenYPS-CRM197免疫小鼠3次后，均产生较高的滴度，MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2、3次免疫小鼠后产生的GMT均明显高于MenYPS-ADH衍生物，差异有统计学意义（P均〈0.05），而两种结合物GMT差异无统计学意义（P均〉0.05）；MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2次免疫后产生的GMT均明显高于第1次免疫后，第3次免疫后明显高于第2次免疫后，差异均有统计学意义（P均〈0.01）。无菌试验符合《中国生物制品规程》（2000版）相关要求；异常毒性试验中，豚鼠和小鼠观察7d后，均无异常反应，体重增加，无死亡。结论MenYPS与CRM197和TT的结合物均能诱导BALB／C小鼠产生较高的抗体水平，且产生了免疫记忆。非限制性核酸内切酶对狂犬病疫苗中Vero细胞DNA的去除作用
摘要：目的 评价非限制性核酸内切酶对狂犬病疫苗中Vero细胞DNA的去除效果。方法将不同终浓度的Benzonase非限制性核酸内切酶加入狂犬病病毒收获液中，在PBS或Tris两种缓冲体系下，以不同温度酶解不同时间，经分子筛层析纯化后，采用罗氏Ⅱ型高效地高辛DNA标记和检测试剂盒检测狂犬病病毒收获液中DNA的残留量，用确定的酶处理条件，采用酶检测试剂盒检测狂犬病病毒收获液中非限制性核酸内切酶的残留量，采用ELASA法检测抗原含量。结果非限制性核酸内切酶的处理浓度为50～90U／ml，缓冲体系为PBS或Tris，经37℃处理2～3h，转入18-26℃处理12～18h酶解，再经分子筛层析纯化后，狂犬病病毒收获液中的Vero细胞DNA去除率在80％以上，病毒抗原回收率在75％以上；用确定的酶处理条件处理狂犬病病毒收获液，可使狂犬病病毒与Benzonase非限制性核酸内切酶完全分离。结论采用非限制性核酸内切酶可有效去除狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA。利用翻译延伸因子1-α启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒16 L1蛋白
摘要：目的 利用翻译延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α，TEF1-α）启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒（humanp apilloma virus，HPV）16 L1蛋白。方法从毕赤酵母GS115中扩增组成型TEF1-α启动子（P_TEF1-α）基因，通过基因重组替换商业化表达质粒pPink-HC和pPink-LC的启动子P_AOX1在P_TEF1-α下游分别克隆绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因和HPV 16 L1基因，构建重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1；将重组质粒电转化感受态毕赤酵母PichiaPink strain 1，培养不同时间后，荧光显微镜下观察GFP的表达；分别在YPD、YPG、YPM、YPSor培养基中培养pTEF-16 L1转化菌，检测菌体在不同培养基中的增殖情况；Western blot检测HPV 16 L1蛋白的表达水平。结果重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1经双酶切鉴定和序列分析表明构建正确；荧光显微镜检测显示，在不同培养时间P_TEF1-α指导了GFP的成功表达，且表达量随培养时间的延长而降低；重组毕赤酵母在YPD和YPG培养基中生长迅速；4种培养基中均有HPV16L1蛋白的特异性表达，且在YPG和YPSor培养基中获得了HPV 16 L1蛋白较持续的表达。结论成功实现了组成型启动子P_TEF1-α控制的HPV16 L1蛋白的表达，为HPV疫苗的低成本及方便生产提供了一个可供选择的有效方案。混菌共培养发酵产物对胃腺癌SGC-7901细胞的体外抑制作用
摘要：目的 探讨巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）和蜡样芽胞杆菌（BaciUus cereus）分别与金针菇（Flammulina velutiper）共培养发酵产物对胃腺癌SGC-7901细胞的体外抑制作用。方法 将金针菇接种于固体发酵培养基（啤酒糟、甘蔗渣和梨渣的比例为5：4：1）中培养5d，再分别接种巨大芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌发酵培养5d，提取发酵产物，MTT法检测发酵产物对SGC.7901细胞的体外抑制作用。结果巨大芽胞杆菌和金针菇共发酵产物经121℃处理后，对SGC-7901细胞的抑制率为77.75％；蜡样芽胞杆菌与金针菇的发酵产物经121℃处理后，对SGC-7901细胞的抑制率为78.88％，分别比巨大芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌单独培养的固体发酵产物经121℃处理后的抑制率提高了11.45倍和13.04倍，比金针菇单独培养的固体发酵产物经121℃处理后对SGC-7901细胞的抑制率（52.02％）分别提高了49.46％和51.63％。结论巨大芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌分别与金针菇共培养的发酵产物对胃腺癌SGC-7901细胞具有较高的抑制作用，为抗肿瘤药物的筛选及指导临床应用开辟了更广阔的前景。甲型副伤寒沙门菌噬菌体的分离及其生物学特性的分析
