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中国生物制品学 2011年第11期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统的构建及表达1249-1253

摘要：目的构建恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统并进行表达。方法应用基因重组技术构建含p届25基因的醇氧化酶启动子1（Alcoholoxidasepromoter1，AOXl）重组质粒pICpfs25和三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAP）重组质粒pGAPpfs25，取酶切鉴定和测序正确的重组质粒电转化毕赤酵母菌GSll5，获得毕赤酵母重组体ICpfs25和GAPpfs25，并构建含两种启动子的酵母重组体IC-GAP／2pfs25，甲醇诱导pfs25基因表达，Westernblot分析表达产物的反应原性，ELISA分析各重组体表达上清中Pfs25蛋白的含量。结果各重组体的表达产物经SDS-PAGE分析均可见相对分子质量约25000的Pfs25蛋白条带，双启动子重组体Pfs25蛋白的表达量约占表达上清的70％，明显高于单一启动子重组体，且双启动子重组体Pfs25蛋白的表达量随着补加甲醇量的增加而逐渐增加；各重组体的表达产物均可与小鼠抗Pfs25单抗487特异性结合；双启动子重组体表达上清的ELISA反应明显强于其他重组体表达上清。结论已构建了恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统，两种启动子共同作用可明显提高目的蛋白的表达量。

HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽的原核表达及纯化1254-1258

摘要：目的原核表达并纯化HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽skl、sk2、sk3及3条肽段串联序列。方法用普通PCR及重叠延伸PCR法从HIV，1B亚型质粒扩增得到skl、sk2、sk3基因序列及3条肽段基因片段的6种连接序列，并分别克隆人原核表达载体pET-32a（＋）及pGEX4T-2中，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经Ni-NAT或谷胱甘肽．Sepharose-4B层析柱亲和层析纯化。SDS-PAGE分析融合肽的表达，Westernblot分析融合肽的抗原性。结果分别以pET-32a（＋）和pGEX4T-2为载体，共构建了18个重组表达质粒；his-skl、his．skl23、his-sk213、his-sk231及GST．sk3、GST-skl23、GST-sk213分别在pET-32a（＋）及pGEX4T．2表达载体中以可溶形式表达，且均能与HIV．1阳性血清反应，而不能与H1VDNA-天坛疫苗免疫血清反应；经大量诱导表达纯化后，GST．sk3表达量最高，可达40mg／L，纯度超过90％。结论已成功表达并纯化了具有生物学活性的HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽，为研制HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别诊断试剂盒奠定了基础。

重组复杂蛋白快速表达体系的建立1259-1263

摘要：目的建立重组复杂蛋白快速表达体系。方法利用定点整合技术建立定点整合宿主细胞库，分别以X-Fc融合蛋白和人凝血因子Ⅷ（FⅧ）为研究对象进行定点整合转染和表达分析。结果通过定点整合转染建立了高表达的宿主细胞库；x-Fc融合蛋白和人FⅧ均在宿主细胞中获得了高表达，X-Fe融合蛋白的表达量为220mg／L，人FⅧ在有血清培养条件下的酶活性为2IU／ml，且细胞株表达稳定，易于扩大培养。结论已成功建立了基于CHO细胞定点整合的重组复杂蛋白快速表达体系，该体系在克隆效率和时间上具有很大优势，可实现蛋白的有效快速表达。

表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的重组腺病毒的构建及其免疫原性1264-1268

摘要：目的构建表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的重组腺病毒，并检测其免疫原性。方法从质粒pMDl9T-simple-NA中扩增NA基因，克隆至穿梭质粒pShuttleCMV中，经同源重组获得重组腺病毒质粒，转染Ad．293细胞，包装出重组腺病毒Ad-NA，RT．PCR和免疫荧光法检测NA基因在Vero细胞中的转录和表达。CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒，免疫小鼠，ELISA法检测免疫小鼠血清中抗NA抗体滴度。结果重组腺病毒质粒经PacI酶切鉴定表明带有目的基因的穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中；NA基因在Vero细胞中成功转录和表达；重组腺病毒可刺激小鼠产生抗NA抗体，初免后4周，抗体水平达最高，为1：100000。结论成功构建了表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白的重组腺病毒，其可刺激小鼠产生有效的免疫应答，为甲型HINl流感病毒基因工程疫苗的研发奠定了基础。

