甲型肝炎病毒病毒样颗粒的制备
摘要：目的制备甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）,为研制HAV VLPs疫苗奠定基础。方法利用RT-PCR法从HAV HM175-clone4株中扩增P1-2A、P2和P3基因片段。将P1-2A和P3基因亚克隆至pFastBacDual载体,构建重组表达质粒pFastBacDual-P1-P3,转化大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-P1-P3,转染昆虫细胞sf-9进行重组杆状病毒的包装。重组杆状病毒vAcP1P3扩增后,感染昆虫细胞Tn-5,培养72 h后,收获表达产物,经原位免疫荧光、EIA、Western blot法及透射电镜检测HAV VLPs的表达。表达产物经超滤及蔗糖密度梯度离心纯化。结果重组表达质粒和重组穿梭质粒分别经双酶切和PCR鉴定证明构建正确。第2、3、4代重组杆状病毒的滴度分别为1.58×105、2.13×107、3.98×107TCID50/ml。vAcP1P3转染sf-9细胞72 h后,可见HAV蛋白的表达;vAcP1P3转染Tn-5细胞后,表达的HAV抗原主要存在于沉淀中,且含量明显高于野生型杆状病毒沉淀样品（P〈0.001）;Wentern blot结果表明,与野生型杆状病毒组相比,HAV VLPs样品中VP3的含量相对较少,HAV VLPs样品可见相对分子质量约30 700的VP1片段及相对分子质量约27 700的VP3片段;透射电镜观察可见大小约50 nm的VLPs颗粒,略大于天然HAV颗粒。纯化的HAV蛋白主要存在于40%~50%的蔗糖梯度中,提示有VLPs形成。结论成功制备了HAV VLPs,为甲肝新型疫苗的研制奠定了基础。第15届上海国际生物技术和医药研讨会（BIO-FORUM 2013） 第三届上海国际医疗设备与生物技术展览会（BIO-MED 2013）
摘要：＂上海国际生物技术与医药研讨会＂（BIO-FORUM 2013）由上海市现代生物与医药产业办公室主办,得到国家科技部、国家食品药品监督管理局、上海市科学技术委员会等有关委办大力支持。历经10多年发展,已成为全国生物医药领域规模最大的国际性研讨会。WT1蛋白CTL表位肽基因载体的构建与鉴定
摘要：目的构建WT1（Wilms’tumor gene 1）蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录。方法设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th（PADRE）,应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表位和间隔序列,DNA疫苗在线预测工具DyNAVacS优化真核密码子后,人工合成核苷酸序列,分别插入pUC57载体,构建pUC57-WT1质粒,测序鉴定后,酶切回收各目的片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组真核表达质粒,转染293T细胞,RT-PCR检测各目的基因在293T细胞中的转录。采用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取各重组质粒,采用紫外分光光度计测定质粒的纯度和浓度。结果各重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证实构建正确;重组质粒携带的目的基因可在293T细胞中成功转录;各重组质粒DNA的纯度均合格,浓度在864.6～883.9μg/ml之间。结论成功构建了WT1蛋白CTL表位肽基因载体,并能在真核细胞中正常转录,为下一步在小鼠体内探讨特异性不同的CTLs群发挥抗肿瘤作用的机制奠定了基础。柔嫩艾美耳球虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因核酸疫苗的免疫保护效果
摘要：目的观察柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella,E.tenella）丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor,Serpin）基因核酸疫苗对E.tenella感染雏鸡的免疫保护效果。方法取14日龄雏鸡,随机分为7组：pVAX1-Serpin高剂量组（100μg/只）、pVAX1-Serpin中剂量组（50μg/只）、pVAX1-Serpin低剂量组（25μg/只）、pVAX1组（50μg/只）、E.tenella卵囊组（15日龄时,口服5 000个卵囊/只,不加强免疫）、未免疫攻虫对照组（0.1 ml PBS）和未免疫未攻虫对照组（0.1 ml PBS）,除E.tenella卵囊组外,均经胸肌注射免疫,21日龄时加强免疫1次,28日龄时,除未免疫未攻虫对照组外,均经口感染1×104个E.tenella孢子化卵囊。