人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表达及纯化
摘要：目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus，HRSV）兰州株黏附蛋白（G）片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株（A亚型）中扩增G基因A们5．225片段，克隆至原核表达载体pET．42b（＋）中，构建重组表达质粒pET．42b．G，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后，进行SDS．PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增获得453bp的DN段；重组表达质粒pET-42b．G经双酶切及测序鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量为50230，表达量占菌体总蛋白的25％，以包涵体和可溶性两种方式存在；纯化后重组蛋白纯度可达95％以上，可与抗RSV．G蛋白单克隆抗体特异性结合。结论已成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了HRSV兰州株G片段。为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料。肺炎链球菌热休克蛋白ClpL的原核表达、纯化及抗原特性分析
摘要：目的原核表达并纯化肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia，S．pn）热休克蛋白ClpL，并评价其作为s．pn疫苗候选蛋白的可行性。方法PCR扩增S．pnD39全长ClpL基因，克隆至原核表达载体pET．28a（＋）中，转化E．coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，表达的重组ClpL蛋白经Ni．NTA亲和层析柱纯化后，免疫BALB／C小鼠，ELISA检测抗ClpL多克隆抗体的效价及亚型；Westernblot分析ClpL蛋白在5种常见spn中的保守性；流式细胞术及Westernblot分析ClpL蛋白在s．pn中的亚细胞定位。结果重组表达质粒pET．28a（＋）．ClpL经双酶切及测序证实构建正确；ClpL蛋白在E．coliBL21（DE3）中获得了可溶性表达，纯化后纯度达90％，浓度为4．97mg／ml；免疫小鼠可产生高滴度、高特异性的IgG抗体，以IgGl和IgG2b亚型为主；ClpL蛋白在5株常见Spn中均有表达；ClpL蛋白为分泌型蛋白，不表达于spn表面。结论原核表达并纯化了spnClpL蛋白，其作为一种在spn中保守存在的分泌型蛋白，可能是一种较好的疫苗候选蛋白。肠道病毒71型与甲型肝炎病毒灭活疫苗联合免疫效果的初步评价
摘要：目的初步评价肠道病毒7l型（Enterovirus71，EV71）与甲型肝炎病毒（Hepatitis Avirus，HAV）灭活疫苗联合免疫小鼠诱导的特异性免疫应答水平以及两种抗原间的相互作用。方法将HAV灭活疫苗和EV71灭活疫苗以不同剂量配比制成联合疫苗，免疫ICR小鼠后，通过ELISA法检测血清HAV抗体效价；固定病毒．稀释血清法检测血清EV71中和抗体效价；流式细胞术检测脾脏中淋巴细胞亚群CD4＋／CD8＋的百分率；ELISPOT法检测脾脏中淋巴细胞分泌IL．4和IFN~t的水平。结果初免后28d和加强免疫后7d，各组小鼠血清中EV71中和抗体阳转率均达100％，单价疫苗组和联合疫苗组EV71中和抗体效价均呈剂量依赖性；初免后28d，小鼠血清中能够产生保护性HAV抗体，加强免疫后抗体水平升高；联合疫苗组与相应的单价疫苗组间抗体水平差异无统计学意义（P〉0．05），未发现EV71与HAV的相互作用；初免后28d，各组小鼠脾脏中CD8＋细胞比例高于CD4＋细胞（P〈0．001），加强免疫后7d则相反（P〈0．001）；初免后28d，HAV全病毒和EV71多肽均不能刺激各组小鼠脾细胞产生阳性反应，加强免疫后7d，各组小鼠脾细胞分泌IL_4的水平均高于IFNy（P〈0．05o结论一定剂量的HAV和EV71联合疫苗可诱导小鼠产生良好的体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答，但相对较弱，未发现两种抗原间存在相互干扰或协同作用。征稿
摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管，中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办，是中华预防医学会系列杂志之一，月刊。不同剂量粉尘螨提取液对哮喘小鼠CD4＋CD25＋调节性T细胞的影响
