JY佐剂对人乳头瘤病毒18型L1蛋白病毒样颗粒黏膜免疫效果的影响
摘要：目的 探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）18型L1蛋白病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）黏膜免疫效果的影响,并观察鼻腔反复免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。方法 用含或不含JY佐剂的HPV18L1VLP分别经肌肉和鼻腔免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,ELISA法检测血清IgG抗体滴度;于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,采用IFNγELISPOT试剂盒检测细胞免疫效果,ELISA法检测黏膜免疫效果;鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,每次间隔3周,收集第14、20、26、32和38周的血清,ELISA法检测HPV18L1蛋白与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。结果 免疫3次后,不含或含有佐剂的HPV18L1蛋白经肌肉免疫后的血清IgG抗体滴度（均为104.6）高于经鼻腔免疫后的血清IgG抗体滴度（分别为101.9和102.8）。含有佐剂的HPV18L1蛋白经鼻腔免疫后呼吸道灌洗液中sIgA抗体浓度（30.06μg/ml）明显高于不含佐剂的HPV18L1蛋白鼻腔免疫组（23.47μg/ml）（P〈0.01）,但肌肉免疫组未检测到sIgA抗体。含有佐剂的HPV18L1蛋白经鼻腔免疫诱导的细胞斑点数明显高于不含佐剂的HPV18L1蛋白鼻腔免疫组（P〈0.01）,不含佐剂与含佐剂的HPV18L1蛋白肌肉免疫组诱导的细胞斑点数差异无统计学意义（P〉0.05）。HPV18L1免疫小鼠后的血清与HPV58、11和6型之间均有交叉反应,在第32周血清特异性IgG抗体滴度最高。结论 HPV18L1VLP经肌肉免疫后,其血清抗体水平高于鼻腔免疫组,但该蛋白鼻腔免疫后细胞免疫反应和黏膜sIgA抗体水平均高于肌肉免疫组;JY佐剂能增强HPV18L1蛋白经鼻腔免疫后的小鼠细胞反应及黏膜sIgA抗体应答,但肌肉免疫组佐剂作用不明显;HPV18L1蛋白反复鼻腔免疫后,可拓宽抗原保护谱。第15届上海国际生物技术和医药研讨会（BIO-FORUM2013）第三届上海国际医疗设备与生物技术展览会（BIO—MED2013）
摘要：“上海国际生物技术与医药研讨会”（BIO—FORUM2013）由上海市现代生物与医药产业办公室主办，得到国家科技部、国家食品药品监督管理局、上海市科学技术委员会等有关委办大力支持。历经10多年发展，已成为全国生物医药领域规模最大的国际性研讨会。为推动我国生物技术与医药的研发和产业化，及时了解国内外生物医药技术的最新动态和发展趋势，上海市现代生物与医药产业办公室将于2013年5月29～31日，在上海国际会议中心继续举办“第15届上海国际生物技术与医药研讨会（BIO—FORUM2013）”。血管紧张素Ⅱ基因重组杆状病毒的构建
摘要：目的 构建携带血管紧张素II（AngiotensinII,AngⅡ）基因的重组杆状病毒,并利用Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统进行表达。方法 将重组杆粒bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC（rB/HAngⅡ）转染昆虫细胞sf9,包装出重组杆状病毒rBac-P1-2A-4AngⅡs-3ABC（rBAV）,通过光学显微镜和透射电镜观察细胞病变（CPE）及病毒形态,采用蚀斑试验检测病毒滴度,PCR及间接免疫荧光技术验证该病毒及感染细胞中AngⅡ和HAV蛋白的表达。结果 重组杆粒rB/HAngⅡ转染sf9细胞96h后,出现典型的CPE;透射电镜下观察可见典型的杆状病毒颗粒;PCR可特异性的扩增出约3000和1000bp的P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因片段;P3代重组杆状病毒滴度约为4×108pfu/ml;感染后的sf9细胞中可见特异性的绿色荧光（AngⅡ蛋白）和红色荧光（HAV结构蛋白）。结论 已成功构建了携带AngⅡ基因的重组杆状病毒,并在sf9细胞中获得表达,为研制抗高血压疫苗提供了新的思路。人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性
摘要：目的 在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,HRSV）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法 将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4（30μg/只）、TB10.4-F1（30μg/只）及PBS（200μl）组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果 表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13300和59600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论 融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。犬细小病毒VP2蛋白重组人5型腺病毒的构建
摘要：目的 构建犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）VP2蛋白重组人5型腺病毒。方法 将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd59.2-100经PacⅠ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度（TCID50）。电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平。结果 重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25TCID50辕ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达。结论 已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒。乙肝病毒X蛋白对肝前体细胞中β-连环素表达及定位的影响