分枝杆菌噬菌体D29裂解酶gp10的原核表达及抗脓肿分枝杆菌活性1269-1272

摘要：目的克隆并原核表达分枝杆菌噬菌体D29裂解酶gplO基因，观察重组蛋白对脓肿分枝杆菌的抑菌作用。方法以噬菌体D29基因组DNA为模板，PCR扩增gpl0基因片段，克隆至pET-32a（＋）载体上，构建重组原核表达质粒pET-32a-gpl0，转化EColiBL21（DE3），IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，亲和层析纯化后，采用杯碟法检测其抑菌活性。结果PCR扩增获得长1454bp的gpl0基因片段，重组表达质粒pET-32a-gpl0经PCR、双酶切及测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为54800，表达量占菌体总蛋白的97．4％，破菌上清及破菌沉淀中均可见目的蛋白的表达，纯化后纯度可达90％，浓度为0．5mg／ml；重组蛋白对脓肿分枝杆菌有抑菌作用。结论已成功表达重组分枝杆菌噬菌体D29裂解酶gpl0，其对脓肿分枝杆菌具有抑菌作用，为抗脓肿分枝杆菌及其他非结核分枝杆菌感染新药物的研制提供了依据。

抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化1273-1277

摘要：目的构建抗肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-d，TNF．仅）单链抗体（Singlechainfragmentvariable，scFv）的原核高效表达体系，并优化表达条件。方法在引物中添加编码6×His的核苷酸片段，使目的蛋白C．末端带有6xHis标签。从质粒pCANTAB5E-seF中PCR扩增scFv基因，连接至pBV220载体，连接产物分别转化至E．coliBL2l（DE3）和DH5ct中，42％诱导表达，并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化，Westernblot分析表达产物的反应原性。结果PCR扩增出的scFv基因片段长度约770bp，且序列正确；重组表达质粒pBV220．scFv经酶切鉴定证明构建正确；在EcoliBL2I（DE3）中可获得表达，在E．coliDH5c~中不表达；表达的重组scFv相对分子质量约为28000，以包涵体形式存在于胞浆中，表达量约占菌体总蛋白的15％，且可与抗His．Tag抗体发生特异性反应；工程菌的最佳诱导表达条件为：以EcoliBL21（DE3）为宿主菌，在pH7．4的LB培养基中，42℃诱导5h。结论将scFv的表达载体更换为pBV220，可提高scFv的表达量，在优化表达条件下，scFv的表达水平进一步提高。

Notch2胞内段基因过表达对K562细胞增殖的影响及其机制1278-1281

摘要：目的探讨外源性Notch2胞内段基因过表达对慢性粒细胞白血病（Chronicmyeloidleukemia，CML）细胞株K562增殖的影响及其机制。方法将携带Notch2胞内段（ICN2）基因的质粒转染K562细胞，MTY法检测细胞的增殖；流式细胞仪检测细胞的细胞周期分布；RT-PCR检测Notch2基因全长mRNA的转录，Westernblot检测Notch2蛋白的表达；RT-PCR检测Notch通路下游靶基因Hesl、Heyl及细胞增殖、凋亡相关基因numb、Bcl-2、NF-KB和TGF．131的mRNA转录水平。结果与未转染组相比，转染组K562细胞数量减少，增殖显著受抑（P〈0．01）；转染48h后的K562细胞G，期细胞比例显著增多（P〈0．01），S期细胞比例显著减少（P〈0．01）；Notch2基因mRNA及下游靶基因Hesl和HeylmRNA转录水平均明显增强（P〈0．01），Notch2蛋白表达量增加（P〈0．01）；numb基因mRNA转录水平无变化；Bcl-2表达下调，NF-KB和TGF．母1表达上调。结论Notch2胞内段基因过表达可抑制K562细胞增殖，其机制可能是通过上调TGF-B1和NF-KB基因表达及下调Bcl．2基因表达，将细胞阻滞于G1期来实现的。

