东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性
摘要：目的表达、纯化东方马脑炎病毒（eastern equine encephalitis virus,EEEV）E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性。方法利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将BALB/c小鼠随机分为4组：PBS对照组、弗氏佐剂对照组（弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化）、E2蛋白组（E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合）和E2蛋白＋弗氏佐剂组（E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化）,每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100μl/只。第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4＋和CD8＋T细胞比例;第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量;第3次免疫后第7天,采用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;每次免疫后第14天,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3%;纯化的重组E2蛋白纯度达95%以上;表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合。与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白＋弗氏佐剂组小鼠体内CD4＋与CD8＋T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高（P﹤0.01）;小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320。结论表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考。中蜂囊状幼虫病毒VP1基因在杆状病毒表达系统中的表达
摘要：目的利用杆状病毒系统表达中蜂囊状幼虫病毒（chinese sacbrood virus,CSBV）结构蛋白VP1基因。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫总RNA,RT-PCR法扩增VP1基因,克隆至载体pFastBacI中,构建重组转座质粒pFastBacI-VP1,转化至感受态大肠埃希菌DHl0Bac中,获得重组杆粒rBacmid-VP1,转染至昆虫细胞sf9中,获得第1代重组杆状病毒,经透射电镜观察杆状病毒粒子;病毒连续传代3次后,RT-PCR鉴定重组杆状病毒,SDS-PAGE检测VP1蛋白的表达情况,Western blot检测表达产物的反应原性。结果重组杆粒经PCR鉴定构建正确;第1代重组杆状病毒经透射电镜观察,可见杆状病毒粒子;重组杆状病毒以M13通用引物和VP1基因特异引物进行PCR扩增,分别可见3 263和963 bp的片段,大小均与理论值一致;CSBV VP1基因能够在sf9细胞中表达,表达的重组VP1蛋白相对分子质量约31 000,可与兔抗CSBV-VP1阳性血清发生特异性反应。结论成功利用杆状病毒表达系统表达了CSBV VP1基因,为深入研究CSBV的感染机制和蜜蜂的免疫机制以及中蜂囊状幼虫病血清诊断试剂盒的研制奠定了基础。重组腺病毒Ad-PML（NLS）-的构建及鉴定
摘要：目的构建携带PML（NLS-）基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML（NLS-）为模板,PCR扩增PML（NLS-）基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML（NLS-）,经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML（NLS-）,经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML（NLS-）,经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML（NLS-）基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML（NLS-）经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML（NLS-）携带的PML（NLS-）能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML（NLS-）感染的K562细胞的增殖活力明显增强（P〈0.05）。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML（NLS-）,其可促进K562细胞的增殖,表明PML（NLS-）可能具有促癌基因的作用。RNA干扰整合素连接激酶基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响
摘要：目的探讨沉默整合素连接激酶（integrin-linked kinase,ILK）基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。方法将ILK siRNA表达质粒和阴性对照质粒在脂质体介导下转染人舌鳞癌Tb细胞,稳定表达细胞株分别命名为Tb siILK和Tb vector组,并设正常Tb细胞对照组（Tb组）。Western blot法检测细胞中ILK蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测细胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表达;光镜和HE染色观察细胞的形态学变化;划痕试验检测细胞的迁移能力;Transwell法检测细胞的侵袭能力;流式细胞术检测细胞的细胞周期和凋亡情况;MTT法检测细胞的增殖活力;Western blot法检测沉默ILK基因后细胞中p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3α/β、Snail的表达。结果与Tb和Tb vector组相比,Tb siILK组细胞中ILK蛋白的表达水平显著降低（P〈0.01）;ILK、p-Akt、p-GSK3β在胞质中的荧光信号明显减弱;大部分细胞的上皮形态特征更为明显;细胞的迁移距离和侵袭细胞数显著减少（P〈0.05）;G2-M期和G0-G1期细胞比例均显著增加（P〈0.01）;细胞的增殖活力显著减低;ILK基因沉默后,细胞中p-Akt、p-GSK3β和Snail蛋白的表达水平显著降低（P〈0.05）。3组细胞的凋亡率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论抑制ILK基因的表达可通过Akt/GSK3β/Snail途径显著抑制人舌鳞癌Tb细胞的生长、迁移和侵袭能力,ILK有望作为治疗人舌鳞癌的靶基因。2013中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会征文通知