摘要：目的 探讨乙肝病毒X蛋白（Hepatitis B Virus X,protein,HBx）对肝前体（Hepatic progenitor,HP）14-19细胞中β-连环素（β-catenin）表达及定位的影响,为研究HBV相关性肝癌的发生机制提供实验依据。方法 分别用重组腺病毒Ad-GFP-HBx和Ad-GFP感染HP14-19细胞,RT-RCR法检测HBx基因mRNA的转录;Real-time PCR法检测β-catenin基因mRNA的水平;Western blot法检测HBx、总糖原合成酶激酶3β（total-glycogen synthase kinase3β,t-GSK3β）、磷酸化GSK3β（Phospho-GSK3β,p-GSK3β）及β-catenin蛋白的表达;免疫细胞化学法检测β-catenin的分布情况。结果 重组腺病毒Ad-GFP-HBx和Ad-GFP均能高效感染HP14-19细胞,感染效率均可达到90%;在重组腺病毒Ad-GFP-HBx感染的HP14-19细胞中可检测到HBx基因mRNA的转录和蛋白的表达;与Ad-GFP感染组相比,Ad-GFP-HBx感染组t-GSK3β蛋白相对表达量无明显变化（P〉0.05）,但p-GSK3β蛋白相对表达量增加（P〈0.05）;β-catenin在基因和蛋白水平上表达明显增高（P〈0.05）,并在胞质中大量积聚,且有向胞核转位的趋势。结论 HBx可通过促进HP14-19细胞中GSK3β磷酸化,抑制β-catenin的降解,从而导致β-catenin在胞质中大量积聚并向核内转移。HBx对肝前体细胞中经典Wnt信号通路的激活,可能是导致肝前体细胞恶性转化的分子基础。小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定
摘要：目的 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠可溶性IL-5α受体（Soluble IL-5receptorα,sIL-5Rα）蛋白,并对其抗原性进行鉴定。方法 应用Vector NTI Advance Ⅱ软件优化小鼠IL-5Rα基因胞外区密码子后合成序列,将sIL-5Rα克隆至pFastbacI中,构建重组穿梭质粒pFastbacI-sIL-5Rα,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆粒Bacmid-sIL-5Rα,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,采用Reed-Muench法检测扩增后病毒滴度;将P3、P4代病毒以0.05MOI感染sf9细胞,SDS-PAGE鉴定sIL-5Rα蛋白的表达,表达产物应用阳离子交换层析法进行纯化,并对纯化的sIL-5Rα蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果 重组杆粒Bacmid-sIL-5Rα经PCR鉴定,证明构建正确;P3代重组杆状病毒的病毒滴度为1.7×107pfu/ml;表达及纯化的sIL-5Rα蛋白在相对分子质量约43000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠IL-5Rα多克隆抗体发生特异性反应。结论 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠可溶性IL-5Rα受体蛋白,为进一步研究其生物学功能及在哮喘模型动物中的治疗作用奠定了实验基础。抗菌肽PR-39重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定
摘要：目的 构建抗菌肽PR-39（Proline-arginine rich39-amino acid peptide,PR-39）重组腺病毒表达质粒。方法 从含抗菌肽PR-39核心编码区的质粒中扩增PR-39基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组穿梭质粒,经PmeⅠ酶切线性化后,转化感受态AdEasier细胞,构建重组腺病毒质粒,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度检测。将重组腺病毒感染鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2,通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）的表达,RT-PCR法检测PR-39基因的转录水平。结果 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-PR-39经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组腺病毒质粒pAdPR-39经PacⅠ酶切鉴定,证明目的 基因已整合到腺病毒基因组中;第4代重组腺病毒AdPR-39的病毒滴度为1010IU/ml;感染重组腺病毒AdPR-39的C3H10T1/2细胞可表达RFP;PR-39基因在C3H10T1/2细胞内成功转录。结论 已成功构建携带RFP的PR-39重组腺病毒表达质粒,在鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中可高效表达。附红细胞体感染小鼠CD4^＋T淋巴细胞相关因子的检测
