肠道病毒71型收获液蛋白成分的分析
摘要：目的 分析肠道病毒71型（enterovirus71,EV71）收获液中的蛋白成分,为该类疫苗的研发及质控提供参考。方法 将EV71安徽阜阳株接种于Vero细胞,病毒培养72h后,收获病毒液,经蔗糖密度梯度超滤离心、甲醛灭活、DEAE Sephorase FF介质离子交换层析纯化,获得纯化样品。应用透射电镜分析样品中病毒颗粒的形态;对非还原型SDS-PAGE检测疑似病毒衣壳抗原蛋白VP1和VP3条带进行N-末端氨基酸序列分析;液相色谱（liquid chromatography,LC）与电喷雾电离质谱（electrospray ionization,ESI-MS）结合的方法分析样品中所含的蛋白成分。结果 纯化的EV71样品在透射电镜下可观察到20～30nm的球形EV71颗粒,呈典型的肠道病毒形态;经SDS-PAGE分析,第2和第3条带所在位置与文献报道的EV71衣壳蛋白VP1和VP3大小相符,N-末端氨基酸序列与GenBank报道的安徽阜阳株序列（ACD63039.1）一致;LC/ESI-MS质谱分析显示,纯化EV71样品中病毒蛋白成分占绝对优势,包括EV71的蛋白多聚体、VP1、VP2、VP3、VP4蛋白。结论 对EV71疫苗制备过程中病毒收获液的蛋白成分进行了初步分析,为该类疫苗的研发及质控提供了参考。冻干龋齿DNA疫苗稳定性观察
摘要：目的 观察中试阶段制备的冻干龋齿DNA疫苗的稳定性。方法 将中试阶段制备的3批冻干龋齿DNA疫苗于-70℃放置16个月,每隔2个月对其外观、溶解时间、水分、溶解后pH值及质粒超螺旋比例进行观察及检测。结果 在16个月的观察中,冻干龋齿DNA疫苗外观呈乳白色疏松体,溶解时间小于1min,水分约3%,pH值在7.30～7.46之间;保存16月的3批冻干龋齿DNA疫苗的质粒超螺旋比例达85.02%～97.15%,各项指标均合格,稳定性好。结论 冻干龋齿DNA疫苗符合＂预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则＂中的各项指标,疫苗质量较为稳定。重组小肿瘤坏死因子α拮抗剂的表达、纯化及其生物学活性
摘要：目的 表达能够与肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor1,TNFR1）结合的低相对分子质量重组小肿瘤坏死因子α拮抗剂（small TNFαantagonist,STNFαA）,并对纯化后蛋白的生物学活性进行检测。方法 利用计算机模拟优化设计出与TNFR1具有较高结合力的STNFαA氨基酸序列,根据大肠埃希菌＂密码偏爱性＂设计合成目的 基因,插入质粒pET-28a（＋）中,构建原核表达质粒pET28-STNFαA,转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni Sepharose6Fast Flow层析介质进行亲和纯化,纯化产物经SDS-PAGE、HPLC分析;采用MTT法检测重组蛋白的生物学活性。结果 重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;重组蛋白STNFαA相对分子质量约17000,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在,纯度大于95%;重组蛋白STNFαA对TNFα的抑制作用呈浓度依赖性。结论 已成功表达了STNFαA,该蛋白具有抑制TNFα介导的细胞毒生物活性作用,为全新的TNF拮抗剂的新药研究奠定了基础。鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白A基因的克隆及其生物信息学分析
摘要：目的 克隆鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白A（outer membrane protein A,OmpA）基因,并进行生物信息学分析。方法 根据已发表的细菌ompA序列,通过比对保守区域（88～107bp,988～1007bp）设计简并引物,通过PCR技术从鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株扩增ompA基因核心序列,采用热不对称交错PCR（thermal asymmetric inter原laced PCR,TAIL-PCR）法扩增ompA基因全长及其上下游序列;应用Vector NTI9.0对ompA序列进行拼接,应用Vector NTI9.0、SignalP3.0对OmpA蛋白的基本参数、信号肽等进行预测分析;通过Blastn分析嗜水气单胞菌GYK1株ompA基因序列与其他菌种ompA序列的同源性,并构建系统进化树及对其蛋白的三维结构进行分析。结果 ompA基因全长为2004bp,其中包括ORF1059bp,编码352个氨基酸,5’端侧翼序列271bp,3’端侧翼序列574bp;OmpA蛋白相对分子质量约37900,等电点为4.94,OmpA蛋白序列N-末端的前20个氨基酸残基为信号肽序列;根据22种细菌的OmpA蛋白序列构建的系统进化树显示,嗜水气单胞菌GYK1株与嗜水气单胞菌SSU株的亲源关系最近,相似性达95.5%;三维结构分析表明,OmpA蛋白N-末端功能区是由8个反向平行的β-折叠片构成的β-折叠桶;OmpA蛋白Asn25～Ala205片段4个环区的平均柔性显著高于其余部位的柔性。结论 成功克隆了鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株ompA基因,并对OmpA蛋白的相关生物信息学进行了分析,为嗜水气单胞菌呈递外源蛋白基因工程疫苗的研究奠定了基础。幽门螺杆菌感应蛋白CrdS的原核表达及生物信息学分析