摘要：目的分离甲型副伤寒沙门菌（副甲菌）噬菌体（副甲噬菌体），并分析其生物学特性。方法从昆明某医院污水中分离副甲噬菌体，并采用噬斑形成法检测其滴度；透射电镜下观察浓缩纯化后的副甲噬菌体形态；分析副甲噬菌体对不同pH（1～12）和不同温度（40、50、60、70、80℃）作用的敏感性；培养副甲菌和副甲噬菌体，以不同培养时间为横坐标，对应的噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，并测定爆发量、最佳MOI及副甲菌突变率；提取副甲噬菌体基因组，酶切分析副甲噬菌体核酸，SDS-PAGE分析副甲噬菌体外壳蛋白；采用热酚法提取脂多糖（1ipopolysac-chafide，LPS），采用苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfnnvl fluoride，PMSF）法提取外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），初步分析副甲噬菌体的受体。结果在医院的污水中分离出的副甲噬菌体，经双层平板计数可见大小不一、透明的噬斑，滴度在109.10mPFU之间，透射电镜观察可见长尾和一个头部；副甲噬菌体在pH值3～10之间滴度较高，40℃以上，随温度上升滴度明显降低，在80℃几乎无活性副甲噬菌体存在；副甲噬菌体感染潜伏期为20min，爆发期为50min，爆发量129，最佳MOI为0.2，副甲菌突变率为5.8×10^-7～2.2×10^-6；副甲噬菌体基因组的单酶切产物均可见33bp的特异条带，SDS-PAGE分析可见4条主带；LPS、OMP能与副甲噬菌体结合，是副甲噬菌体的受体。结论副甲噬菌体为长尾噬菌体，基因组为dsDNA，大小为33bp，最佳MOI为0.2，受体位点为LPS和OMP。两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响
摘要：目的探讨两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将两种佐剂均按低（100μg）、中（500μg）、高（1mg）3个剂量，分别与18EUHAV抗原混合，免疫ICR小鼠，并设生理盐水对照组（生理盐水200μl）、HAV抗原对照组（HAV抗原18EU）和铝佐剂对照组（HAV抗原18EU＋铝佐剂300μg），共9组，均经腹部皮下多点注射，共免疫1次。分别于免疫后第4、8、12、16周采血，分离血清，采用ELISA法检测抗-HAVIgG抗体水平。免疫后第16周处死小鼠，分别取甘草酸二铵和苦参素最佳剂量组及生理盐水对照组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织，进行病理观察。结果免疫后第4、8、12、16周，除生理盐水对照组外，其他各组小鼠血清中均可检测到抗-HAVIgG抗体，且抗体水平除甘草酸二铵中剂量组和苦参素低剂量组外，均在第8周达峰值；甘草酸二铵各剂量组小鼠的血清抗体水平均明显高于HAV抗原对照组（P〈0.05），其中甘草酸二铵低剂量组的抗体水平最高，且在第8周时超过铝佐剂对照组；苦参素各剂量组小鼠免疫后各周血清抗-HAVIgG抗体水平均显著高于HAV抗原对照组（P〈0.05），其中苦参素低剂量组抗体水平最高，其抗体水平在第12周达峰值。实验期间，各组小鼠均未出现异常表现，各组织均未发现病理改变。结论甘草酸二铵和苦参素均能明显增强HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的水平，具有成为新型疫苗佐剂的研发价值。吉林省汉坦病毒宿主动物携带病毒的遗传进化分析
摘要：目的对吉林省汉坦病毒（Hantavirus，Hv）宿主动物携带病毒进行遗传进化分析。方法采集吉林省不同地区鼠肺样品，应用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）鉴定出HV感染的阳性样本，利用Trizol试剂提取病毒RNA，RT-PCR法扩增阳性样本中M和S片段基因，并进行测序，应用DNASTAR软件对M和S片段基因的核苷酸同源性进行分析，并与汉城病毒（Seoulvirus，SEOV）参考株进行比较；利用MegAligh软件进行蛋白序列中氨基酸差异性分析；利用MEGA5.0软件进行系统发生分析。结果共捕获719只啮齿动物，其中褐家鼠（R.norvegicus）555只，黑线姬鼠（A.agrarius）74只，小家鼠（胍m12sclzllzs）90只，HV抗原阳性率为1.39％（10／719）；10份阳性样本中，7份来自褐家鼠，2份来自小家鼠，1份来自黑线姬鼠。用全长s引物扩增得到的10株病毒全长s基因片段，经同源性分析比较发现，各序列间的核苷酸同源性在92.8％～95.1％之间，与其他SEOV核苷酸同源性在90.2％～94.7％之间；用M引物扩增得到的部分基因片段，经同源性分析比较发现，各序列间的核苷酸同源性在96.5％～99.5％之间，而与其他SEOV核苷酸同源性在91.5％～97.7％之间；10株病毒全部属于SEOV。