A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备
摘要：目的 制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法 经溴化氰（CNBr）分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼（ADH）的连接作用和碳二亚胺（EDAC）的偶联作用下,与破伤风类毒素（Tetanictoxoid,TT）形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果 制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT（P约0.01）,结合物含量差异无统计学意义（P跃0.05）。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义（P跃0.05）。结论 成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。转人HLA-A2基因小鼠对adr亚型重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）的免疫应答
摘要：目的对汉逊酵母表达的adr亚型重组乙型肝炎（简称乙肝）疫苗（adr疫苗）进行免疫学特性与功能学研究。方法采用adr疫苗与酿酒酵母表达的重组乙肝疫苗（adw疫苗）免疫转人HLA-A2基因小鼠,免疫剂量2μg/0.2 ml,于初免3周后进行第2次免疫。于第2次免疫1周后,采血,分离血清,经ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体水平。同时取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用HLA-A2/WLSLLVPFV五聚体荧光标记流式细胞术分析细胞中特异性抗乙肝病毒表位的CTL比例。结果 adr疫苗与adw疫苗均可诱导转基因小鼠产生抗乙肝表面抗原抗体,且抗体水平差异无统计学意义（P〉0.05）,2种疫苗对转基因小鼠的体液免疫应答的增强作用相似;adr疫苗诱导的乙肝表面抗原特异性CTL应答作用较adw疫苗更明显（P〈0.05）。结论 adr重组乙肝疫苗（汉逊酵母）诱导转基因小鼠的体液免疫应答作用与现有adw疫苗相似,但其诱导机体产生细胞免疫应答的能力更显著,可能具有更加良好的预防HBV感染作用和前景。应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗
摘要：目的应用7.5 L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗。方法应用7.5 L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液。经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部（2010版）中《冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）》要求,进行疫苗全项检定。结果当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2×107个/ml,病毒滴度平均达8.33～8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒最高滴度可达9.02 lgLD50/ml。经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果;纯化后可去除90%以上杂蛋白。应用7.5 L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求。结论应用7.5 L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。壳聚糖纳米粒在乙型肝炎疫苗中的应用
摘要：目的比较包裹乙型肝炎（简称乙肝）的壳聚糖纳米粒与常规铝佐剂乙肝疫苗的免疫效果差异,并对壳聚糖佐剂的应用效果进行评价。方法采用离子交联法制备20、30及40μg/ml的包裹乙肝疫苗的壳聚糖纳米粒溶液,激光粒度分析仪测定纳米粒粒径和多分散系数,BCA法测定包封率;将BALB/c小鼠随机分为4组：铝佐剂对照组、空白纳米粒对照组、常规疫苗组和壳聚糖疫苗组,肌肉注射免疫小鼠,2μg/只,隔周免疫1次,共2次。采用全自动免疫发光分析仪对小鼠血清中乙肝表面抗体进行定量分析。结果制备的载乙肝疫苗壳聚糖纳米颗粒粒径为（262.7±10.8）nm,与空白壳聚糖纳米粒粒径相比,略有减小,多分散系数为（0.228±0.016）;随着抗原浓度升高、4℃放置3个月及反复冻融,纳米粒的包封率均未发生显著变化,可达80%左右;壳聚糖疫苗组在小鼠体内产生的表面抗体滴度最高可达1∶80 000以上,并从第8周起,与常规疫苗组间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论壳聚糖纳米粒作为新型疫苗佐剂,具有一定的应用价值和进一步研究的意义。重组胸腺素α1对流感疫苗的增效作用