摘要：目的 原核表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感应蛋白CrdS,并对其进行生物信息学分析,以探讨其酸适应的调控机制。方法 从H.pylori26695标准株全基因组DNA中PCR扩增编码CrdS蛋白的基因hp1364,插入原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hp1364,转化大肠埃希菌（E.coli）XL1-blue,IPTG诱导表达重组CrdS蛋白。表达的重组蛋白经Western blot鉴定后,进行生物信息学分析。结果 重组表达质粒pQE30-hp1364经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为46000,表达量占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式存在,可与Rabbit anti His-Tag Polyclonal Antibody特异性结合;生物信息学分析显示,CrdS的核苷酸序列和氨基酸序列与其他H.pylori菌株（HpG27、F30、B38）具有高度同源性,表面有许多亲水性区域,含多种易被磷酸化的氨基酸。结论 成功原核表达了H.pyloriCrdS蛋白,并进行了生物信息学分析,为进一步探讨CrdS的感应机制及通过阻断信号感应抗H.pylori感染的途径提供了实验材料。骨形态发生蛋白9对食管鳞状细胞癌细胞的抑制作用
摘要：目的 探讨骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic proteins 9,BMP 9）对食管鳞状细胞癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭及细胞周期的影响。方法 用AdGFP和AdBMP 9分别感染3株食管鳞状细胞癌细胞株ECA109、KYSE150和KYSE180,并设不感染病毒的3种细胞作为对照,采用RT-PCR法检测AdBMP 9感染的3株细胞中BMP 9基因mRNA的转录水平,MTT法检测病毒感染细胞0～96h各组细胞的增殖活力,平板克隆法检测各组细胞的克隆形成能力,划痕试验检测各组细胞的迁移能力,Transwell小室试验检测各组细胞的侵袭能力,并对3组ECA109细胞进行细胞周期的检测。结果 AdBMP 9感染的3株细胞中BMP 9基因mRNA的转录水平均明显提高。与AdGFP感染和未感染病毒的细胞相比,3种细胞在过表达BMP 9后,增殖活力明显降低（P〈0.05）;细胞克隆形成能力均下降（下降率达70%以上）,且克隆细胞团明显变小;细胞迁移和侵袭能力均下降;AdBMP 9感染的ECA109细胞处于G1期的细胞比例明显上升,S期比例明显下降（P〈0.05）。结论 BMP 9可明显抑制食管鳞癌细胞的增殖、克隆、迁移和侵袭能力,并将细胞周期阻滞于G1期。小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒的构建及鉴定
摘要：目的 构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒,并对其进行鉴定。方法 根据GenBank登录的小鼠CX3CR1基因序列设计引物,PCR扩增CX3CR1基因,将其定向克隆至载体pUbi-MCS-EGFP,经菌落PCR和序列测定,将鉴定正确的重组慢病毒质粒转染293T细胞,显微镜下观察病毒的绿色荧光,并根据荧光表达情况计算转染病毒滴度。结果 CX3CR1基因PCR产物经琼脂凝胶电泳鉴定,可见约1000bp的目的 条带;经菌落PCR鉴定及序列测定,重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP构建正确,转染293T细胞48h后,可见绿色荧光表达,经计算,病毒滴度为2×108TU/ml。结论 成功构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP,为研究慢病毒介导的CX3CR1基因转染骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）及其归巢能力奠定了基础。血液制品中残留辛酸/根的急性毒性试验
摘要：目的 探讨酸性条件下血液制品中残留辛酸/根的急性毒性。方法 配制辛酸浓度分别为0.25、2.5和10mg/ml的10%静注人免疫球蛋白（pH4）溶液,另设阴性对照组（0.9%NaCl）,经尾静脉注射SD大鼠,每只大鼠等容量注射,注射剂量为4.5ml/只。每天观察1次大鼠的形态外观、四肢活动和行为方式,并记录大鼠摄食量,共14d;给药后第3、7、14天称量大鼠体重,计算体重增长率;给药后第14天解剖所有动物,观察内脏器官病变情况。结果 辛酸浓度为10mg/ml时,大鼠出现了明显的应激反应、血尿和行为特征的改变,体重增长率明显降低（P〈0.01）,解剖后发现有较明显的肺部病变;辛酸浓度为0.25和2.5mg/ml时,未表现出明显的应激反应和行为特征异常,解剖观察均与阴性对照组无明显差异。结论 10%静注人免疫球蛋白（pH4）溶液中辛酸/根浓度为2.5mg/ml时不会对大鼠造成急性毒性,为酸性条件下血液制品中辛酸/根残留的安全性评价提供了实验数据,也为后期制定10%静注人免疫球蛋白（pH4）中残留辛酸/根的限量标准提供了参考。MCPH1基因过表达对人肺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响
摘要：目的 探讨MCPH1（microcephalin1）基因过表达对人肺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响。方法 将质粒pcDNA3.1（-）/MCPH1（实验组）和pcDNA3.1（-）（阴性对照组）分别转染人肺癌A549细胞,采用Real-time PCR及Western blot法分别检测转染48h后的细胞内MCPH1的表达;采用细胞划痕试验及Transwell试验分别检测MCPH1过表达对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果 实验组A549细胞中MCPH1水平明显高于阴性对照组,差异有统计学意义（P均〈0.05）;实验组细胞迁移及侵袭能力较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义（P均〈0.05）。结论 MCPH1基因过表达可明显抑制A549细胞的迁移及侵袭能力。MCPH1A549狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性