摘要：目的 动态检测小鼠感染附红细胞体后CD4＋T淋巴细胞相关细胞因子的变化情况,探讨CD4＋T淋巴细胞发挥的免疫学效应。方法 将小鼠随机分为实验组（纯化的附红细胞体）和对照组（生理盐水）,均经腹腔免疫接种,0.5ml辕只。分别于感染后第3、5、7、9d,经小鼠尾尖采血,镜下观察附红细胞体形态并进行PCR鉴定。建模成功后,分别于感染后第3、5、7、9d无菌取小鼠脾脏,采用RT-PCR法检测小鼠脾脏中IL-4、IL-17、IFNγ基因的转录水平。结果 各时间点感染小鼠的红细胞均出现不同程度的变形,边缘被附红体附着,PCR扩增产物可见602bp的特异条带。实验组小鼠脾脏IL-4、IL-17、IFNγ均有不同程度的表达,IL-17在感染在第3天上调,5d达到高峰,7d开始下降;IFNγ在感染第3天表达上调,5d明显下降,7d表达上升,9d达到高峰;IL-4始终处于低表达状态。实验组小鼠脾脏IL-4、IL-17、IFNγ的转录水平均高于对照组（P〈0.01）,IL-17和IFNγ的表达呈相互抑制状态,IL-4呈被抑制状态。结论 附红细胞体感染后,IL-17在早期发挥了促进炎症发生和抵抗感染的免疫学作用;IFNγ在感染后期发挥保护炎性反应,避免炎性反应过度发生的免疫学效应;IL-4在此感染过程中作用不明显。人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定
摘要：目的 利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法 以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果 重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高（P〈0.05）。结论 已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化
摘要：目的 克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法 设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2＋柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果 重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论 已成功克隆并在大肠杆菌BL21（DE3）中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。尿苷二磷酸与尿苷三磷酸两种佐剂对HAV抗原及HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响
摘要：目的 探讨尿苷二磷酸（Uridine diphosphate,UDP）与尿苷三磷酸（Uridine triphosphate,UTP）两种佐剂对HAV抗原和HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法 分别在HBsAg（1μg）和HAV抗原（18EU）中加入不同浓度的UDP和UTP（HBsAg组：UDP和UTP均500μg及1、2、5、10mg,HAV抗原组：UDP和UTP均500μg及1、2mg）,均经腹部皮下多点注射免疫ICR小鼠（HBsAg组：2针,间隔2周,0.1ml/只;HAV抗原组：单针免疫,0.2ml/只）,并设空白对照组（生理盐水100μl）、抗原组对照组（HBsAg1μg;HAV抗原18EU）、铝佐剂组对照组（铝佐剂300μg）、UDP＋铝佐剂复合组（HBsAg1μg＋铝佐剂300μg＋UDP2mg;HAV18EU＋铝佐剂300μg＋UDP2mg）和UTP＋铝佐剂复合组（HBsAg1μg＋铝佐剂300μg＋UTP2mg;HAV18EU＋铝佐剂300μg＋UTP2mg）,分别于末次免疫后（HBsAg组：第4、8、12和16周;HAV抗原组：第4、8、12周）采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中抗-HBsAg IgG和抗-HAV IgG水平。免疫18周后,分别取HBsAg组中UDP和UTP最佳浓度组及空白对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肺组织进行病理观察。结果 除空白对照组小鼠血清检测不到抗-HBsAg IgG外,其余各组小鼠血清抗-HBsAg IgG及抗-HAV IgG水平均在第8周达到峰值,以后逐渐下降。末次免疫后,UDP及UTP各组抗-HBsAg IgG及抗-HAV IgG水平均高于抗原对照组,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。HBsAg组UDP＋铝佐剂复合组产生的IgG水平明显高于抗原对照组、铝佐剂对照组及UDP和UTP各浓度组（P〈0.05）;HAV抗原组UTP＋铝佐剂复合组产生的IgG水平明显高于抗原对照组、铝佐剂对照组及UDP和UTP各浓度组（P〈0.05）。在两种抗原中,UDP和UTP的最佳浓度均为2mg/只。在设置的浓度范围内,UDP和UTP佐剂均未观察到毒性反应。结论 UDP和UTP均能明显增强HBsAg及HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答。hepaCAM基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定
摘要：目的 构建表达肝细胞黏附分子（Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM）基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法 以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经PmeⅠ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经PmeⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度。RT-qPCR及Western blot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达。结果 酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高（P〈0.05）。结论 已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据。南极磷虾对大鼠骨质疏松模型的影响