摘要：目的探讨不同剂量粉尘螨提取液对哮喘小鼠CD4＋CD25调节性T细胞（RegulatoryTcells，Tregs）的影响，确定粉尘螨提取液免疫治疗的最佳维持剂量。方法用粉尘螨提取液经腹腔注射C57BL／6小鼠，建立过敏性哮喘模型，将32只哮喘小鼠随机分为4组：生理盐水组以及粉尘螨低（100μg／只）、中（1mg／只）和高（2mg／只）剂量组，治疗完成后，采用流式细胞术检测小鼠脾细胞中CD4＋D25＋F细胞及Foxp3＋CD4＋CD25＋Tregs的含量，ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-10、TGF-β1的水平。结果生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠脾细胞中CD4＋CD25＋T细胞占CD4＋T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组（P均〈0．05），而中剂量组与高剂量组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；生理盐水组、粉尘螨低剂量组脾细胞中Foxp3＋CD4＋CD25＋Tregs占CD4＋CD25＋T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组（P均〈0．05），而中剂量组与高剂量组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠血清中IL-10和TGF．131的水平均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组（P均〈0．05），而中剂量组与高剂量组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论中剂量粉尘螨提取液为哮喘特异性免疫治疗的最佳维持剂量。实验性自身免疫性神经炎中NKR-P1＋细胞对IL-12和IL-18协同作用的影响
摘要：目的探讨实验性自身免疫性神经炎（Experimental autoimmune neuritis，EAN）中IL-12和IL-18的协同作用以及NKR-P1＋细胞对该作用的影响。方法用200斗l免疫乳剂（含230p．g特异性肽段P253．78、2mg结核菌素、100μ1 PBS和100μ1弗氏不完全佐剂）免疫Lewis大鼠，建立EAN动物模型，在发病高峰期取出大鼠淋巴结，制备单核细胞悬液，在NKR-P1＋细胞存在或不存在的条件下，分别或同时与IL．12（20ng／m1）、IL．18（25ng／m1）共培养，同时加入20μg／mlP253．78刺激，孵育24h后，以1×107个活细胞／只鼠回输至正常Lewis大鼠体内，每天观察发病情况，并进行临床评分以及组织病理学检测，采用ELISA法检测细胞培养上清中IFNy、TNF-α和IL-4的分泌水平，淋巴细胞增殖试验检测P253-78特异性淋巴细胞的增殖反应。结果P253-78特异性淋巴细胞在IL-12或IL．18单独刺激下，可引发中等发病程度的EAN；而在IL-12和IL-18共同刺激下，引发EAN的发病程度明显加重；当删除淋巴细胞中的NKR．P1＋细胞后，可引发严重的EAN；而NKR．P1＋细胞删除后的P253．78特异性淋巴细胞与IL-12和IL-18共培养，其自身反应活性得到了抑制，并低表达IFNy／，从而抑制Thl细胞的分化。结论IL-12和IL-18的共同刺激能够增强P253-78特异性淋巴细胞的自身反应性；IL-12和IL．18能够诱导出高水平的IFNy／，从而促进Thl细胞的分化，其作用部分是通过NKR-P1＋细胞实现的。p115基因沉默对人胃癌BGC-823细胞迁移及侵袭能力的影响及其机制
摘要：目的探讨高尔基体囊泡转运蛋白（Golgi-vesicular transport protein）p115基因沉默对人胃癌BGC-823细胞侵袭能力的影响及其机制。方法采用脂质体法将质粒pGPU6／GFP／Neo／p115（p115shRNA）和阴性对照质粒（shNC）分别转染至BGC．823细胞中，并设空白对照组。转染后48h，采用RT-PCR、Westemblot和细胞免疫荧光法检测各组细胞中p115基因及蛋白表达的变化，及其对巨噬细胞游走抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）、基质金属蛋白酶-2（Matrix metallopro-teinase-2，MMP-2）、MMP-9基因和蛋白表达的调节；细胞划痕及Transwell小室试验检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果p115shRNA组细胞中p115、MIF、MMP-2、MMP-9在基因和蛋白水平的表达均较shNC组和空白对照组明显下降（P〈0．叭）；p115shRNA组细胞的划痕愈合能力明显低于两个对照组（P〈0．01）；p115shRNA组的穿膜细胞数明显低于两个对照组（P〈0．01）。结论在BGC．823细胞中，抑制P115的表达后，可能通过下调MIF、MMP-2、MMP-9的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭运动。COL1A1基因干扰对人结肠癌HCT-8细胞增殖的影响