摘要：目的 观察狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性。方法 分别将0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10MOI的PM株狂犬病病毒接种至MRC-5细胞中,显微镜观察感染细胞的状态;间接免疫荧光法检测病毒收获液的滴度;小鼠NIH法测定病毒灭活液的效价。结果 MOI为0.06～0.07时,病毒收获前细胞出现聚集现象,液体中基本无死细胞;病毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价较高。结论 观察了狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性,为疫苗生产工艺的优化提供了实验依据。幽门螺杆菌CrdR蛋白的原核表达
摘要：目的 原核表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）CrdR蛋白（即HP1365）,以探讨其在酸适应中的调控机制。方法 从H.pylori26695标准株基因组DNA中PCR扩增hp1365基因,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,转化E.coliJM109,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果 重组表达质粒pGEX-hp1365经双酶切、PCR和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为25000,主要以包涵体形式表达,可与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合。结论 原核表达了H.pyloriCrdR蛋白,为进一步探讨其对酸信号的感应机制及其通过阻断酸信号的感应抗H.pylori感染的途径奠定物质基础。17β-雌二醇对人甲状腺滤泡状癌WRO细胞侵袭能力的影响及其机制
摘要：目的 探讨17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）对人甲状腺滤泡状癌WRO细胞侵袭能力的影响及其机制。方法 用10-8mol/L的E2处理WRO细胞不同时间（0、24、48h）,倒置显微镜下观察细胞形态的变化;RT-PCR和Westernblot法检测细胞中G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor,GPER）、CXCR1、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2,MMP2）和MMP9基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;ELISA法检测细胞中IL-8的含量;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。结果 随着E2处理时间的延长,WRO细胞间的间隙变大,逐渐离散成单个细胞,形态呈长梭形、纺锤形;细胞中GPER、CXCR1、MMP2和MMP9基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平及分泌IL-8的水平均逐渐升高（P〈0.05或P〈0.01）;细胞的侵袭能力明显增强（P〈0.05）。结论 E2可通过上调GPER、CXCR1、MMP2、MMP9和IL-8的表达,促进WRO细胞的侵袭。人参皂苷对骨髓间充质干细胞分泌干细胞因子的影响
摘要：目的 探讨人参皂苷对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）分泌干细胞因子的影响。方法 通过密度梯度离心法从健康志愿者抗凝骨髓中分离、培养BMSC,传代3代后,采用流式细胞术鉴定其细胞表型;MTT法检测不同浓度人参皂苷（50、100、150、200、300、400mg/ml）作用不同时间（24、48、72、96h）对BMSC增殖活性的影响;ELISA检测200mg/ml人参皂甙作用不同时间（24、48、72h）对BMSC分泌干细胞因子SCF-1和干细胞衍生因子SDF-1α水平的影响;RT-PCR法检测200mg/ml人参皂甙作用24h对BMSCSCF-1和SDF-1αmRNA转录水平的影响。结果 第3代BMSC的CD44、CD29和CD105表达阳性,而CD34、CD45和HLA-DR表达阴性,BMSC的纯度为90%;BMSC与不同浓度的人参皂苷共培养不同时间,细胞的增殖活性均明显增强（P〈0.05）,200mg/ml人参皂苷作用96h细胞的增殖活性最高（P〈0.05）,但无明显的时间和剂量依赖性;人参皂苷对BMSC SCF-1和SDF-1α的分泌及mRNA的转录具有明显的促进作用。结论 人参皂苷能增强BMSC分泌干细胞因子,有望应用于辅助干细胞治疗。HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性