摘要：目的探讨重组胸腺素α1（Recombinant human thymosinα1,rhTα1）对免疫低下小鼠接种流感疫苗后免疫应答效果的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为5组：疫苗组、环磷酰胺＋疫苗组、环磷酰胺＋疫苗＋rhTα1低浓度（0.2 mg/kg）组、环磷酰胺＋疫苗＋rhTα1中浓度（0.4 mg/kg）组、环磷酰胺＋疫苗＋rhTα1高浓度（0.8 mg/kg）组。经小鼠腹腔注射环磷酰胺,80 mg/kg,共3次,隔天给药;肌肉接种流感疫苗,1.8μg血凝素/只;皮下注射低、中、高浓度rhTα1,0.2 ml/只,每周2次,连续4周。动态监测各组小鼠血清血凝抑制（HI）抗体效价,并观察小鼠脾脏指数及脾脏形态学结构的变化。结果与疫苗组相比,环磷酰胺＋疫苗组小鼠体内HI抗体效价降低,脾指数降低,脾脏组织病理形态退化;与环磷酰胺＋疫苗组相比,环磷酰胺＋疫苗＋rh-Tα1各浓度组HI抗体效价升高,小鼠脾指数增加,脾脏组织病理形态明显改善。结论重组胸腺素α1可提高免疫低下小鼠流感疫苗接种的免疫效果,为寻找适合免疫低下人群的疫苗增强剂提供了有益的尝试。重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品的研制
摘要：目的制备重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品,并按《中国药典》三部（2010版）要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃（8周）、37℃（4和8周）后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗（CHO细胞）的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力检定的质控参考品。《中国生物制品学杂志》关于稿件优先数字出版的启事
摘要：为缩短学术周期，提高学术论文的时效性和影响力，争取创新性科研成果的首发权，《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网（CNKI）签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性
摘要：目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21（DE3）复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21（DE3）工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液的筛选
摘要：目的筛选冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液。方法分别以0.01 mol/L PBS和Earles液为缓冲液,右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸不同组合构成的冻干稳定剂,制备乙型脑炎减毒活疫苗半成品及冻干疫苗成品,观察在不同温度存放不同时间的稳定性,并检测不同配方冻干稳定剂的崩解温度（Tc）。结果 12种配方冻干稳定剂制成的疫苗半成品可在4℃1周内保持滴度稳定性,在25℃3 d内保持滴度无明显变化,3 d后滴度大幅下降;以0.01 mol/L PBS为缓冲液的稳定剂制备的疫苗的Tc值低于Earles液,以Earles液为缓冲液的D2和F2配方制备的冻干疫苗成品,在4℃及37℃放置1周后,滴度均〉5.7 logPFU/ml。结论已筛选出以Earles液为缓冲液,含右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸的稳定剂配方,用于制备冻干乙型脑炎减毒活疫苗具有良好的保护效果。重组腺病毒Ad5/F35-HF2S的构建及其鉴定
摘要：目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAd5/F35在Ad5/F35-BJ5183感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,经2轮扩增后,测定病毒滴度;采用PCR及Western blot法检测感染细胞中HF2S基因的转录及蛋白的表达。结果重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S及重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S经鉴定均构建正确;经包装及2轮扩增后,重组腺病毒Ad5/F35-HF2S病毒滴度可达1013IU/ml;经PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的HF2S基因能够在AD-293细胞中表达。结论已成功构建了表达HF2S基因的重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,为研究Grb2-SH2结构域在CML中的基因治疗和作用机制奠定了基础。豚鼠对EB病毒的易感性分析