攻虫后第8天剖杀,计算各组的存活率、平均增重、相对增重率、盲肠病变减少率、卵囊减少率及抗球虫指数（Anticoccidial index,ACI）。结果未免疫攻虫对照组和pVAX1组的存活率分别为75%和70%,其余各组的存活率均为100%。pVAX1-Serpin高、中剂量组、E.tenella卵囊组和未免疫未攻虫对照组的平均增重2均较未免疫攻虫对照组显著增加（P〈0.05）,其中pVAX1-Serpin高剂量组相对增重率2达95.26%;E.tenella卵囊组、pVAX1-Serpin高、中剂量组的盲肠病变记分明显低于pVAX1组和未免疫攻虫对照组（P〈0.05）,前两组病变减少率较高;各免疫组卵囊产量均较未免疫攻虫对照组显著下降（P〈0.05）,pVAX1-Serpin高剂量组卵囊减少率达67.04%;各免疫攻虫组ACI值均高于未免疫攻虫对照组,其中E.tenella卵囊组最高（181.23）,pVAX1-Serpin高剂量组次之（166.26）,而pVAX1-Serpin中、低剂量组和pVAX1组均小于160。结论高剂量pVAX1-Serpin对鸡E.tenella感染具有一定的免疫保护作用。胰岛素诱导基因-2启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建与鉴定
摘要：目的 构建胰岛素诱导基因-2（Insulin induced gene-2,Insig-2）启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其转录活性。方法 从人基因组DNA中扩增Insig-2基因转录起始位点上游1389bp的启动子片段,插入pGL3-basic质粒中,构建重组质粒pGL3-Insig-2,将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染HEK293、HepG2和3T3-L1细胞,采用双荧光素酶法检测Insig-2启动子活性。结果 重组质粒pGL3-Insig-2经双酶切和DNA测序,证实构建正确;pGL3-Insig-2质粒在HEK293、HepG2和3T3-L1细胞中均具有启动子活性,分别为阴性对照组（pGL3-basic空载体）的28、40和214倍、阳性对照组（pGL3-SV40）的2.6、5.5和30倍,呈现出强启动子活性。结论 成功构建了Insig-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,为后续Insig-2基因的深入研究奠定了基础。结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达
摘要：目的 在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）F1蛋白。方法 从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4（N/X）和TB10.4（N/B）基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4（N/X）/pET-28a和TB10.4（N/B）/pET-30a;从F/18T/DH5琢菌株中扩增F1（B/X）基因,与TB10.4（N/B）/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4（N/X）/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Westernblot鉴定。结果 重组表达质粒TB10.4（N/X）/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13000和59000,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论 成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础。酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎和乙型肝炎抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用