摘要：由中华预防医学会生物制品分会和中国药学会生物药品与质量研究专业委员会共同主办,《中国新药杂志》和国药中生上海生物制品研究所有限责任公司联合承办的＂2013中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会＂定于2013年11月中旬在上海召开。会议邀请国内外著名专家学者作专题报告,参会人员包括国内外从事疫苗、血液制品、重组蛋白药物、基因治疗药物、重组单抗药物、诊断试剂、生产和检定用细胞及实验动物等领域的产学研机构及质量标准研究和质量检验检测机构的科技工作者,相关政府部门领导专家和企业家等共计约800人。现面向国内外专业人士征集大会论文。希望大家踊跃投稿,积极参会交流。深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶的原核表达及纯化
摘要：目的原核表达并纯化深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶。方法采用RT-PCR技术扩增深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶基因,插入表达载体pET-30a（＋）中,构建重组表达质粒pET-D5D,转化入大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2＋-NTA纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET-D5D经双酶切（NotⅠ/SalⅠ）和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,诱导6 h表达量较高,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白可与兔抗Δ5-脱饱和酶多克隆抗体特异性结合。结论成功在E.coli中表达了深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶,纯化后的重组蛋白反应原性良好,为进一步研究Δ5-脱饱和酶的功能奠定了基础。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管，中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办，是中华预防医学会系列杂志之一，月刊。艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性
摘要：目的原核表达艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile,CD）谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）,纯化重组蛋白,并检测其酶活性。方法采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46 000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达。纯化的目的蛋白纯度可达90%,浓度为1.7 mg/ml。纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础。重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达
摘要：目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。奶牛乳房炎致病大肠埃希菌的分型及外膜蛋白酶OmpT的抗原性验证
摘要：目的对奶牛乳房炎致病大肠埃希菌（E.coli）进行分型及外膜蛋白酶T（outer membrane protease,OmpT）的抗原性验证。方法采用凝集试验测定黑龙江省分离的84株致病E.coli的O血清型,PCR扩增种系分类群标记基因法对84株E.coli进行分型;经BLAST比对筛选ompT基因后,PCR验证ompT基因的普遍性;克隆A、B1、D群代表株ompT基因,测序后进行同源性比对;构建B1群E.coli 2002-1株ompT基因重组表达质粒pET-32a-ompT,转化E.coliRosetta,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,Western blot法鉴定重组蛋白的抗原性。结果 84株奶牛乳房炎致病E.coli中共鉴定出血清型51株,覆盖42个O血清型,归属A种系进化群10株,占11.90%;B1种系进化群74株,占88.10%;无肠外强致病的B2和D群。各型E.coli均可扩增出ompT基因。4亚群代表株ompT基因具有高度保守性,同源性达97%以上。重组表达质粒pET-32a-ompT经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约55 000,诱导4 h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的29.8%。纯化的重组OmpT蛋白纯度为87.6%,与4亚群E.coli免疫血清均可发生特异性反应。结论种系进化是对奶牛乳房炎致病E.coli分型的理想方法,外膜蛋白酶OmpT在E.coli各种系进化群中抗原性良好,可作为研制E.coli蛋白亚单位疫苗的候选抗原。miR-34a过表达对小鼠脑皮质神经干细胞中巢蛋白表达的影响
摘要：目的探讨miR-34a（microRNA-34a）过表达对小鼠脑皮质神经干细胞（Neutral stem cell,NSCs）标志物巢蛋白（Nestin）表达的影响。方法通过神经球（Neurosphere）形成试验原代培养ICR胎鼠脑皮质NSCs,在脂质体2000的介导下分别转染miR-34a模拟物（mmu-miR-34a mimics）及其阴性对照（mmu-miR-34a control）,另设脂质体对照组（仅转染脂质体）及空白对照组,转染48 h后,采用real time RT-PCR检测各组细胞中miR-34a的表达水平及Nestin基因mRNA的转录水平,Western blot检测Nestin蛋白的表达水平。结果 miR-34a模拟物转染后,显著上调了miR-34a在NSCs中的表达水平（P〈0.01）;miR-34a的过表达显著下调了NSCs中Nestin基因mRNA转录及蛋白的表达水平（P均〈0.01）。结论外源性过表达miR-34a可下调NSCs中Nestin基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,为NSCs的增殖、分化调控的研究提供了新的理论依据。吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶两种同源异形体的鉴定及性质分析
摘要：目的探讨吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13）的两种同源异形体成熟酶TGases A和TGases B的分子差异,并进行系统分析和鉴定。方法吸水链霉菌培养上清液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化后,将纯化产物再经阴离子交换层析,分析纯化产物的分子表面带电性质,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）和远紫外圆二色谱（far ultra-violet circular dichroism spectrometry,Far-UV CD）法分析纯化产物的肽段序列及二级结构的差异,并检测成熟酶N-末端氨基酸序列。结果经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化获得TGases的两种成熟酶TGases A和TGases B,均具有酶活性;TGase A和TGase B成熟酶分子具有不同的表面带电性质,酶活分别为（28.33±1.45）U/mg和（22.54±1.77）U/mg;TGases A和TGases B在质荷比（m/z）4 536.481和4 873.393处两个低丰度肽段有差异,但N-末端6个氨基酸序列完全相同;两者二级结构均以α-螺旋为主,但二级结构存在一定差异。结论吸水链霉菌TGases A和TGases B是由同一种酶原活化产生的同源异形体,两者的表面电荷性质、肽段序列及分子二级结构均有差异。《中国生物制品学杂志》关于稿件优先数字出版的启事