摘要：目的 原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法 生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法将VEGF抗原表位基因插入到HBcAg基因的免疫优势区内,合成HBcAg-VEGF基因序列,克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-HBcAg-VEGF,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经羟基磷灰石CHT层析、Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析纯化后,与Al（OH）3佐剂混合,分别于第0、7、14、21天经肌肉免疫BALB/c小鼠1次,第28天采血,ELISA法检测血清中抗VEGF抗原表位抗体,VEGF受体结合抑制试验筛选具有良好免疫原性的VEGF优势抗原表位。对筛选出的优势抗原表位融合蛋白进行表达及纯化条件的优化。结果 生物信息学软件预测了6个VEGF的B细胞抗原表位;6个重组表达质粒经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白相对分子质量为14400～20100,纯度均在85%以上,除HBcAg-VEGF3以单体形式存在、不形成颗粒外,其他融合蛋白均能形成VLP;各组HBcAg-VEGF融合蛋白免疫小鼠后,均刺激机体产生了针对VEGF抗原表位肽的特异性抗体,其中HBcAg-VEGF1组抗体水平最高,且抑制VEGF与VEGFR结合的能力最强;采用优化的条件表达、纯化的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白纯度达95%以上。结论 筛选得到的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白显示出较好的免疫原性,为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了基础。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管，中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办，是中华预防医学会系列杂志之一，月刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。在选择来稿时注重学术性、前沿性和实用性。优先报道基金项目及各种基金赞助课题的文章，并适当照顾边远地区和基层单位。乳酶生生产菌株的鉴定及耐药谱的分析
摘要：目的 对乳酶生生产用菌株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）140623株进行全面系统鉴定,检测该菌株耐药谱,为临床用药安全性提供参考。方法 利用传统生化、API生化鉴定系统及16S rRNA序列测定对乳酶生生产用菌株粪肠球菌140623株及标准菌株粪肠球菌32222株进行鉴定,利用琼脂扩散纸片法检测其对临床常用10类21种抗生素的敏感性,并免疫小鼠进行菌株毒性试验。结果 粪肠球菌140623株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）;耐药谱显示该菌株对四环素类、氯霉素敏感,对醣肽类中度敏感,对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖甙类、大环内脂类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类抗生素及磺胺耐药;全部小鼠健康存活,符合＂微生态活菌制品＂菌种毒性试验要求。结论 标准物质目录中标示为＂供乳酶生生产用菌株粪肠球菌140623＂应为屎肠球菌140623株。对其耐药谱的研究可为临床联合用药及对该菌株的质量控制提供参考。间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗及移植途径的优化
摘要：目的 探讨脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）对急性肝衰竭大鼠的治疗作用及移植途径的优化。方法 将48只SD大鼠随机分为4组：空白对照组、模型对照组以及移植治疗A、B组,每组12只,模型对照组和移植治疗组大鼠均经腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液,造模后24h,模型对照组经尾静脉注射1ml生理盐水,空白对照组和移植治疗A组均经尾静脉注射1ml hUCMSCs悬液,移植治疗B组经肝叶注射0.3ml hUCMSCs悬液。移植治疗后多时间点收集血清,采用全自动生物化学分析仪检测白蛋白（albumin,ALB）、总胆红素（total bilirubin,TBil）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）含量;移植治疗后1和2周,采用Real-time PCR法检测各组大鼠肝组织中人CK8、CK18和AFP基因水平;移植治疗后3d、1和2周,采用免疫组化SP法检测各组大鼠肝组织中人CK18蛋白的表达。结果 移植治疗后24、48h,移植治疗组与模型对照组相比,ALB、TBil和ALT含量差异有统计学意义（P均〈0.05）;移植治疗后1和2周,与模型对照组相比,移植治疗A和B组CK8、CK18和AFP基因水平均明显升高（P均〈0.01）,随造模时间的延长,基因水平也逐渐升高;移植治疗后3d,大鼠肝脏组织中可检测到人CK18蛋白的表达,hUCMSCs在大鼠肝组织中诱导分化后,从汇管区向肝小叶中央迁移扩散;移植治疗A和B组的肝功能指标、移植细胞分化程度比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 hUCMSCs能促进急性肝衰竭大鼠肝脏的修复,同时自身能分化为具有肝细胞功能的类肝样细胞,经尾静脉注射移植与经肝叶注射移植疗效相似,前者更易于应用和推广。胸腺蛋白口服液对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响
摘要：胸腺蛋白（thymusprotein）是从健康乳猪新鲜胸腺中提取的具有生物活性的蛋白类水溶液，可用于胃溃疡和十二指肠溃疡的治疗。近年来，该产品在临床上越来越受到重视，但目前尚无生物活性的检测方法。本实验应用体外培养小鼠胚胎成纤维细胞（BALB／c3T3），采用MTT法检测胸腺蛋白口服液（修正药业集团北京修正制药有限公司生产，批号：20120501）促细胞增殖作用，为进一步用于治疗消化系统溃疡提供科学依据。
