“2010年版GMP与血液制品生产线设计 建造 管理＇＇研讨会通知
摘要：《2010年版GMP与血液制品生产线设计、建造、管理》研讨会由中国医学装备协会生物工程装备技术专业委员会主办，《中国生物制品学杂志》担任传媒支持。特邀中国药管药监部门、中国生物技术集团、中国医学科学院成都输血研究所等单位的资深专家和赛多利斯斯泰迪生物技术（北京）有限公司、GE医疗集团、西门子（中国）有限公司、WAVE生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗
摘要：目的采用WAVE生物反应器培养Vero细胞制备乙型脑炎病毒灭活疫苗。方法利用2LWAVE生物反应器和微载体经半连续方式培养Vero细胞，每24h取样，观察细胞生长情况，实时监测葡萄糖浓度。待细胞长至单层时，以0．03-0．5MOI接种乙型脑炎病毒。待细胞病变率达25％时，开始收获病毒液，病毒收获液经纯化后，制备乙型脑炎灭活疫苗，按《中国药典》三部（2010版）要求检测各项指标。结果Vero细胞培养至6d在微载体上长成致密单层，接种病毒后2d，细胞病变率达25％，开始收获病毒液，收获量为1L／d，可连续收获5-7d，总计5-7L病毒原液；病毒培养至第4天滴度达峰值，为8．54LgLD50／ml；制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部（2010版）要求。结论初步建立了WAVE生物反应器培养Vero细胞制备乙型脑炎灭活疫苗的方法。结核DNA疫苗质粒pVAXl-Rv3407的构建及体外表达
摘要：目的构建结核DNA疫苗质粒pVAXl-Rv3407，并检测其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法以基因重组卡介苗（rBCG）AERAS-422基因组为模板，PCR扩增Rv3407基因，构建真核表达质粒pVAXl-Rv3407，转染293T细胞，采用免疫荧光法及Westernblot法检测Rv3407蛋白的表达。结果PCR扩增获得长300bp的Rv3407基因片段；重组真核表达质粒pVAXl-Rv3407经双酶切及DNA测序证明构建正确；转染48h后，Rv3407蛋白在293T细胞中有效表达，且主要分布在细胞质中。结论成功构建了结核DNA疫苗质粒pVAXl-Rv3407，为新型结核病疫苗的研制奠定了基础。JTV1基因siRNA重组表达质粒的构建及其对K562细胞增殖的影响
摘要：目的构建JTV1基因siRNA重组表达质粒，转染K562细胞，鉴定其干扰作用。方法人工合成靶向JTVl基因的siRNA干扰序列，克隆至载体pGeneSil-1上，构建重组表达质粒pGeneSil-1-JTvl-1-1siRNA，转染人K562细胞，经G418稳定筛选后，采用RT-PCR及Westernblot法分别检测重组表达质粒对K562细胞中JTvl基因转录和翻译的影响；MTr法检测抑制JTVl基因的表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pGeneSil-1-JTVl-1-1siRNA经测序证明构建正确；其转染K562细胞后，细胞盯V1基因的转录和翻译水平均明显降低；抑制JTVl的表达可促进K562细胞增殖。结论已成功构建了pGeneSil-1-JTVl-1-1siRNA质粒，并获得了稳定的JTVl基因表达受抑的K562细胞克隆，为进一步研究JTVl基因的功能及其与肿瘤的相关性奠定了基础。A组人轮状病毒VP3基因的原核表达及鉴定
摘要：目的克隆并原核表达A组人轮状病毒（Rotavirus，RV）TB-Chen株结构蛋白VP3基因，并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB．Chen株VP3编码基因，克隆至pETL载体上，构建重组原核表达质粒pET-VP3，转化大肠杆菌BL21（DE3），并进行表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE及Westernblot鉴定后，对VP3基因进行分子系统进化及基因型分析。结果重组表达质粒pET-VP3经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为98000，以包涵体形式存在；重组VP3蛋白可被抗SAll株全病毒豚鼠免疫血清识别；迄今发现的A组RVVP3可分为7个基因型，TB-Chen株和SAll株VP3基因分别属于M2型和345型。结论成功原核表达了A组人RVTB-Chen株VP3蛋白，为进一步研究VP3的结构功能及开发新型RV疫苗、诊断试剂和治疗药物奠定了基础。乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒的构建及其对人正常肝细胞株L0_2增殖的影响