四川地区供浆员中肠道病毒71型中和抗体效价的分布1282-1284

摘要：目的通过检测EV71中和抗体效价（EV71．NT），对四川地区供浆员中EV71-NT的分布进行分析。方法应用基于细胞病变抑制的EV71．NT检测方法，检测四川地区349份健康人血浆的EV71．NT，同时用肠道病毒（EV）71型抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）检测其EV71抗体，并分析二者的相关性；检测四川地区21817份健康人血浆中EV71-NT的分布。结果该EV71-NT检测方法具有较好的重复性，测定高效价和低效价EV71中和抗体标准品的变异系数分别为30．9％和33．6％；该方法与ELISA法的相关陛较差（r：0．024）；四川地区21817份健康人血浆中含高效价EV71中和抗体的比例在7．1％～18．4％之间，EV71高效价血浆占10．3％。结论在四川地区供浆员血浆中含有一定比例的高效价EV71中和抗体，可以直接从自然感染人群中筛选EV71抗体血浆进行EV71特异性免疫球蛋白的研制。

DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响1285-1289

摘要：目的探讨DN．ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法RT．PCR法检测MDA．MB．231细胞中ALK2基因mRNA的转录；分别以腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞，并设空白对照组，通过MTr法、平板集落形成试验、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验检测细胞的增殖、集落形成、迁移及侵袭能力。结果MDA-MB-231细胞中内源性表达ALK2。腺病毒DN．ALK2和RFP感染MDA．MB．231细胞36h后，荧光表达量一致，约为70％。MDA．MB-231／DN-ALK2细胞中高表达DN．ALK2。与MDA．MB．231／RFP组相比，MDA．MB．23l／DN-ALK2组细胞的增殖活力、集落形成率及划痕愈合率均显著降低（P〈0．05），穿膜细胞数也明显减少（P〈0．05）；而MDA-MB-231／RFP组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论DN．ALK2可以在体外抑制乳腺癌MDA-MB．231细胞的增殖、迁移与侵袭。

马蹄香对小鼠的急性毒性及对大鼠的亚急性毒性观察1290-1292

摘要：目的观察马蹄香（ValevianajatamansiJones）对小鼠的急性毒性及对大鼠的亚急性毒性，以评价其安全性。方法给小鼠灌服5000、7500、10000mg／kg的马蹄香，对照组灌胃1％羧甲基纤维素钠（CMC），观察小鼠的中毒症状，记录小鼠的死亡数，采用Red．Munchen法计算半数致死量（LD。），并检查小鼠组织和脏器的病理变化；对大鼠分别灌服4000、1000和200mg／kg的马蹄香，连续给药14d，对照组灌胃CMC水溶液，给药后观察14d，检测大鼠体重、脏器系数、血常规指标、血生化指标及组织病理变化情况。结果急性毒性试验结果显示，灌胃马蹄香后，小鼠短时间内出现活动减少，而后趋于正常，病理学检测未发现小鼠组织或脏器有明显异常改变，LD50〉10000mg／kg；亚急性毒性试验结果显示，马蹄香各剂量组大鼠的增重、脏器系数、血常规指标、血生化指标及组织病理变化与对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论马蹄香具有较好的安全性。

普洱茶水提物对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的影响1293-1295

摘要：目的探讨普洱茶水提物对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-d，TNF-α）的影响。方法以佛波酯处理THP．1细胞48h，分化得到巨噬细胞，以其为炎症细胞模型，用不同浓度的普洱茶水提物（125、250Ixg／m1）与终浓度为100EU／ml的脂多糖的混合物作用于巨噬细胞，ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量。结果普洱茶水提物能有效抑制巨噬细胞炎症因子TNF-d的分泌，且浓度为250斗g／ml的普洱茶水提物对TNF-α仅分泌的抑制作用强于浓度为125肛g／ml的普洱茶水提物，呈剂量依赖性。结论普洱茶水提物对巨噬细胞炎症因子TNF-α理的分泌具有抑制作用。这种效果与已知的绿茶抗炎的主要成分EGCG无关。