摘要：目的探讨COLlAJ基因干扰对人结肠癌HCT．8细胞增殖的影响。方法将COLlAj基因干扰质粒pGPU6／GFP／Neo-COLlAJ（RNAiCOLlAJ）和阴性对照质粒pGPU6／GFP／Neo-shNC（PGNsN）瞬时转染入HCT-8细胞，并设空白对照组。转染后48～72h，采用半定量RT-PCR法检测COLIAJ基因在细胞中的转录水平；MTT法检测细胞的增殖活力；OF将各组细胞接种至BALB／c小鼠上皮组织中，每隔6d分别测量小鼠体内肿瘤大小。结果RNAiCOLIAj组HCT．8细胞COLIAJ基因的mRNA转录水平较PGNsN组和空白对照组显著降低（P〈0．01）。RNAiCOLlAJ组与PGNsN组和空白对照组比较，细胞的增殖活力有所降低，第4～7天差异有统计学意义（P〈0．05），其中在第5和第6天差异极显著（P〈0．01）。RNAiCOLlAJ组小鼠体内肿瘤大小与PGNsN组和空白对照组比较，前18d差异无统计学意义（P〉0．05）；在第24天，显著小于两个对照组（P〈0．05）；在第30天，差异极显著（P〈0．01）。结论COLIAJ基因被干扰后，能够抑制HCT-8细胞增殖，为COL1AJ成为癌症治疗的候选基因提供了实验依据。应用双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量
摘要：目的应用AOXl和GAP双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。方法用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切pMD18-T-HMPIDesB”质粒，回收含短C肽AAK并去掉B链第30位苏氨酸（T）的人胰岛素原类似物HMPIDesB”（Human mini-proinsulin desB”）片段，插入pGAPZaA载体中，构建重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB”，电转化至经质粒pPIC9K-HMPIDesB”异位整合的胰岛素原分泌菌株FJ-H。（pPIC9K-HMPIDesB”／GS115）中，应用抗生素法筛选高表达菌株，并进行发酵试验。结果重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB^30经双酶切及测序证实构建正确；经Zeocin筛选获得高表达量菌株FJ-H3。经30L发酵罐发酵，FJ-H3菌株人胰岛素原的表达水平可达1．6g／L，分别为FJ-H1菌株的1．6倍，FJ-H2菌株（pGAPZαA．HMP-IDesB^30／GS115）的5．3倍；经质谱分析，胰蛋白酶酶切后的目的蛋白相对分子质量与理论值相符。结论利用AOXl和GAP双启动子在毕赤酵母中高效表达了人胰岛素原类似物HMPIDesB^30，为实现胰岛素的规模化制备奠定了基础。细胞内病原体抗性基因1的原核表达
摘要：目的构建细胞内病原体抗性基因1（Intracellula rpathogen resistance1，Iprl）的原核表达质粒，并在大肠杆菌中进行表达。方法以pMD19-Tsimple-Iprl质粒为模板，采用PCR法扩增Iprl基因，克隆至表达载体pET．32a（＋）中，构建重组原核表达质粒pET．32a（＋）．Iprl，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和We8temblot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确；表达的重组Iprl蛋白相对分子质量约为70000，以1．5mmol／LIPTG诱导4h，目的蛋白的表达量最高，约占菌体总蛋白的16％，重组Iprl蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Iprl基因重组原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达了重组Iprl蛋白，为进一步探讨Iprl蛋白的功能及Iprl重组BCG的构建奠定了基础。BRIT1基因过表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响