摘要：目的构建乙型肝炎病毒X蛋白基因荧光真核表达质粒，并检测HBx对人正常肝细胞株L0：细胞增殖的影响。方法以pcDNA3-HBV质粒为模板，PCR法扩增HBx基因编码区全长序列，将其克隆至plRES2-EGFP荧光真核表达载体中，构建重组真核表达质粒plRES2-EGFP-HBx，转染L0：细胞，筛选稳定表达HBx的细胞，RT-PCR法检测细胞中HBx基因mRNA的转录水平；Westernblot法检测细胞中HBx蛋白的表达水平；MTr法检测细胞的增殖活力。结果重组荧光真核表达质粒plRES2-EGFP-HBx经双酶切和测序证明构建正确，转染该质粒的L0：细胞可检测到HBx基因mRNA的转录及蛋白的表达，与空质粒pIRES2-EGFP转染的L0,细胞相比，增殖活力明显提高。结论成功构建了HBx基因荧光真核表达质粒，并获得了能稳定表达HBx蛋白的L0：细胞株，为进一步研究HBx对细胞周期调控通路的影响及探索HBx导致的与HBV相关的HCC的分子机制奠定了基础。激活素受体相互作用蛋白1及2在小鼠巨噬细胞中的表达
摘要：目的探讨激活素受体相互作用蛋白（Activinreceptor-interactingprotein，ARIP）1及2（ARIPl，2）在小鼠巨噬细胞RAW264．7中的表达及作用。方法采用免疫细胞化学染色法检测RAW264.7细胞中ARIPl，2的表达；将质粒CAGA-1ux、CMV-gal分别与表达质粒pcDNA3-ARIPl、pcDNA3-ARIP2或空质粒pcDNA3共转染RAW264．7细胞，应用激活素A刺激，检测细胞内报告基因转录荧光素酶的活性；实时定量RT．PCR检测ActRⅡAmRNA的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示，小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞表达ARIPl，2；RAW264．7细胞过表达ARIPl，2均能抑制ActivinA诱导的特异基因转录；过表达ARIP2可抑制RAW264．7细胞ActRIIAmRNA的表达，而过表达ARIPl对ActR11AmRNA的表达无明显影响。结论ARIPl，2在小鼠巨噬细胞中共表达，并具有下调激活素信号传导的作用，但其作用方式不同。稳定表达RAS鸟苷酸释放因子2肺癌细胞株的建立
摘要：目的构建带有GFP标签的RAS鸟苷酸释放因子2（RASguaninenucleotidereleasingfactor2，RASGRF2）真核表达质粒，并建立稳定表达RASGRF2的肺癌细胞株。方法用Sgf I和NotI双酶切RASGRF2-pCMV6-Myc-DDK质粒，回收RASGRF2基因片段，亚克隆入pCMV6．GFP载体中，构建重组表达质粒RASGRF2-pCMV6-GFP，转染肿瘤细胞H1299，倒置荧光显微镜下观察RASGRF2蛋白的定位。经G418筛选并建立稳定表达RASGRF2的细胞株，RT-PCR及Westemblot法检测RASGRF2的表达。结果经双酶切及测序证实RASGRF2基因成功克隆至真核表达载体pCMV6-GFP中；重组RASGRF2-GFP蛋白在H1299细胞中主要在胞质中表达；经RT-PCR及Westernblot证实，RASGRF2在H1299细胞中稳定表达。结论成功建立了稳定表达RASGRF2基因的肺痛细朐株．为讲一步研奔RASGRF2基因的功能蓖审了某础．人颗粒酶A全长基因的克隆及原核表达
摘要：目的克隆人颗粒酶A（GranzymeA，GzmA）基因，在大肠杆菌中进行表达，并初步优化表达条件。方法通过RT-PCR扩增人GzmA基因，插入原核表达载体pET24a（＋）中，构建重组表达质粒pET24a-GzmA，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定，并对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和开始诱导时菌液A。值进行优化。结果重组表达质粒pET24a-GzmA经双酶切和测序，证实GzmA基因已正确插入载体中，且序列正确；表达的重组蛋白相对分子质量约29000，且可与小鼠抗His单抗特异性结合；工程菌的最佳诱导温度为37℃，IPTG浓度、诱导时间和开始诱导时菌液A600值对重组蛋白的表达量影响较小。结论成功克隆了人GzmA基因，并在大肠杆菌中进行了表达。Hedgehog信号通路在胃癌侵袭转移中的作用及分子机制
