风疹病毒松叶株全基因序列测定与分析
摘要：目的对我国现用风疹病毒（Rubella virus,RV）疫苗生产毒株松叶株（Matsuba）进行全基因组测序,分析其在减毒过程中的遗传与变异特点,为其安全性评价及遗传学质量控制的标准化提供依据。方法利用RT-PCR法分段扩增我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全序列,分别将产物插入到T-A克隆载体pGEM-T easy中,构建病毒cDNA文库,进行全基因组序列测定与分析。结果我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全长9 762 nt,含2个ORF,分别位于核苷酸41～6388位和6512～9700位,编码2 116、1 062个氨基酸;与GenBank中登录的Matsuba.GMK3野毒株和Matsuba疫苗株核苷酸同源性分别为97.5%和99.9%,氨基酸同源性分别为98.8%和99.9%;其在减毒的过程中共有37个氨基酸位点发生变异,其中非结构蛋白P150有18个氨基酸位点发生突变,结构蛋白E1和E2主要抗原位点氨基酸未发生变异,E1-177位糖基化位点突变丢失。结论我国现用风疹病毒Matsuba疫苗株与同类减毒株具有较高的同源性,其主要的抗原位点在减毒保种过程中高度保守,为在分子水平上保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据。β-丙内酯对甲型肝炎病毒的灭活效应
摘要：目的观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒（HAV）的灭活效应。方法采用1∶4 000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验。通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定最佳灭活时间;检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应。结果β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3 d后,检测不出病毒;β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12 d效果更好;两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640 EU/0.1 ml;免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100%,且对小鼠及豚鼠均无毒性。结论β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性。丙型肝炎病毒包膜蛋白E2中关键组氨酸位点突变体的构建与感染性
摘要：目的构建组氨酸（Histidine）位点突变的丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus，HCV）突变体，并检测其感染性。方法利用定点突变技术，分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸（A1anine），构建突变质粒H490A和H621A，采用盯体外转录法制备病毒RNA，通过电穿孔法导人Huh7．5．1细胞，免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性。结果H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确；体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7．5．1细胞中表达病毒蛋白，电穿孔效率高达90％以上；野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞，H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少，H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞。结论成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A，两种突变体病毒的感染性均显著降低。狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定
摘要：目的构建狂犬病病毒（Rabies virus,RV）SRV9株糖蛋白（Glycoprotein）基因的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）,并进行鉴定。方法将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度。结果酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确;电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构;PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带;Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带;经测定,重组病毒的滴度为106.25TCID50/ml,较Bartha-K61亲本株的滴度（107TCID50/ml）下降。结论成功构建了RV SRV9株糖蛋白基因重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础。狂犬病病毒SRV9株糖蛋白333位氨基酸变异对其免疫原性的影响
摘要：目的探讨狂犬病病毒（Rabies virus,RV）SRV9株糖蛋白（G）333位丝氨酸（S）分别突变为精氨酸（R）和谷氨酸（E）后,对其免疫原性的影响。方法采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异。结果 SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确;制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变;RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达;rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S（P〈0.05）。结论 RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性。埃可病毒6型分离株KM57-09VP1基因的遗传特征