摘要：目的探讨BRITl基因过表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。方法真核表达质粒pcDNA3．1（-）／BRITl经双酶切和测序鉴定后转染HeLa细胞，并设空载体转染组（阴性对照）和未处理组。转染后48h，采用RT．PCR和RealtimePCR法检测细胞中BRITl基因mRNA的转录和表达情况，Westernblot检测细胞中BRIT1蛋白的表达水平，流式细胞术分析细胞的凋亡情况。结果重组真核表达质粒pcDNA3．1（-）／BRIT1经双酶切和测序证实构建正确；转染48h后，可有效上调HeLa细胞中BRITl基因mRNA和蛋白的表达，细胞凋亡率[（12．37±0．19）％]较阴性对照组[（1．81±0．22）％]和未处理组[（2．06±0．10）％]明显增加，且差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论BRITl基因过表达能诱导人宫颈癌HeLa细胞体外凋亡，为进一步研究BRIT1基因在宫颈癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。胰岛新生相关蛋白肽对体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素水平的影响
摘要：目的探讨胰岛新生相关蛋白肽（Islet neogenesis associated protein-PP，INGAP-PP）对体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素水平的影响。方法取成人胰头癌患者手术中切除的胰腺组织正常胰尾部分，分离纯化胰岛进行体外培养，检测胰岛的生物学活性，并比较添加与不添加INGAP．PP培养的胰岛分泌胰岛素能力的变化。结果分离纯化的胰岛具有良好的生物学活性。在体外培养21d后，未添加INGAP．PP的胰岛分泌胰岛素的能力逐渐丢失，胰岛形态发生显著变化，细胞团崩解后细胞逐渐死亡；而添加了INGAP-PP的胰岛形态保持相对良好，且胰岛素分泌水平从培养的第6天起均显著高于未添加组（P〈0．05或P〈0．01）。结论INGAP-PP能显著促进体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素。靶向高迁移率族蛋白1基因的高效RNA干扰序列的筛选
摘要：目的筛选靶向晚期炎症因子高迁移率族蛋白1（High mobility group box 1 protein，HMGBl）基因的高效RNA干扰（siRNA）序列，并检测其体外生物学效应。方法选择针对HMGBl基因mRNA的3条不同序列，用1_7体外转录系统合成3条siRNA，转染RAW264．7细胞，6h后，加入500ng／ml脂多糖（Lipopolysaceharide，LPS）分别刺激24、48h，另设单纯LPS刺激组和只加培养液的对照组。采用RT-PCR检测各组细胞中HMGBl基因mRNA的转录水平，EusA检测细胞培养上清液中HMGBl的含量。结果体外合成的HMGBlsiRNA1～3经琼脂糖凝胶电泳分析，均可见21bp的RN段；经LPS刺激24和48h，RAW264．7细胞中HMGBl基因mRMA的转录水平和细胞培养上清液中HMGBl的含量与对照组相比均显著升高，3条HMGBlsiRNA均能抑制细胞中HMGBl基因mRNA的转录水平，并减少细胞培养上清液中HMGBl的含量，其中以HMGBlsiRNAl的效果最为明显。结论LPS可刺激RAW264．7细胞释放大量HMGBl，同时增加细胞中mRNA的转录水平；HMGBlsiRNA能有效降低HMGB1蛋白和mRNA水平，有望成为控制晚期炎症发展的新的治疗手段。干扰素及IL-6、IL-1β在肠道病毒71型感染过程中的作用
摘要：目的探讨干扰素（Interferon，IFN）及白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-1β在肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）感染过程中的作用。方法采用EV71-FY23，在IFNcdb、IFNkl和IFNy别存在的条件下感染Vero细胞及KMB17细胞，检测IFN对细胞的保护作用；建立EV71感染乳鼠模型，检测IFNα1b、IFNk1、IFNy／、IL-6及IL-1p的抗病毒作用。结果IFNaIb和IFNkl对EV71感染的细胞具有明显的保护作用，而IFNy的保护作用不明显；IFNcdb对感染EV71的乳鼠具有较好的保护效果，其在病毒感染之前的预处理方式产生的保护效果较为明显；IL-1β对感染EV71的乳鼠亦有不同程度的保护作用，而IL-6预处理方式不但无保护作用，反而加速了乳鼠的死亡。结论IFN和IL-1p对EV71感染具有保护作用，而IL-6无此作用。人白细胞介素-29基因的克隆及真核表达