摘要：目的 探讨酵母多糖鄄角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎（简称甲肝）和乙型肝炎（简称乙肝）抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用,并对皮下和鼻腔接种的免疫效果进行比较。方法 将酵母多糖与角鲨烯按一定比例混合,制成复合佐剂,将不同剂量的复合佐剂与HBsAg混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8、16周,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAgIgG抗体水平,筛选复合佐剂的最佳免疫剂量。以复合佐剂的最佳免疫剂量与甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、甲肝抗原对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8周检测小鼠血清中抗甲肝抗原IgG抗体水平。以复合佐剂最佳免疫剂量分别与HBsAg和甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组和甲肝抗原对照组,经鼻腔免疫ICR小鼠,共免疫3次,间隔2周,分别于末次免疫后4、8周检测小鼠血清中抗HBsAg和甲肝抗原IgG抗体水平。在试验期间,对小鼠的健康状况进行观察,并对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行病理分析。结果 酵母多糖鄄角鲨烯复合佐剂对HBsAg的最佳免疫剂量为2mg酵母多糖＋8μl角鲨烯,该组抗体水平明显高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组（P〈0.05）;复合佐剂对甲肝抗原也有较好的体液免疫增强作用,抗体水平显著高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组（P〈0.05）;复合佐剂通过鼻腔免疫,对HBsAg和甲肝抗原的体液免疫应答也有增强作用,但效果不如皮下免疫,甲肝抗原鼻腔免疫效果优于HBsAg（P〈0.05）。在试验期内,小鼠均未出现异常反应,各器官均未发生病变。结论 酵母多糖鄄角鲨烯复合佐剂能显著增强甲肝和HBsAg抗原对小鼠的体液免疫应答,免疫效果优于铝佐剂;皮下免疫效果�大鼠结缔组织生长因子基因miRNA表达质粒的构建及其稳定转染大鼠肝星状细胞系的建立
摘要：目的构建大鼠结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）基因miRNA表达质粒,并建立稳定转染大鼠肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）系。方法根据大鼠CTGF基因mRNA序列,设计并合成3对寡聚单链DNA X191-1、X191-2和X191-3及1对阴性对照序列DNA X191-4,将4对寡聚单链DNA退火成双链后,分别与载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建CTGF基因miRNA重组表达质粒,分别转染HSC-T6细胞,荧光显微镜观察细胞的转染效率,RT-PCR检测转染细胞中CTGF基因mRNA的转录水平;取干扰效率最高的重组质粒及阴性对照质粒,分别转染HSC-T6细胞,经杀稻瘟菌素持续加压筛选。结果经测序鉴定,重组表达质粒构建正确,插入片段的碱基序列与设计相符;细胞的瞬时转染效率约为50%;3组干扰质粒转染的HSC-T6细胞中,CTGF基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组（P〈0.01）,其中X191-2质粒对CTGF基因转录的干扰效率最高;获得了稳定转染的HSC-T6细胞。结论成功构建了CTGF基因miRNA表达质粒,并获得了稳定转染的肝星状细胞系,为进一步研究肝纤维化的形成机制及其治疗奠定了基础。2013中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会征文通知
摘要：为了促进中国生物制品事业的蓬勃发展,为从业人员提供更多交流与合作机会,2013中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会将定于2013年10月在上海召开。本次会议由中华预防医学会生物制品分会主办、《中国新药杂志》和国药中生上海生物制品研究所有限责任公司承办。仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库的构建及初步筛选