黑线姬鼠G蛋白365～769位点问有5个氨基酸差异位点（V494L、C546S、Y626C、M630L和V637I），小家鼠G蛋白365～769位点问主要有5个氨基酸差异位点（C378G／R、F420L、Q436P／R、E535G／A和C589G／W），但同种间在378、436、535和589位点也有差异；黑线姬鼠N蛋白1～430位点间存在P298L变异；小家鼠N蛋白变异位点较多，主要在M24K／N、A37D、1140M、M173K、D192E、L219V、P229A、D237E、H265Y、V284L、T333S、A389G和V425E变异。分离得到的10株病毒根据不同的来源地可分为两个不同的进化分支。结论研究表明吉林省宿主动物携带的HV仍以SEOV为主，其遗传进化呈现多甲磺酸去铁胺佐剂对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响
摘要：目的探讨甲磺酸去铁胺（deferoxamine，DFO）佐剂对甲型肝炎病毒（hepatitis A virus antigen，HAV）抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将不同剂量的DFO（0.6、1、4、8mg）佐剂分别与HAV抗原18EU混合，免疫ICR小鼠，并设生理盐水对照组（生理盐水200 μl）、HAV抗原对照组（HAV 18 EU）、铝佐剂对照组（铝佐剂300μg＋HAY抗原18EU）和复合佐剂组（HAY抗原18EU＋DFO1mg＋铝佐剂150 μg），均经腹部皮下多点注射，0.2ml／只，共免疫1次。分别于免疫后第4、8、12、16周，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV IgG水平，并进行安全性试验。结果除生理盐水对照组外，其他各组小鼠血清在各时间点均能检测到抗.HAVIgG；除DFO 0.6mg组外，抗体滴度均在第8周达峰值；不同剂量DFO组的抗体水平均明显高于HAV抗原对照组，其中DFO4mg和8mg组在8～16周时抗体水平显著高于HAV抗原对照组，且差异有统计学意义（P〈0.05），但与铝佐剂对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；在8～16周时，同一时间DFO4mg、DFO8mg和复合佐剂组的抗体水平较高，并能维持较长时间，至第16周时仍能达到与铝佐剂对照组相当的水平。结论DFO佐剂能显著增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答，有望开发为一种可替代铝佐剂的新型佐剂。旋毛虫与肝癌细胞相关基因CK-1的原核表达及鉴定
摘要：目的原核表达旋毛虫与肝癌细胞相关基因CK-1，并进行鉴定。方法以旋毛虫cDNA为模板，PCR扩增CK-1基因，克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中，构建重组表达质粒pET-28a-CK-1，转化感受态大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3），IPTG分别诱导表达3、4、5h，表达产物进行12％SDS-PAGE分析。以纯化的旋毛虫肌幼虫免疫小鼠制备鼠抗旋毛虫肌幼虫阳性血清，以H7402细胞免疫小鼠制备鼠抗H7402全细胞蛋白阳性血清，以重组CK-1蛋白免疫小鼠制备鼠抗CK-1蛋白阳性血清，分别以其作为一抗，进行Westernblot鉴定。结果重组表达质粒pET-28a（＋）-CK-1经双酶切及测序鉴定证明构建正确；IPTG最佳诱导时间为4h，表达的重组CK-1蛋白以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的37.5％；重组CK-1蛋白可被鼠抗旋毛虫肌幼虫阳性血清和鼠抗H7402全细胞蛋白阳性血清识别，鼠抗CK.1蛋白阳性血清可识别旋毛虫肌幼虫蛋白和H7402全细胞蛋白，在相对分子质量38500处均可见特异性条带，表明重组CK.1蛋白是一个交叉抗原，且具有良好的反应原性。结论原核表达了旋毛虫CK-1基因，为进一步研究旋毛虫的抗肿瘤效应奠定了基础。3种免疫调节性寡聚脱氧核苷酸佐剂体外免疫活性的比较
摘要：目的 比较用于乙型肝炎疫苗的3种寡聚脱氧核苷酸（CpG-oligodeoxynueleotide，CpG ODN）佐剂体外的免疫活性。方法分别将CpG ODN 684（沃森公司）、CpG ODN 1018（Dynavax公司）和CpG ODN 7909（Coley公司）序列体外刺激免疫人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和人树突状细胞系GEN，采用氚-胸腺嘧啶核苷（^3H-TdR）渗入法检测人PBMC增殖活力，ELISA法检测GEN细胞中IL-6和IFNα水平。结果 CpG ODN 7909、CpG ODN 1018和CpG ODN 684诱导人PBMC的增殖水平明显高于未刺激的对照组，差异有统计学意义（P〈0.0001），其中CpG ODN 684和CpG ODN 7909序列诱导人PBMC的增殖水平相似，略高于CpG ODN 1018序列；3种CpG ODN在体外对免疫细胞均具有明显的活化作用，其中CpG ODN 684和CpG ODN 7909序列体外活化免疫细胞产生的IL-6和IFNa水平相似，但高于CpG ODN 1018序列。结论沃森公司CpG ODN 684序列体外活化免疫细胞功能与Coley公司CpGODN7909序列相似，略优于Dynavax公司CpG ODN 1018序列。人源细胞色素P450 2E1与细胞色素P450氧化还原酶的共表达