摘要：目的 建立豚鼠感染EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）动物模型,分析EBV对豚鼠的易感性。方法 将EBV经鼻腔和口腔感染豚鼠,建立感染EBV动物模型。提取分离的豚鼠淋巴细胞总RNA,巢式PCR法检测EBNA1及BcLF1基因mRNA的表达水平;ELISA法检测豚鼠血清中抗EBVIgG抗体水平的变化。取豚鼠肝脏、肺、脾脏、腮腺进行病理分析。结果 10只模型组豚鼠中有6只检测到BcLF1基因mRNA的表达,其中有4只同时检测到了EBNA1和BcLF1基因mRNA的表达;经双酶切及测序鉴定,扩增的EBNA1及BcLF1基因大小与预期相符。10只豚鼠血清中VCAIgG和EBNA-IgG抗体水平均有所升高。模型组中有5只豚鼠的肝脏、肺、脾脏、腮腺的组织发生不同程度的病变。结论 豚鼠可作为EBV感染动物模型的备选动物。重组IL-17A耻垢分枝杆菌的构建及其对巨噬细胞表达炎症因子的影响
摘要：目的构建携带小鼠IL-17a编码基因的重组耻垢分枝杆菌（RecombinantMycobacteriumsmegmatis，rMs），并研究其对巨噬细胞表达炎症因子的影响。方法双酶切质粒pET28a／mlL-17a和pMFA41，转化感受态EcoliTOPl0，构建大肠杆菌．分枝杆菌穿梭表达质粒pMFA41／mIL．17a，电转化耻垢分枝杆菌mezl55，经SDS．PAGE和Westernblot鉴定表达产物。分别以MOI为10：1加入rMs、rMs＋anti-IL-17A、Ms感染小鼠巨噬细胞系RAW264．7，并设PBS对照组。荧光定量PCR法检测转染细胞中p防御素．2（DefensinB2，Defb-2）、巨噬细胞炎症蛋白（Macrophageinflammatoryprotein，MIP）．1a和MIP．213基因mRNA水平；ELISA法检测细胞培养上清中MIP-1α、MIP-213、IL-4及IFNγ蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pMFA41／mlL-17a经双酶切及测序鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白mlL－17A可与大鼠抗小鼠IL－17A单克隆抗体特异性结合，在相对分子质量约20000处可见特异性反应条带；rMs组RAW264．7细胞中Deib－2、MIP-１α、MIP-213基因mRNA水平较胍组及PBS组明显升高（P〈0．01）；rMs组细胞培养上清中MIP-la、MIP-213、IL4和IFN3,的蛋白浓度较胍组及PBS组明显升高（P〈0．01）。结论成功构建了表达具有生物学活性mIL－17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗，该疫苗可有效促进体外培养的巨噬细胞表达MIP、Defb2、IFN－γ及IL－4，为新型疫苗的研发奠定基础。大容量人源核糖体展示单链抗体文库的构建
摘要：目的构建大容量、多样性的人源核糖体展示（Ribosome display,RD）单链抗体（Singe chain Fv segment,scFv）库。方法收集20名健康献血者的新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA;设计兼并引物,利用RT-PCR分别扩增人抗体的VH-linker、Vκ、Vλ及Cκ基因;采用重叠PCR（SOE-PCR）技术,构建VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ单链抗体库;将VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ等量混合后,与pMD19-T载体连接,并转化感受态E.coli DH5α,对所构建的scFv库进行菌落PCR和测序分析。结果构建的核糖体展示单链抗体库重组率较高,转化产物经菌落PCR鉴定,均可见约1 000 bp的scFv基因片段,库容量为2.06×1013。经分析该抗体库单链抗体序列均完整,内部无终止密码子,可变区序列无一重复,多样性良好,均具有完整的体外核糖体展示框架。结论已成功构建了大容量、多样性好的人源核糖体展示单链抗体库,为进一步筛选高特异性、高亲和力的人源抗体奠定了基础。RNA干扰her-2基因对骨肉瘤细胞血管内皮生长因子-A和白细胞介素-8表达的影响
摘要：目的探讨her-2基因沉默对人骨肉瘤细胞株saos-2中血管内皮生长因子-A（Vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A）和白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）表达的影响。方法构建her-2 shRNA重组表达质粒,转染至骨肉瘤细胞株saos-2,同时设空白对照组和shNC阴性对照组;RT-PCR检测her-2、VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平;Western blot检测her-2蛋白表达的变化;ELISA法检测细胞培养液中VEGF-A和IL-8的分泌水平。结果构建的her-2 shRNA表达载体能抑制her-2基因的表达,对her-2基因mRNA的转录和蛋白表达的抑制率分别为63.05%和62.59%;转染重组质粒her-2 shRNA后VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平及蛋白分泌水平均显著降低（P〈0.01）。结论 her-2基因沉默后,VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平明显降低,her-2基因参与了骨肉瘤细胞VEGF-A和IL-8基因的表达调控,提示her-2基因可作为研究骨肉瘤血管生成分子机理的新靶点。水痘-带状疱疹病毒Oka株与临床分离株可变区基因的序列分析