摘要：目的 构建仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,并进行初步筛选。方法 用仙台病毒Tianjin株免疫小鼠,制备脾细胞悬液,提取小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR扩增鼠抗体轻链（κ链）和重链Fd基因,将轻链基因和噬菌粒p3MH经SacⅠ和XbaⅠ双酶切后纯化回收,经T4DNA连接酶连接,电转化E.coliXL1-Blue,构建轻链库;将重链Fd段基因和轻链库p3MH-κ经SpeⅠ和XhoⅠ双酶切后,纯化回收并连接,电转化E.coliXL1-Blue,获得噬菌体抗体库,计算重组率和抗体库滴度。以仙台病毒Tianjin株重组蛋白HN2为抗原进行初步筛选,制备噬菌体抗体,并进行测序。结果 构建的免疫噬菌体抗体库库容为1.18×107,重组率为90%,制备的噬菌体抗体滴度为1011pfu/ml;经初步筛选,噬菌体富集了约63.6倍,获得2株与重组蛋白HN2有结合活性的阳性克隆,经NCBIBLAST进行同源性分析,显示为鼠源性抗体,经IMGT分析,显示轻链基因与Vk9亚群基因的同源性为94.87%,重链基因与VH7亚群基因的同源性为97.85%。结论 成功构建了仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,为该病毒株的诊断、疾病治疗及致病机制等研究奠定了基础。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。神经肽P物质对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化/抗氧化状态的影响
摘要：摘要：目的 探讨神经肽P物质（Substance P,SP）对高氧损伤早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（Alveolar epithelial celltypeⅡ,AECⅡ）氧化/抗氧化状态的影响。方法 将分离培养的原代早产大鼠AECⅡ随机分为4组：空气组（将细胞置5%CO2、21%O2的孵箱中）、高氧组（将细胞置5%CO2、95%O2的密闭氧仓中）、高氧SP组（细胞培养液中预先加入5×10^-8mol/L的SP,再置高氧中）和高氧SP受体拮抗剂组（细胞培养液中预先加入5×10^-8mol/L的SP和5×10^-7mol/L的L703.606,再置高氧中）,各组细胞培养24h后,镜下观察细胞形态的变化;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞周期;JC-1探针法检测细胞凋亡早期线粒体膜电位的变化;化学比色法检测细胞丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量、总抗氧化能力（Total antioxidative capacity,TAOC）及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的活力。结果 与空气组比较,高氧组AECⅡ的增殖活力、S＋G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显下降（P〈0.01）,MDA含量明显升高（P〈0.01）;与高氧组比较,高氧SP组AECⅡ的增殖活力、S＋G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显升高（P〈0.01）,而MDA含量明显下降（P〈0.01）,SP受体拮抗剂可阻断该效应。结论 SP可明显减轻高氧导致的早产大鼠AECⅡ的氧化损伤,增强细胞的抗氧化能力,进而起到促进细胞增殖的作用。第六次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会征文通知
摘要：为促进我国免疫诊断与疫苗技术的发展,加强有关学科的经验交流和沟通,中华医学会微生物学与免疫学分会和中国医药生物技术协会生物诊断技术分会决定于2013年8月,在吉林省吉林市召开第六次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会。牙本质基质蛋白1功能片段的融合表达及其胞内定位
摘要：目的构建含单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）位点不同碱基的37 kD的N-牙本质基质蛋白1（Dentin matrix protein 1,DMP1）和全长DMP1基因重组表达质粒,并分析重组蛋白在HEK293细胞中的表达及定位。方法利用定点突变改造DMP1基因,获得DMP1基因的SNP rs10019009的不同基因型,将含SNP位点不同碱基的37 kD N-DMP1和全长DMP1基因定向克隆入含增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的质粒pcDNA3.1-EGFP中,构建重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP,通过脂质体法瞬时转染HEK293细胞,荧光显微镜观察重组融合蛋白DMP1-EGFP的表达及胞内定位。结果 DNA测序结果表明,定点突变后的DMP1基因的碱基序列与设计序列完全一致;PCR和DNA测序显示重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP构建正确;融合蛋白DMP1-EGFP在HEK293细胞中主要表达于细胞胞浆中。结论成功构建了含rs10019009-SNP位点不同碱基的37 kD的N-DMP1和全长DMP1基因重组表达质粒,并在HEK293细胞的胞浆中有效表达,为进一步研究DMP1基因的功能奠定了基础。双歧杆菌介导HSV-tk/GCV系统治疗大鼠膀胱癌的疗效