摘要：目的探讨Hedgehog（Hh）信号通路与上皮间质转换（Epithelial-mesenchymaltransitions，EMT）在胃癌侵袭转移中的作用及分子机制。方法分别用环靶明、SnailsiRNA、空质粒及环靶明＋SnailsiRNA的混合物处理人胃癌SGC．7901细胞，并设常规培养对照组，48h后，采用RT．PCR法检测各组细胞中Glil、Snail及E．cadhefin基因mRNA的转录水平；Transwell小室试验检测细胞侵袭能力的变化；异质黏附试验检测各处理因素对细胞异质黏附能力的影响。结果与对照组相比，环靶明干扰组和联合干扰组细胞Glil基因mRNA的转录水平明显降低（P〈0．05），环靶明干扰组、SnailsiRNA组及联合干扰组Snail基因mRNA的转录水平明显降低（P〈0．05），而E-cadhenn基因mRNA的转录水平明显升高（P〈0．05）；环靶明干扰组、SnailsiRNA组及联合干扰组中细胞的侵袭能力及异质黏附能力明显低于对照组（P〈0．05）。结论Hh信号通路可能通过Glil调控Snail而参与调控EMT的过程，从而在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用。骨髓间充质干细胞对实验性肝纤维化大鼠的作用及其机制
摘要：目的探讨骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）移植后对实验性肝纤维化大鼠的作用及其机制。方法直接贴壁法分离纯化雄性SD大鼠BMSCs；将30只雌性SD大鼠分为3组：正常组、肝纤维化模型组和BMSCs移植组，模型组和BMSCs移植组经皮下注射40％四氯化碳（CCL4），每周3次，复制大鼠肝纤维化模型，建模8周后，BMSCs移植组经尾静脉移植2×10^[6]个BMSCs，3d后再次移植相同剂量的BMSCs，12周后处死各组大鼠，取外周血，分离血清，检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平；取肝组织进行HE、VG染色，观察肝脏病理变化；免疫组化法和荧光定量PCR法检测肝组织中I型胶原（TypeIcollagen，ColI）和胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）的表达，荧光定量PCR法检测TGFβ1和Smad3mRNA的表达。结果BMSCs移植组较模型组大鼠肝组织纤维化程度明显加重；BMSCs移植组ALT和AST水平较模型组明显升高（P〈0．05），ALB水平较模型组明显降低（P〈0．05）；ColI和GFAP在模型组和BMSCs移植组纤维条索中有大量表达，BMSCs移植组中ColI和GFAPmRNA及蛋白的表达量明显高于模型组（P〈0．05）；模型组和BMSCs移植组中TGFβ1和Smad3mRNA的表达量明显高于正常组（P〈0．05），且BMSCs移植组中TGFβ1和Smad3mRNA的表达量明显高于模型组（P〈0．05）。结论BMSCs移植可加重大鼠肝纤维化，BMSCs通过上调TGFB／Smad信号传导通路的TGF~I和Smad3的表达促进肝纤维化的进展。IL-17、TGF-β、IL-6mRNA在感染猪附红细胞体小鼠脾脏中的表达
摘要：／目的检测BALB／C小鼠感染猪附红细胞体（Mycoplasmasuiz）后脾脏中白细胞介素．17（Interleukin．17，IL-17）、转化生长因子一13（Transforminggrowthfactor-13，TGF-B）、白细胞介素．6（IL-6）的变化。方法用纯化的猪附红细胞体感染BALB／c小鼠，设生理盐水对照组，分别于感染后1、3、5、7、9d后，无菌采集脾脏，RT-PCR法检测小鼠脾脏中IL-17、TGF-B、IL．6mRNA的表达。结果小鼠感染猪附红细胞体后第1、3、5、7、9天，脾脏中IL-17和IL-6mRNA的表达量均明显高于对照组（P〈0．05），且分别于第5、7天达峰值；感染后第1、3、5、7天，TGF-BmRNA的表达量均高于对照组（P〈0．01），且于第3天达峰值；IL-17与IL-6的变化趋势呈正相关r=0．568），TGF-B与IL-6的变化趋势呈负相关r=-0．645）。结论小鼠感染猪附红细胞体后出现IL-17、TGF-B、IL-6水平升高的现象，且分别于第5、3、7天达峰值。本研究为附红细胞体病免疫调节机制的研究提供了实验依据，也为临床免疫治疗奠定了理论基础。抵抗素在非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗中的作用