摘要：目的克隆人白细胞介素．29（Interleukin-29，IL-29）基因并进行真核表达。方法提取人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA，经逆转录合成cDNA，以其为模板，PCR扩增IL-29基因，插入真核表达载体pPIC9K，构建重组真核表达质粒pPIC9K．29，转化毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达，经SDS．PAGE和Westernblot鉴定表达产物。结果扩增的IL．29基因序列与GenBank中登录的序列（NM-172140）相同；重组表达质粒pPIC9K．29经双酶切及测序证实构建正确；表达产物经SDS．PAGE分析，可见相对分子质量分别约30000和27000的特异蛋白条带，经Westernblot分析，均可与羊抗人IL-29多抗发生特异性反应。结论已克隆并在毕赤酵母GS115中表达了人IL-29，为进一步研究其生物学活性及其应用奠定了基础。茶多酚诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度及线粒体膜电位的变化
摘要：目的探讨茶多酚（Tea polyphenols，TP）诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度[Ca^2＋]及线粒体膜电位（Aattm）的变化。方法采用MTT法检测TP对GBC-SD细胞增殖的影响；AnnexinV．FITC／PI双染色，激光扫描共聚焦显微镜laser scanning cofocal microscopy，LSCM）观察TP对GBC．SD细胞凋亡的影响；Fluo．3AM和Rhodamine123染色标记，LSCM观察TP对GBC-SD细胞内[Ca^2＋]i及△ψm的影响。结果TP可明显抑制GBC-SD细胞增殖，并诱导细胞凋亡，且呈时间和剂量依赖性；TP能使GBC-SD细胞内[ca2＋]。增加，△Ⅲm降低，且呈剂量和时间效应关系。结论什对GBC．SD细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，其机制可能与其上调细胞内[Ca^2＋]i、降低△ψm有关。山葵提取物对结肠癌SW480细胞增殖及抑癌基因P16^INK4a mRNA转录水平的影响
摘要：目的研究山葵提取物对结肠癌SW480细胞增殖及抑癌基因P16^INK4a转录水平的影响。方法采用不同浓度的山葵提取物作用于SW480细胞48h后，MTT法检测其对SW480细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布的变化；RT-PCR检测抑癌基因P16^INK4a转录水平的变化。结果山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓度依赖性，IC50值约为130μmol／L；细胞的早期、晚期凋亡率呈浓度依赖性升高，细胞周期主要阻滞于G2期；细胞中抑癌基因P16^INK4a的转录水平下降，且呈浓度依赖性。结论山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用，并可诱导细胞凋亡；其通过抑制抑癌基因P16^INK4a的转录使细胞周期主要阻滞于G2期。乙型脑炎病毒SA14-14-2株和P3株单克隆抗体的制备及应用
摘要：目的制备乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）SA14-14-2株（简称SA）和P3株单克隆抗体，并进行初步应用。方法分别用JEVSA株减毒活疫苗和P3抗原免疫BALB／c小鼠，交叉加强免疫1次，取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，选择人血清白蛋白（HSA）抗体阴性、JEV抗体阳性的克隆进行2次亚克隆，制备腹水并纯化，对单抗及杂交瘤细胞进行鉴定。用sA单抗建立捕获ELISA法检测JEV抗体，竞争抑制ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测JEV抗原含量。结果经3次融合，共获得4株分泌抗JEVSA株单抗和3株分泌抗JEVP3株单抗的杂交瘤细胞株，未获得sA株和P3株共同决定簇的单抗；7株单抗均为IgGl型，特异性良好，但均无中和活性；SA株单抗的相对亲和力大小为：3D1〉5E3〉6H3〉4F12，均能识别sA相同的抗原表位；P3株单抗的相对亲和力大小为：1C7〉5H12〉3C4，均能识别P3相同的抗原表位；7株杂交瘤细胞于液氮中放置6个月及体外连续培养3个月后，制备的腹水抗体效价保持稳定；用5E3株sA单抗建立了检测JEV抗体的捕获ELISA法及检测JEV抗原的竞争抑制ELISA法和双抗体夹心ELISA法。结论已制备了JEVSA株和P3株单克隆抗体；以sA株单抗建立的捕获ELISA法检测JEV抗体比间接ELISA法更简便，且敏感性更高，对于抗原浓度高的样品，双抗体夹心ELISA法检测比竞争抑制ELISA法更有优势。