摘要：目的 利用大肠埃希菌（Ecoli）表达系统异源表达细胞色素P450 2E1（cvtochrome P450 2E1，CYP2E1），并与细胞色素P450氧化还原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）实现共表达，使其具有代谢活性，为药物代谢的研究提供单一性的酶源。方法以人肝组织RNA为模板，RT-PCR扩增CYP2E1基因，插入pCW空载体，构建重组表达质粒pCW-2E1，转化E.coli DH50α，IPTG诱导表达，表达产物经Western blot鉴定；利用双启动子原理构建CYP2E1与POR共表达的重组质粒pCW-2E1-POR，采用对氨基苯酚法检测CYP 2E1重组酶的代谢活性，并对不同培养时间（18、28、38h）的代谢活性进行比较。结果质粒pCW-2E1经PCR鉴定，证明构建正确；表达的重组人CYP2E1蛋白相对分子质量约56000，主要以可溶性形式表达。质粒pCW-2E1-POR经PCR及酶切鉴定，证明构建正确；导入质粒pCW-2E1-POR的重组菌提取的蛋白样品具有明显的代谢活性，培养18、28、38h后，代谢活性均值分别为（0.195±0.004）、（0.189±0.003）和（0.192±0.004）nmol／（min·mg），差异无统计学意义（P〉0.05），但与导入质粒pCW-2E1的重组菌提取的蛋白样品的代谢活性相比，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了具有代谢活性的CYP2E1重组酶，且3个培养时间段之间的代谢活性无明显差异。内皮素-1对人子宫肌层成纤维细胞表型分化的影响
摘要：目的 探讨内皮素-1（endothelin-1，ET-1）对人子宫肌层成纤维细胞向成肌纤维细胞转化的影响。方法原代培养人子宫肌层成纤维细胞，经免疫细胞化学法鉴定后，将细胞分为实验组和对照组，实验组分别以0.1、1、10、100nmol／LET-1作用24h，另以10nmol／LET-1分别作用6、12、24、48h，设未处理细胞作为对照，采用实时定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT.qPCR）和Western blot法检测各组细胞α-SMA mRNA及蛋白的表达水平。结果人子宫肌层成纤维细胞的α-SMA蛋白染色呈阴性，波形蛋白染色呈阳性；不同浓度ET-1作用细胞24h后，均可检测到α-SMA mRNA及蛋白的表达，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0.05），其中10nmol／L ET-1实验组表达量最高，与0.1和1nmol／L ET-1实验组相比，差异有统计学意义（P〈0.05）；经10nmol／LET-1作用不同时间的实验组，α-SMAmRNA及蛋白均有表达，与对照组相比，差异均有统计学意义（P〈0.05），其中以作用48h实验组表达最高，与作用6、12、24h实验组相比，差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论ET-1可促进子宫肌层成纤维细胞向成肌纤维细胞的转化。科尔沁牛中性粒细胞防御素5的原核表达及纯化
摘要：目的 原核表达科尔沁牛中性粒细胞防御素5（bovine neutrophil β-defensin5，BNBD5），并进行纯化。方法用Trizol试剂提取牛外周血中性粒细胞总RNA，RT-PCR法扩增BNBD5的cDNA序列，与pMD18-T载体连接，构建重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5，并进行测序，应用DNA Star生物分析软件对科尔沁牛BNBD5与其他物种（绵羊、山羊、驯鹿、家鼠、人类、鳜鱼、中华蜜蜂）B防御素的核苷酸序列进行同源性比较及进化树分析；对科尔沁牛与其他品种牛（新疆荷斯坦牛、印度水牛、荷兰弗里斯兰牛）B防御素的BNBD5核苷酸序列进行进行同源性比较及进化树分析；将构建正确的重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5亚克隆至原核表达载体pET-30a（＋），构建重组表达质粒pET-30a-BNBD5，转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3），IPTG诱导表达后，利用M离子亲和柱纯化，SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果通过PCR扩增获得了195bp的BNBD5全长cDNA序列，为一个完整的开放阅读框（ORF），与GenBank中登录的BNBD5编码区序列（AJ278799）相似性达93.4％，推导该序列编码45个氨基酸残基，并含有防御素的特征性分子结构，即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基；共有13处碱基出现突变，导致其推导的氨基酸序列出现8处变异，但6个保守型半胱氨酸位点均未出现变异。