摘要：目的 观察不同剂量南极磷虾粉及其与钙联合对骨质疏松模型大鼠的作用。方法 将大鼠随机分为10组,即虾粉低、中、高剂量组、钙组、联合低、中、高剂量组、氟化钠组、假手术组、模型对照组,每组10只,通过切除双侧卵巢建立骨质疏松模型,假手术组仅切除卵巢附近部分脂肪组织。各实验组分别灌胃低、中、高剂量虾粉、钙、低、中、高剂量虾粉＋钙、氟化钠,假手术组与模型对照组正常饮食。12周后,经腹动脉取血,分离血清,检测钙离子浓度及碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性;取股骨观察骨密度及生物力学差异,并检测骨灰分含量;取胫骨检测骨氟含量。结果 虾粉低、中、高剂量组及联合低、中、高剂量组大鼠血钙浓度随虾粉剂量的增加逐渐降低,虾粉高剂量组与模型对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）,而联合低、中、高剂量组大鼠血钙浓度高于模型对照组;虾粉低、中、高剂量组ALP活性均高于模型对照组（P〈0.05）,且随着虾粉剂量的增加,ALP活性增强。联合低、中、高剂量组大鼠骨密度均高于模型对照组（P均〈0.05）,且优于低、中、高剂量虾粉组;与模型对照组相比,虾粉低剂量组及联合中、高剂量组均可明显增加骨最大力学载荷值（P均〈0.05）;与模型对照组相比,低、中、高剂量虾粉组随虾粉剂量增加骨氟含量增多,与钙联合应用后,降低了骨氟含量（P均〈0.01）,联合低、中、高剂量组与相同剂量的虾粉组相比,骨氟含量均降低;虾粉低、中、高剂量组与模型对照组相比,骨灰分含量升高（P均〉0.05）。结论 使用虾粉治疗骨质疏松时,低剂量效果最佳;若虾粉与钙联合治疗,中剂量虾粉加钙改善骨质疏松效果最佳。凋亡细胞对巨噬细胞中白细胞介素-27表达的影响
摘要：目的 探讨凋亡细胞对巨噬细胞中白细胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）表达的影响。方法 分别将小鼠巨噬细胞系RAW264.7（RAW细胞）和小鼠腹腔巨噬细胞分为6组：空白对照组、LPS刺激组、凋亡细胞刺激组、LPS＋凋亡细胞刺激组、IFNγ＋LPS刺激组及IFNγ＋LPS＋凋亡细胞刺激组。用IL-27p28启动子荧光素酶报告基因瞬时转染RAW细胞,检测各组细胞中IL-27p28启动子荧光素酶活性;RT-PCR法检测各组RAW细胞中IL-27p28基因mRNA的转录水平,实时定量PCR法检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-27p28基因mRNA的转录水平;Westernblot法检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-27的表达水平。结果 瞬时转染的RAW细胞中,IFNγ＋LPS刺激组中IL-27p28启动子荧光素酶活性明显高于空白对照组及IFNγ＋LPS＋凋亡细胞刺激组（P〈0.05）;RAW细胞与腹腔巨噬细胞中,LPS刺激组和IFNγ＋LPS刺激组中IL-27p28基因mRNA的转录水平明显高于空白对照组、LPS＋凋亡细胞刺激组和IFNγ＋LPS＋凋亡细胞刺激组（P〈0.05）;LPS刺激组和IFNγ＋LPS刺激组细胞中IL-27的表达水平明显高于LPS＋凋亡细胞刺激组和IFNγ＋LPS＋凋亡细胞刺激组。结论 巨噬细胞在摄取凋亡细胞后,IL-27p28亚基的表达水平下降,从而导致IL-27的表达水平下降,为进一步研究其机制及临床应用奠定了理论基础。CAST基因多态性与西门塔尔杂交牛胴体和肉质性状的相关性分析
摘要：目的 分析钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin,CAST）基因多态性与西门塔尔杂交牛胴体和肉质性状的相关性。方法 选取95头西门塔尔杂交牛,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（Restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction,RFLP-PCR）对CAST基因外显子1（Exon1）和外显子5（Exon5）区域的片段的多态性进行检测,并对突变位点与西门塔尔肉牛胴体和肉质性状的相关性进行分析。结果 在所分析的片段中,仅引物4扩增的片段（Exon1）存在一个G→C碱基的置换突变（E1256g﹥c）,为同义突变;该突变位点为RasⅠ酶的自然酶切位点,酶切后存在GG、GC和CC3种基因型,CC基因型与西门塔尔牛的净肉率性状显著相关（P﹤0.05）,而对其他胴体和肉质性状无显著影响。结论 CAST基因Exon1处存在的突变位点与西门塔尔肉牛的净肉率显著相关,因此该位点将有助于筛选与牛肉质相关的辅助选择标记,该基因将为鉴定与肉质相关的功能基因提供参考。Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达
摘要：目的 构建pre-miR-10a（miR-10a前体）重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法 化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVpre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果 重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的 基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论 已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。人胎盘泌乳素的原核表达及纯化
摘要：目的 原核表达并纯化人胎盘泌乳素（Human placenta lactogen,hPL）。方法 从正常产妇新鲜胎盘组织中提取组织总RNA,PCR扩增hPL基因,将其亚克隆至pQE-30载体,构建重组表达质粒,转化感受态大肠杆菌M15（pREP4）,经IPTG诱导表达。表达产物经Sephacryl S-200层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和western blot鉴定其纯度和特异性。结果 重组菌pQE-hPL/M15（pREP4）经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约23000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的67%;纯化后目的 蛋白纯度可达90%以上;纯化蛋白和hPL包涵体均可与羊抗hPL多克隆抗体特异性结合,具有较强的特异性和抗原性。结论 已成功制备了纯度较高的hPL蛋白,为基因工程制备抗体提供了抗原。