摘要：目的对水痘-带状疱疹病毒（Varicella．zostervirus，VZV）Oka株（V-Oka株）与分离于临床水痘患者的野毒株进行可变区基因序列比对分析。方法提取V-Oka株和VZV临床分离株的基因组DNA，对其串联重复序列区（R区）进行PCR扩增和测序；将R3基因的纯化产物与pMDl8．T载体连接，转化感受态大肠杆菌JMl09，提取质粒，经双酶切鉴定及测序；将测序结果与GenBank中登录的V—Oka株基因序列进行比对分析。结果R1～R5基因扩增产物及R3基因重组质粒的双酶切产物片段大小均与预期相符；V—Oka株较稳定，测序结果与GenBank中登录的V-Oka株R1-R5基因序列一致，野毒株R区序列呈现多态性，与V-Oka株有差异，1t4区序列区别明显。结论水痘患者的致病毒株为野毒株；R4的重复单位拷贝数可为临床快速鉴别V—Oka株与野毒株提供科学的手段。人C-反应蛋白重组真核表达质粒的构建及其对人脐静脉内皮细胞LOX-1和TF表达的影响
摘要：目的构建人C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）重组表达质粒pTracer CMV2-CRP,并观察其在人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelical cells,HUVEC）中的表达及其对凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（Lectin-type oxidizedLDL receptor-1,LOX-1）、组织因子（Tissue factor,TF）表达的影响。方法以质粒pCR-BluntⅡ-TOPO-CRP为模板,PCR扩增CRP基因CDS序列,克隆至pTracer CMV2载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,构建重组表达质粒pTracer CMV2-CRP,转染HUVEC,设实验组（转染pTracer CMV2-CRP）、阴性对照组（转染pTracer-CMV2）及正常对照组,各组细胞经G418抗性筛选,RT-PCR及Western b1ot检测CRP基因的过表达效应及CRP的表达对HUVEC中LOX-1和TF转录及蛋白水平的影响。结果重组真核表达质粒pTracer CMV2-CRP经双酶切鉴定及测序证明构建正确。实验组细胞中,CRP基因过表达,且LOX-1和TF基因的转录及蛋白水平明显高于正常对照组和阴性对照组（P〈0.05）。结论已成功构建人CRP基因重组真核表达质粒pTracerCMV2-CRP,并在HUVEC中过表达CRP,且明显上调HUVEC中LOX-1和TF的表达,为进一步阐述CRP在动脉粥样硬化形成过程中的作用提供了新的实验依据。H2O2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响
摘要：目的观察H2O2对Apg-2与BCR／ABL蛋白亚细胞定位的影响。方法用50μmol／LH202分别处理BaF3-BCR／ABL、BaF3-MIGRl及过表达Apg-2蛋白的BaF3-BCR／ABL细胞，激光共聚焦显微镜观察细胞内Apg-2、BCR／ABL蛋白的亚细胞定位变化。结果Apg-2和BCR／ABL蛋白在细胞中定位于胞浆，H2O2损伤可致Apg-2和BCR／ABL蛋白在BaF3-BCR／ABL细胞中发生核转位，Apg-2蛋白过表达可引起BCR／ABL蛋白核转位。结论Apg-2蛋白在H2O2诱导的损伤后发生核转位，可能与BCR／ABL蛋白相互作用，保护H2O2诱导的细胞损伤。培养基营养调控对小球藻Chlorella protothecoides胞内生化成分积累的影响
摘要：目的研究调控异养培养基中碳源和氮源浓度对小球藻Chlorella protothecoides（C.protothecoides）胞内生化成分积累的影响。方法分别以葡萄糖为碳源（尿素初始浓度为3 g/L,葡萄糖浓度分别为10、20、30、40、50 g/L）、尿素为氮源（葡萄糖初始浓度为30 g/L,尿素浓度分别为3.00、0.00、0.15、0.30、0.45、0.60 g/L）,避光培养小球藻细胞,收集藻液,制备冻干藻粉。采用傅里叶变换红外光谱法（Fourier transform infrared spectroscgy,FTIR）测定小球藻胞内蛋白质、油脂和碳水化合物的变化。结果当培养基葡萄糖浓度为30 g/L,尿素浓度为3 g/L时,蛋白质吸收峰强度最大,相对含量较高,碳水化合物次之,油脂含量最低;与氮充足（3.00 g/L）条件下相比,氮缺失（0.00 g/L）条件下,蛋白质吸收峰强度骤然降低43.22%,油脂增高1.41倍,碳水化合物提高6.04%。结论培养基中不同碳、氮水平可实现胞内不同大分子组分（油脂、蛋白质和碳水化合物）产量的调控,满足不同层次的工业需求。