与其他物种的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明，科尔沁牛与山羊、绵羊同源性最高，达80％以上；与中华蜜蜂同源性最低，在10％以下。与其他品种牛的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明，科尔沁牛与新疆荷斯坦牛同源性最高，达90％以上；与荷兰弗里斯牛的同源性最低，约66％。质粒pET-30a-BNBD5经PCR及单双酶切鉴定证明构建正确，表达及纯化蛋白相对分子质量约10000，主要以可溶性形式表达，表达量占菌体总蛋白的25.1％，纯化产物含量达2.15mg／ml。结论成功表�肝癌细胞上清液对成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白、环氧合酶-2和肝细胞生长因子的影响
摘要：目的 观察小鼠肝癌细胞上清液对成纤维细胞增殖及表达d．平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）的影响。方法制备小鼠成纤维细胞，并分别用普通培养液、小鼠肝癌细胞上清液的条件培养液及含转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的培养液培养成纤维细胞。采用MTT法检测3种培养液培养的成纤维细胞的增殖活力；RT-PCR和免疫组织化学法检测3种培养液培养的成纤维细胞中α-SMA、COX-2、HGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达情况。结果条件培养液及含TGF-β1的培养液对成纤维细胞的增殖均有促进作用，但条件培养液的促进作用更强。普通培养液培养的成纤维细胞在第5天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高，含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞在第3天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高，且明显高于普通培养液在第5天时的转录水平，第3天以后转录水平稳定；普通培养液培养的成纤维细胞中无COX-2和HGF转录；条件培养液及含TGF-β1的培养液培养的成纤维细胞在第5天时COX-2和HGF基因mRNA的转录水平最高，第5天后无明显下降。不同培养液培养的成纤维细胞中α-SMA蛋白在胞浆、胞膜均有不同程度的表达；普通培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白不表达，而含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白为阳性表达，表达部位均为胞浆。结论小鼠肝癌细胞上清液能有效、稳定地将成纤维细胞激活为稳定表达COX-2和HGF的肌成纤维细胞，其有望成为在细胞移植中促进移植细胞存活及血管重建的细胞。牛Ⅱ型链球菌vanB2基因真核表达质粒的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达
摘要：目的 构建牛Ⅱ型链球菌（Streptococcus bovis biotype Ⅱ）van B2基因真核表达质粒，并在宫颈癌HeLa细胞中进行表达。方法以牛Ⅱ型链球菌基因组为模板，采用PCR法扩增van B2基因，克隆至真核表达载体pVAX-1中，构建重组表达质粒pVAX-1-vanB2。采用FuGENE HD Transfeetion Reagent试剂盒将重组表达质粒转染HeLa细胞，转染48h后，RT-PCR法检测转染细胞中vanB2基因mRNA的转录；间接免疫荧光法和Western blot法检测转染细胞中vanB2蛋白的表达。结果重组表达质粒pVAX-1-vanB2经双酶切及测序鉴定构建正确；重组表达质粒转染HeLa细胞48h后，荧光显微镜下可见绿色荧光表达，RT-PCR及Western blot分析分别可见570bp及相对分子质量20900的目的条带。结论成功构建了牛Ⅱ型链球菌vanB2基因的真核重组表达质粒，并在HeLa细胞中成功表达。本实验为进一步研究牛Ⅱ型链球菌对抗生素的耐药性机制及其与vanB2基因的相关性奠定了基础。人参多糖对鼻咽癌细胞CNE-2裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及其可能的机制