摘要：目的观察双歧杆菌介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk）/丙氧鸟苷（Gancyclovir,GCV）系统治疗大鼠膀胱癌的疗效,并初步探讨其可能的作用机制。方法采用N-甲基亚硝基脲（N-methyl-nitrosourea,MNU）膀胱灌注法建立大鼠膀胱癌模型,将模型大鼠随机分为3组,分别经尾静脉注射生理盐水、携带空载体pGEX-5X-1的双歧杆菌和携带重组质粒pGEX-tk的双歧杆菌（含婴儿双歧杆菌4.4×109个/ml）,再联合腹腔灌注GCV（50 mg/kg）治疗,治疗结束后称量各组大鼠膀胱重量;TUNEL染色法检测各组大鼠膀胱组织细胞凋亡情况,RT-PCR和Western blot法检测各组大鼠膀胱肿瘤组织细胞色素C（Cyt-C）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果治疗后,双歧杆菌重组质粒组大鼠膀胱重量明显低于生理盐水对照组和双歧杆菌空载体组（P〈0.001）,膀胱组织细胞凋亡指数明显高于生理盐水对照组和双歧杆菌空载体组（P〈0.001）,膀胱肿瘤组织Cyt-C和caspase-9基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显高于生理盐水对照组和双歧杆菌空载体组（P〈0.001）。结论双歧杆菌介导的HSV-tk/GCV治疗系统治疗大鼠膀胱癌疗效显著;该治疗系统可能通过以Cyt-C为中心的内源性凋亡途径导致膀胱癌细胞凋亡。沃特世超高效合相色谱
摘要：2012年3月12日,沃特世ACQUITY Ultra Performance Convergence Chromatography系统上市。该技术克服了反相色谱（LC）和气相色谱（GC）技术的局限,能完全替代正相色谱技术。新型的ACQUITY UPC2TM系统采用超高效合相色谱原理,为疏水化合物、手性化合物、脂类、热不稳定样品以及聚合物等的分析提供了强有力的工具。链脲佐菌素诱导的雄性大鼠高血糖对子代生长发育及代谢的影响
摘要：目的观察链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导的雄性大鼠高血糖对子代生长发育及代谢的影响。方法将健康雄性SD大鼠随机分为对照组（CON）和STZ组,STZ组经腹腔注射STZ（35 mg/kg）建立雄性大鼠糖尿病模型,CON组经腹腔注射pH 4.2的枸橼酸钠缓冲溶液。两组雄鼠分别与健康SD雌鼠按1∶2比例交配。雌鼠分娩后,称量两组子代出生体重,并连续监测体重变化和进食量;采用自动血糖仪和血糖试纸检测空腹血糖水平;18和22周时进行葡萄糖耐量试验（Glucose tolerance test,GTT）和胰岛素耐量试验（Insulin tolerance test,ITT）;计算肝重/体重指数;全自动生化分析仪检测血脂水平。结果 STZ组子代出生体重和后期体重及每日进食量均始终显著低于CON组（P〈0.05或P〈0.01）;第18周,STZ组与CON组子代葡萄糖耐量及胰岛素耐量差异均无统计学意义（P〉0.05）;第22周时,STZ组子代葡萄糖耐量在第15、30、60 min显著高于CON组（P〈0.05）,胰岛素耐量在各检测时间点均显著高于CON组（P〈0.05）;STZ组与CON组子代肝重/体重指数差异无统计学意义（P〉0.05）;STZ组子代血清中甘油三酯含量明显低于CON组（P〈0.05）。结论父代高血糖对子代的出生体重和生长趋势有显著影响,且能显著改善子代的胰岛素耐量。发酵对普洱茶中游离咖啡因含量的影响
摘要：目的探讨普洱茶发酵过程中咖啡因的存在形式及游离咖啡因含量的变化,为监测茶叶发酵程度,控制茶品质量提供依据。方法应用低pH沉淀结合高效液相色谱法（HPLC）检测普洱茶发酵全程中6个主要发酵阶段[一翻、二翻、三翻、四翻、五翻样品和出堆样品（熟茶）]样品的游离咖啡因和结合咖啡因含量。结果普洱茶发酵过程中,游离咖啡因含量逐渐降低,从一翻样品的（2.555±0.104）%降至出堆样品的（1.878±0.049）%,超过1/4的咖啡因与茶中的其他组分相结合,形成结合咖啡因。结合咖啡因的含量不断增加,四～五翻期间增幅最大,从0.084%增至0.647%;出堆样品中结合咖啡因的含量最高,为0.703%。结论发酵过程中,普洱茶中的游离咖啡因含量逐渐降低。本实验为监测茶叶发酵程度,控制茶品质量提供了依据。