摘要：目的探讨抵抗素（Resistin）在非酒精性脂肪肝（Nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）大鼠胰岛素抵抗（Insulinresistance，IR）中的作用。方法采用改良高脂饲料喂养大鼠建立NAFLDIR大鼠模型，以基础饲料喂养的大鼠作为对照组。分别于开始造模后6、8、10周分别采集2组大鼠血清及肝脏组织，测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、空腹血糖（Fastingplasmaglucose，FPG）和空腹胰岛素（Fastinginsulin，FINS）含量，并计算胰岛素敏感性指数（Insulinsensitivityindex，ISI）；HE染色观察肝脏病理学改变；RT-PCR和Westernblot检测肝组织中胰岛素受体底物．2（Insulinreceptorsubstrate-2，IRS-2）、抵抗素（Resistin）和核因子（NF-KB）基因的mRNA转录水平和蛋白的表达水平，并进行相关性分析。结果改良高脂饲料喂养的大鼠一般状况发生改变，显示模型复制成功；TG、TC、ALT和AST值的测定及肝组织学检查证实模型组大鼠存在高血脂和肝功损害，且有IR的现象存在；与对照组比较，模型组Resistin和NF-KB的mRNA转录水平和蛋白表达水平均明显增高，且呈时间依赖性（P〈0．05），Resistin与NF．KB的表达呈正相关；IRS-2的mRNA转录水平和蛋白表达水平逐渐下降，且呈时间依赖性（P〈0．05），与Resistin的表达呈负相关。结论NAFLD中IR的发生可能与胰岛素信号通路有关，涉及其始动因素IRS-2的减少和Resisfin的增加。Resistin不仅能抑制IRS的磷酸化而影响胰岛素上游信号的正常传导，还可能通过激活NF-KB抑制其下游通路的传导，而加重IR反应。p16基因真核表达质粒的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达
摘要：目的构建p16基因真核表达质粒，并鉴定其在骨肉瘤U-20S细胞中的表达。方法提取HeLa细胞总RNA，扩增p16基因，克隆至真核表达质粒pcDNA3-HA中，构建重组表达质粒pcDNA3-HA-p16，转染U-20S细胞，免疫荧光及Westernblot法鉴定p16／HA的表达。结果重组表达质粒pcDNA3-HA-p16经双酶切及测序证实构建正确；p16／HA在U-20S细胞中成功表达，且主要分布于细胞核。结论成功构建了p16基因真核表达质粒，并在U-20S细胞中成功表达。FTY720对Hep-2细胞增殖抑制及诱导程序性死亡作用
摘要：目的探讨FTY720对体外培养的Hep-2细胞增殖抑制及诱导程序性死亡作用。方法用不同浓度的兀Y720（800、1600、3200ng／m1）处理Hep．2细胞，48h后，采用MTr法检测细胞的增殖活力；瑞士．姆萨染色观察细胞形态的变化；流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。结果FTY720对Hep．2细胞增殖的抑制率呈剂量依赖性，当FTY720浓度为3200ng／ml时，Hep-2细胞的增殖受到明显抑制，抑制率为（60．900士0．071）％（P〈0．05）；经FTY720处理的细胞出现程序性死亡形态；FTY720可将Hep-2细胞阻滞于G2期，1600ng／mlFTY720组细胞的凋亡率明显升高（P〈0．05）。结论一定浓度的FTY720能明显抑制体外培养的Hep-2细胞增殖，调节细胞周期，并诱导其发生程序性死亡。牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及初步应用