摘要：目的 探讨人参多糖（ginseng polysaccharide，GPS）对人鼻咽癌细胞CNE-2裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及可能的机制。方法取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞，经裸鼠背部皮下注射，1×10^7个／（0.2ml·只），待瘤体最大径为4～6mm时，取20只模型裸鼠，随机分为4组：对照组（经腹腔注射生理盐水）、放疗组（每次每只裸鼠经肿瘤局部给予5GyX射线照射，每3d照射1次，共3次）、GPS组（经腹腔注射GPS，30mg／kg，每次0.3ml，每72h给药1次，共5次）和GPS联合放疗组（经腹腔注射GPS，30mg／kg，每次0.3ml，每72h给药1次，共5次；末次给药48h后开始放疗，每只每次经肿瘤局部给予5Gy X射线照射，每3d照射1次，共3次）。开始给药3周后处死裸鼠，取瘤体，称重，测量肿瘤的长、短径，计算肿瘤体积及抑制率；HE染色观察移植瘤组织病理学改变；Real-time PCR检测移植瘤组织中β-eatenin基因mRNA的转录水平；免疫组织化学和Western blot法检测移植瘤组织中β-catenin蛋白的表达水平。结果与对照组相比，GPS组、放疗组和GPS联合放疗组的肿瘤体积及瘤重均明显下降（P〈0.05），抑制率分别为29.87％、52.60％和74.68％；镜下观察可见，GPS联合放疗组细胞凋亡明显，多数细胞核完全溶解，细胞结构消失，坏死的肿瘤组织呈现均质红染表现；GPS联合放疗组移植瘤中β-cateninmRNA及蛋白的表达水平均显著下降（P均〈0.05）。结论GPS可抑制CNE-2细胞在裸鼠体内的生长，且对鼻咽癌的放疗具有增敏作用，其机制可能与抑制β-catenin的表达有关。adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体的制备
摘要：目的 制备adr和adw亚型乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）单克隆抗体，并用其区分两亚型HBsAg。方法利用杂交瘤细胞融合技术制备adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体，采用间接ELISA法进行筛选；优化鉴别试验抗原包被剂量，并对HBsAg亚型鉴别试验进行验证。结果共获得抗两亚型HBsAg的单克隆抗体7株；鉴别试验抗原的最佳包被剂量为10μg；1H6和4D3株单抗检测2份编盲adw亚型HBsAg样品的adwA450／adrA450值均大于2，判定其为adw亚型；1E9株单抗检测2份编盲adr亚型HBsAg样品adrA450／adwA450值均大于2，判定其为adr亚型；3A5株单抗检测4份编盲样品的adrA450／adwA450值和adwA450／adrA450值均小于2，未能区分两亚型HBsAg。结论抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别。细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用
摘要：目的 采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒，制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15L转瓶分别培养人二倍体细胞（2BS），扩增至36代后，分别接种0.20MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种，待细胞病变达100％时收获病毒液，加入保护剂（4.5mol／L氯化镁溶液），制备单价疫苗，分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10：1：6的比例混匀，制备成三价疫苗半成品，分装入1ml西林瓶中（每瓶为10人份剂量），即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度，同时进行其他各项检定，并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒，细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液，Ⅰ型平均滴度高0.17 log10 CCID50／ml，Ⅱ型平均滴度高0.33 log10 CCID50／ml，Ⅲ型平均滴度高0.27 log10 CCID50／ml；细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗，三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10 CCID50／ml，符合国内外标准；疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格；细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2d，疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10 CCID50／0.1ml，且病毒滴度下降未超过0.5 log10 CCID50／0.1ml，于2～8℃放置9个月，疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10 CCID50／0.1ml，均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗，可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度，且工艺稳定，质量可控，可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。