3种肠杆菌科细菌的耐药性变迁1296-1299

摘要：目的研究大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌的耐药性变迁。方法对2007～2009年临床分离的大肠埃希菌（645株）、肺炎克雷伯菌（260株）和阴沟肠杆菌（150株），采用纸片扩散法进行体外药敏测定，并依据美国临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）规定的标准，分析3种肠杆菌科细菌的耐药性变迁。结果大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌对氨苄西林的耐药率均较高；对头孢他啶的耐药率低于头孢噻肟；与2007年比较，2008年和2009年对头孢吡肟的耐药率明显增长；未发现对亚胺培南耐药菌株的产生。结论细菌耐药性不断增强已成为临床治疗面临的重要难题，应从耐药监测、医院感染控制、合理使用抗生素等多方面努力，减少细菌耐药性的产生。

中国生物制品学杂志消息

中华预防医学会关于举办2011年海峡两岸传染病防治研讨会的通知1299-1299

摘要：为了提高海峡两岸传染病防治能力，加强海峡两岸预防医学科技工作者的交流与合作，由中华预防医学会与台湾欧巴尼纪念基金会联合主办、海南省疾病预防控制中心承办的“海峡两岸传染病防治研讨会”，将于2011年12月6～10日在海南省海口市召开。届时我们将邀请卫生部、中国疾病预防控制中心的领导到会并作报告，同时还将邀请海峡两岸传染病防治领域的权威专家，对最新的研究课题作学术报告和交流。欢迎学术界专家、朋友及对本次会议感兴趣的同道积极参会。现将有关事项通知如下：

中国生物制品学杂志基础研究

I型新德里金属β内酰胺酶的生物信息学分析1300-1302

摘要：目的应用生物信息学方法分析I型新德里金属B内酰胺酶（NewDelhimetallo-β-lactamase1，NDMl）的基本性质，并与常见的p内酰胺类抗生素进行分子对接，在理论上研究NDMl对p内酰胺类抗生素和抑制剂的水解活性。方法应用EMBOSS6．3．1．1软件包的程序分析NDMl的基本性质，并分别利用SWISS-MODEL同源建模和PHYRE2．0折叠识别法构建NDMl的空间结构，再运用Arguslab4．0软件的dock模块进行β内酰胺类抗生素与NDMl分子对接。结果NDMl共270个氨基酸残基，理论等电点为6．3，包含1个跨膜区，饯螺旋占27％，B折叠占34．5％；与抗生素对接能量由低到高依次为氨苄西林、头孢拉啶、阿莫西林、头孢唑林、甲氧西林、美罗培南、亚胺培南、氨曲南、克拉维酸。结论NDMl对氨苄西林催化效率最高，对氨曲南催化效率最低，克拉维酸对NDMl无抑制作用。

中国生物制品学杂志预防制品

第6代百日咳疫苗效力国家标准品的建立1303-1305

摘要：目的建立第6代百日咳疫苗效力国家标准品。方法选用百日咳菌株（沪64．21），发酵罐培养，收获的百日咳菌液经脱毒灭活后，分装冻干，作为备选品，按《中国药典》三部（2010版）进行无菌试验、血清学试验、水分含量及百日咳特异性毒性检测。以WHO标准品PWIS和中国百日咳疫苗效力国家标准品3号、5号为标准，经5个实验室进行协作标定，并考察其效力稳定性。结果该备选标准品的各项检测指标均符合国家标准品的规定；经协作标定45次，分别以国家标准品3号、5号和WHO标准品为标准进行量值溯源，标定结果差异无统计学意义（P〉0．05）；最终合并效价为13IU／ml（95％CI=12．23-13．26IU／m1）；保存期内标准品的效力稳定。结论该备选标准品各项指标均符合要求，可作为新的第6代百日咳疫苗效力国家标准品使用。