摘要：目的分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型（ECHO virus 6,E6）KM57-09分离株VP1基因的遗传特征。方法采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序;采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对;采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接;采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较。结果分离株为E6,其VP1区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp;KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6%～96.0%之间,氨基酸同源性在95.2%～99.0%之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性最高,分别为96.0%和99.0%,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7%～80.9%和95.8%～97.2%;基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝。结论 KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝。乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
摘要：目的构建乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒,并筛选能有效抑制HBx表达的干扰序列。方法设计并构建针对HBx基因的3个siRNA表达质粒,经酶切和DNA测序鉴定,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜观察细胞转染效率,RT-PCR检测HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA的转录水平,Western blot检测HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达水平。结果酶切和测序鉴定质粒构建正确,插入片段的碱基序列符合实验设计;质粒转染HepG2.2.15细胞后,HBx基因的转录水平、相对表达量及HBx蛋白的表达水平均明显降低（P均〈0.01）,3个重组质粒均能抑制HBx蛋白的表达,且质粒shRNA-HBx3抑制能力最强。结论已成功构建了靶向HBx基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出具有高效沉默HBx基因的shRNA质粒,为进一步研究HBx感染合并肝细胞脂肪变性的发生发展奠定了基础。含Coiled-coil结构的PML结构域与CNPY2蛋白相互作用的胞内外验证
摘要：目的通过胞内外试验验证含Coiled-coil结构的PML结构域（PML-C）与CNPY2蛋白的相互作用。方法将质粒pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C共转化入酵母菌AH109,通过酵母双杂交技术检测CNPY2蛋白和PML-C在AH109细胞内的相互作用;构建重组质粒pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-CNPY2,共转染HEK293细胞,采用Western blot法检测细胞中CNPY2蛋白的表达;免疫共沉淀技术从胞外验证两种蛋白的相互作用。结果 pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C质粒共转化入AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;重组质粒pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-CNPY2共转染的HEK293细胞的全细胞裂解液可与鼠抗c-MYC单抗特异性结合;经免疫共沉淀可检测到与PML-C相互作用的蛋白复合体。结论通过酵母双杂交试验和免疫共沉淀技术证实,PML-C与CNPY2蛋白存在相互作用。重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白的表达、纯化及其活性
摘要：目的表表达并纯化重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白,并鉴定其生物学活性。方法将重组质粒pRSET-dsCARE转化大肠杆菌BL21（DE3）,分别于37、28℃表达目的蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE、Western blot、HPLC鉴定目的蛋白,MTT法检测dsCARE对转染poly（I∶C）细胞的增殖抑制作用。结果dsCARE重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中呈组成性稳定表达,平均每升培养基可收获湿菌体约10 g;纯化产物的SDS-PAGE纯度达95.8%;纯化的目的蛋白能与抗-His多抗发生特异性反应;HPLC纯度达95.1%;每10 g湿菌体可纯化dsCARE重组蛋白约7.5 mg,浓度约220μg/ml;纯化的dsCARE重组蛋白与转染poly（I∶C）的HeLa细胞共同孵育,可剂量依赖性抑制HeLa细胞的增殖活性。结论成功建立了重组dsCARE蛋白的表达、纯化工艺及活性鉴定方法,为其应用和后续研究奠定了基础。羊痒病病毒株对鼠神经瘤细胞的影响
摘要：目的研究羊痒病病毒株（22L）对神经瘤细胞（N2a）的影响，并建立研究朊病毒病的细胞模型。方法用感染22L的鼠脑匀浆感染正常的N2a细胞，经荧光倒置显微镜、电镜及HE染色对正常细胞和染毒细胞（N2a-22L）的形态和内部结构进行观察，并通过Westem blot检测细胞中朊病毒（Pfions，prp^Sc）的含量。结果镜下观察可见，N2a-22L细胞的神经突起较N2a细胞明显增多，并交织成复杂的网状结构；线粒体出现明显的空化，嵴消失；细胞体积减小，细胞核皱缩，细胞间通过突起连在一起，细胞核与细胞质界限模糊。N2a-22L细胞蛋白PrP经PK酶消化后，可见抗PK酶的PrP^Sc，N2a细胞的PrP蛋白均能被PK酶消化，表明N2a-22L已稳定感染了22L。结论N2a-22L细胞可作为研究朊病毒病的细胞模型，为研究朊病毒病发病机制提供了有效途径。发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响
摘要：目的探讨发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响。方法建立Wistar大鼠高血脂模型,通过灌胃不同剂量的发酵糙米提取物[100和300 mg/（kg.d）],观察对高血脂大鼠总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）、动脉硬化指数（Atherosclerotic index,AI）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione,GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）等生化指标的影响。结果发酵糙米提取物可显著降低高血脂大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL浓度和AI值,提高HDL浓度;增加血清和肝脏中GSH-Px和SOD的浓度,降低MDA的浓度。结论发酵糙米提取物对高血脂大鼠血清和肝脏的血脂水平具有良好的调节作用,且可提高抗氧化效果。《中国生物制品学杂志》关于稿件优先数字出版的启事
摘要：为缩短学术周期，提高学术论文的时效胜和影响力，争取创新性科研成果的首发权，《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网（CNKI）签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A对肿瘤细胞的靶向性作用