摘要：目的制备牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV）gB蛋白单克隆抗体，并建立双抗体夹心ELISA方法。方法应用重组IBRVgB蛋白免疫BALB／C小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，利用IBRV全病毒免疫家兔制备多克隆抗体，采用方阵滴定法确定兔抗IBRVIgG多抗与单抗的最适工作浓度，建立双抗体夹心EHSA检测方法，并对该方法进行灵敏度和特异性验证。结果获得了1株稳定分泌抗IBRVgB单抗的杂交瘤细胞株，命名为2C4；兔抗IBRVIgG多抗和单抗的最适工作浓度分别为2．6209和2．6341I,zg／ml，酶标二抗的最适稀释度为1：30000；应用建立的双抗体夹心ELISA法对100份IBRV阳性血清样品进行检测，结果均呈阳性，符合率为100％；检测牛口蹄疫病毒、牛流行热病毒、牛副流感3型病毒的结果均呈阴性。结论成功制备了IBRVgB蛋白单克隆抗体，并建立了IBRV双抗体夹心ELISA检测方法，可用于牛传染性鼻气管炎的诊断和流行病学调查。麻疹减毒活疫苗接种偶合麻疹野病毒感染病例的麻疹病毒基因特征分析
摘要：目的分析1例接种麻疹减毒活疫苗第9天出现麻疹样症状病例的麻疹病毒基因特征，以确定是麻疹疫苗相关病例还是偶合麻疹野病毒感染。方法提取该病例咽拭子标本核酸，采用RT-PCR法扩增麻疹病毒核蛋白（Nucleoprotein，NP）基因羧基末端450个核苷酸片段后测序，分析其与全球24个基因型麻疹野病毒代表株、中国疫苗株（Shanghai-191）基因的亲缘关系以及核苷酸、氨基酸序列同源性。结果该病例感染的病毒属于H1a基因亚型麻疹野病毒。与中国H1基因型麻疹野病毒流行株代表株核苷酸和氨基酸序列的同源性较高，分别为97．5％-99．5％和96．6％，而与麻疹病毒中国疫苗株（Shanghai-191）核苷酸和氨基酸序列同源性较低，分别仅为91．2％和86．7％。结论该例接种麻疹减毒活疫苗后出现麻疹样症状的病例为偶合H1基因型麻疹野病毒感染所致，非麻疹疫苗相关病例。异基因造血干细胞移植受者外周血单核细胞趋化蛋白-2和IL-12水平变化与急性移植物抗宿主病的相关性
摘要：目的探讨异基因造血干细胞移植（allogeneichemapoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT）受者外周血单核细胞趋化蛋白．2（Monocytechemoattractantprotein-2／C-Cmotifligand8，MCP-2／CCL8）和白细胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）水平变化与急性移植物抗宿主病（acutegraftversushostdisease，aGVHD）的相关性，为临床早期诊断aGVHD提供可靠指标。方法20例行allo．HSCT的患者（实验组）和16例行自体造血干细胞移植患者（对照组）在预处理前（移植前14d）、预处理后回输干细胞前（移植前ld）、移植后连续8周每周1次采用ELISA法检测患者血清中MCP-2和ILl2水平；对发生aGVHD的患者，在临床症状出现后检测次数调整为每周2次。结果对照组和实验组患者血清中MCP-2和IL-12水平在预处理前与预处理后回输干细胞前比较，均无明显变化（P〉0．05）。对照组和实验组患者移植后7d时血清中MCP．2和IL-12水平与预处理后回输干细胞前时比较，也无明显变化（P〉0．05）。实验组中有6例患者发生aGVHD，于移植后16-52d出现aGVHD临床症状，与移植后7d时比较，血清中MCP-2和IL-12水平首次升高时间早于其临床症状出现时间；6例aGVHD患者在诊断时血清中MCP-2和IL-12水平较移植后7d时明显升高（P〈0．05），经抗aGVHD治疗获得缓解后，上述指标又较诊断时明显下降（P〈0．05）；实验组aGVHD患者血清MCP-2、IL-12水平首次升高时间分别为移植后11-46d和11-49d，此段时间内血清MCP-2、IL-2水平显著高于此段时间内未发生aGVHD组和对照组（P〈0．05）。实验组未发生aGVHD患者在造血干细胞回输后的第2-8周血清MCP-2、IL．12水平与预处理后回输干细胞前时比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论MCP-2和IL-12与aGVHD具有相关l生，且其水平变化时间早于临床症状出现时间，检测血清中MCP-2和IL-12水平有助于aGVHD发生的早期诊断。