PELA-OmpK微球疫苗的部分特征及其对鲫鱼的口服免疫效果1306-1309

摘要：目的研究聚、DL晋L酸。聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-co．polyethyleneglycol，PELA）包裹哈维弧菌（Vibriobar-veyi，Vh）重组外膜蛋白OmpK制备的微球疫苗的部分特性及其对鲫鱼（Carossiusauratusgibelio）的口服免疫效果。方法用可生物降解的合成高分子材料PELA，通过乳化溶剂挥发法包裹OmpK，制备微球疫苗，Bradford法测定蛋白浓度，计算蛋白包裹率；通过扫描电镜观察微球粒径大小及其在4℃保存不同时间的形貌。取鲫鱼随机分为3组：微球疫苗组、OmpK蛋白组和空白对照组，前两组采用疫苗或蛋白拌饲投喂方式口服免疫，投喂3d，间隔7d，再投喂3d加强免疫；对照组投喂不含疫苗的饲料。加强免疫4周和8周后，经腹腔注射20LD。的VhEeGS020802株攻击，记录各组鱼死亡数，计算相对免疫保护率。结果制备的PELA．OmpK微球疫苗中OmpK蛋白的包裹率达78％。微球粒径小于12斗m，且90％微球的粒径小于5μm。4℃保存10d微球表面光滑、圆整；保存30dPELA微球降解，粒径较大的微球表面出现空洞；保存60d可见大量碎片，微球表面毛糙松散，出现多个空洞。微球疫苗加强免疫鲫鱼4周和8周后，对活菌攻击的相对免疫保护率分别为70％和48％，而口服OmpK蛋白组和空白对照组鱼全部死亡。结论用PELA包裹裸疫苗制备成微球疫苗，对抗原具有一定的保护作用，PELA用作鱼类口服疫苗的投递载体是可行的。

人禽流感裂解疫苗对小鼠的免疫原性观察1310-1312

摘要：目的观察人禽流感裂解疫苗对小鼠的免疫原性。方法将不同血凝素含量（20、30、45μg／m1）的铝佐剂和无佐剂人禽流感裂解疫苗各3批分别经腹腔注射免疫小鼠，0．5ml／只，每批疫苗又分为1针、2针和3针组，每组10只，每针间隔1周，同时设空白对照组。首针免疫后21d，分别采血，分离血清，检测血凝抑制抗体效价和中和抗体效价。结果1针、2针组各3批无佐剂疫苗免疫小鼠的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价分别小于1：40和1：200；2针、3针组各3批铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价均大于1：50，2针组20、30μg／ml血凝素铝佐剂疫苗的中和抗体效价均大于1：200；2针、3针组20、30与45μg／ml血凝素铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价差异均无统计学意义（P〉0．05）；且2针、3针组3批铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价均明显高于相应的3批无佐剂疫苗。结论铝佐剂疫苗对小鼠的免疫原性明显优于无佐剂疫苗，且20、30“g／ml血凝素铝佐剂疫苗接种2针可获得理想的免疫效果。

钩体疫苗免疫小鼠最佳剂量的筛选1313-1313

摘要：钩端螺旋体病（钩体病）为一种分布广泛的人兽共患病，呈世界范围流行，我国为该病的高发地区之一。接种安全、有效的疫苗是预防钩体病的有效手段。为研究人用钩体疫苗免疫小鼠的最佳剂量，为进一步研究疫苗的安全性及有效性提供依据，本文采用上海生物制品研究所生产的三价钩体疫苗（包括黄疸出血型、流感伤寒型、秋季型，每型菌不少于1．5×l0^8条／ml，剂量5m1）免疫小鼠，筛选最佳免疫剂量，为下一步多种疫苗联合接种的研究奠定基础。