摘要：目的探讨重组促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A（Luteinizing hormone releasing hormone-pseudomonasexotoxin A,LHRH-PE40）与肿瘤细胞和正常细胞膜表面受体特异性结合的差异。方法常规培养Hep-2、A549及LO2细胞,通过细胞毒性试验观察LHRH-PE40对3种细胞的形态学影响及生长抑制作用;通过LHRH-PE40与LHRH受体的结合试验及LHRH对LHRH-PE40竞争性抑制试验,测定LHRH-PE40在不同细胞中膜表面受体结合的差异。结果 LHRH-PE40对Hep-2、A549细胞具有明显的杀伤作用,细胞收缩变圆,色暗,折光性差,裂解死亡,杀伤作用随LHRH-PE40浓度的增大而增强,IC50值分别为0.45和0.19μmol/L,而对LO2细胞毒性作用较弱;LHRH-PE40可与Hep-2和A549细胞受体结合密切,A490值较高,与两种细胞的结合力随着时间的延长而增加,与LO2细胞结合较弱;LHRH可以竞争性拮抗抑制LHRH-PE40与Hep-2、A549细胞的结合,结合力随着LHRH浓度的增高而递减,对LHRH-PE40和LO2细胞结合影响较小。结论 LHRH-PE40可特异性结合癌细胞表面LHRH受体,从而发挥对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。沃特世超高效合相色谱
摘要：2012年3月12日，沃特世ACQUITY Ultra Performance Convergence Chromatography系统上市。该技术克服了反相色谱（LC）和气相色谱（Gc）技术的局限，能完全替代正相色谱技术。新型的ACQUITYUPC^TM系统采用超高效合相色谱原理，为疏水化合物、手性化合物、脂类、热不稳定样品以及聚合物等的分析提供了强有力的工具。重组Kringle5蛋白发酵工艺的优化
摘要：目的建立优化重组Kringle5蛋白发酵工艺。方法应用高密度发酵法建立并优化含Kringle5表达载体的工程菌的发酵技术,采用紫外分光光度计检测菌体密度（A60）0,称量菌体干重,并经SDS-PAGE检测Kringle5蛋白表达量。结果重组Kringle5蛋白工程菌高密度发酵的优化条件为：BP-5菌种,2×YT培养基,30℃基础培养时间7 h,42℃诱导培养时间6 h,pH值为7.0,空气流量为1 vvm,溶氧控制大于50%,搅拌转速控制为800～1 200 r/min;目的蛋白占全菌总蛋白的38.4%,菌体干重达（14.28±0.11）g/L。结论已建立并优化了重组Kringle5蛋白的高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础。马流感病毒2个亚型单克隆抗体的制备及鉴定
摘要：目的制备马流感病毒（Equine influenza virus,EIV）2个亚型的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将马流感病毒甲1型A/equine/布拉格/56 H7N7（简称H7N7）和马流感病毒甲2型A/equine/miami/63 H3N8（简称H3N8）分别接种SPF鸡胚,收获尿囊液,纯化后免疫BALB/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0细胞进行融合,筛选阳性杂交瘤细胞,采用细胞培养法和体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。结果筛选出能稳定分泌EIV H7N7单抗和H3N8单抗的杂交瘤细胞各2株,分别命名为3C2-B2、2B7-3A7和5G10-G12、5A10-2E3-2G4。3C2-B2分泌的单抗重链为IgM,轻链为κ链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶512和1∶262 144;5G10-G12分泌的单抗重链为IgG2a,轻链为κ链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶1 024和1∶1 048 576。2个亚型的单抗均具有良好的特异性。获得的杂交瘤细胞株连续培养2个月,培养上清中的抗体效价保持不变;冻存1个月复苏后,培养上清中的抗体效价接近原始值。结论成功制备了EIV 2个亚型的单克隆抗体,为进一步研制EIV快速分型特异性诊断试剂及治疗制剂奠定了基础。结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品的研制
摘要：目的研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品。方法将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液;膜过滤法制备最低检出量和精密性（或重复性）参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数;对最低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价。结果阳性参考品由15份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由10份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,最低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌（H37R）v单细胞菌液组成,精密性（或重复性）参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌（H37Rv）单细胞菌液组成。结论研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制。表达TNFR-Fc的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺的放大及其活性检测
摘要：目的观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白（TNFR-Fc）的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性。方法采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积（10 ml、250 ml、1.5 L）,于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度;经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ELISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测。结果重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5 L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定;纯化的融合蛋白纯度在94%以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应。结论明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础。