摘要：为缩短学术周期，提高学术论文的时效性和影响力，争取创新性科研成果的首发权，《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网（CNKI）签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响
摘要：目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组（P〈0.05）;shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组（P〈0.05）。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化
摘要：目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子（recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF）165b（rhVEGF-165b）,并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。干扰素α2a与白细胞介素-2联合作用对体外HepG2.2.15细胞增殖及乙型肝炎病毒复制的影响
摘要：目的探讨干扰素α2a（interferonα2a,IFNα2a）与白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）联合作用对体外肝癌细胞HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的影响。方法用不同浓度的IFNα2a（5 000、10 000、15 000 IU/ml）和IL-2（2 500、5 000、10 000 IU/ml）单独及联合作用HepG2.2.15细胞96 h后,采用WST-1法检测细胞增殖情况,倒置相差显微镜观察联合作用组细胞形态学变化,ELISA法检测联合作用组细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达,斑点杂交法检测联合作用组细胞HBV-DNA的复制情况。结果与不同浓度的IFNα2a和IL-2单独作用相比,二者联合作用对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用明显增强（P〈0.05）;IFNα2a与IL-2联合作用组HepG2.2.15细胞显微镜下可见细胞逐渐变圆,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,细胞间接触不紧密,细胞周围碎片增多;联合作用组细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达明显受到抑制（P〈0.05）;5 000 IU/ml IFNα2a＋10 000 IU/ml IL-2、10 000 IU/ml IFNα2a＋10 000 IU/ml IL-2和15 000 IU/ml IFNα2a＋10 000 IU/ml IL-2对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制有抑制作用。结论 IFNα2a与IL-2联合作用对HepG 2.2.15细胞增殖及HBV-DNA复制均有抑制作用。本实验为后续体内动物实验及筛选合适的疫苗佐剂奠定了基础,也为新型乙型肝炎疫苗及治疗性乙型肝炎疫苗的研究提供了参考。霉酚酸酯对小鼠肺纤维化组织中转化生长因子-β1表达的影响
摘要：目的探讨霉酚酸酯（mycophenolate mofetil,MMF）对博莱霉素（bleomycin,BLM）诱导的小鼠肺纤维化组织中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）表达的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为6组：正常对照组、MMF对照组、BLM模型组、MMF低（20 mg/kg）、中（60 mg/kg）、高（100 mg/kg）剂量干预组,每组6只。BLM模型组和MMF 3个干预组经气管注入BLM（6 mg/kg）,正常对照组和MMF对照组注入等量无菌生理盐水;次日按MMF对照组和MMF干预低、中、高剂量组小鼠体重计算MMF给药量,灌胃小鼠,每日1次,连续14 d,正常对照组和BLM模型组用等体积的双蒸水灌胃。灌胃第16天采集小鼠肺脏标本,经HE、Masson染色,从组织形态学上观察肺组织纤维化情况并进行Aschcroft评分;RT-PCR法检测小鼠肺组织中TGF-β1基因mRNA的转录水平;Western blot法检测小鼠肺组织中TGF-β1蛋白的表达水平。结果 BLM诱导的小鼠肺纤维化改变显著,Ashcroft评分较正常对照组显著增高（P〈0.01）,表明小鼠肺纤维化模型构建成功;MMF高剂量干预组肺组织损伤减轻,炎细胞浸润及胶原沉积减少,Ashcroft评分显著降低（P=0.000）。MMF高剂量干预组与BLM模型组比较,TGF-β1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显减低（P〈0.05）;而MMF低、中剂量干预组与BLM模型组之间、MMF对照组与正常对照组之间,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论高剂量的MMF（100 mg/kg）可抑制BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中TGF-β1基因mRNA的转录水平及蛋白表达水平,有望成为治疗肺纤维化的理想药物。重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用
摘要：目的以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RD1区特异性培养滤液蛋白10（culture filtrate pro-tein10,CFP10）与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68（pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68）的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接ELISA法。方法采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白;分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接ELISA法;采用方阵滴定法对建立的间接ELISA法的条件进行优化;并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证。结果纯化的重组CFP10-PPE68融合蛋白纯度约为70%。分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的最佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清最佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗最佳稀释度均为1∶5 000。3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均最佳;3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低。结论以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值。
