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中国生物制品学 2011年第08期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志消息

来自ATCC的基因靶向工具876-876

摘要：ATCC三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4 MEF（ATCC誖SCRC-1045TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-1049TM）是一个克隆,

中国生物制品学杂志基础研究

羊布氏菌强毒株16M感染小鼠骨髓树突状细胞模型的建立877-881

摘要：目的建立羊布氏菌强毒株16M感染小鼠骨髓树突状细胞（Dendritic cell,DC）的模型。方法体外分离C57小鼠骨髓原代细胞,经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte monocyte colony stimulating factor,GM-CSF）和重组人白细胞介素-4（Recombinant human interleukin-4,rhIL-4）诱导分化后,倒置显微镜观察DC形态,流式细胞术鉴定其分化程度。在体外建立羊布氏菌16M感染小鼠骨髓DC模型,间接免疫荧光试验和透射电镜进行鉴定,并进行感染后羊布氏菌16M的重培养及染色观察。结果培养第5天,细胞形态符合髓源DC,伸出长的树突样和伪足样突起;第7天,细胞呈半悬浮,周围有大量突起;体外培养DC的纯度约达70%,符合试验要求。DC在感染后12 h具有最强的吞噬能力,胞内细菌量最少。重培养后经染色,可观察到羊布氏菌16M典型的细菌形态。结论成功构建了羊布氏菌感染小鼠骨髓DC模型,为进一步研究布氏菌与DC的相互作用及胞内寄生机制奠定了基础。

羊布氏菌P39基因重组真核表达质粒的构建及其免疫效果882-884

摘要：目的构建羊布氏菌P39基因重组真核表达质粒,并检测其免疫效果。方法将前期克隆的P39基因片段连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）的多克隆位点中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P39,转化E.coli DH5α,筛选阳性克隆,提取重组质粒,进行双酶切鉴定。以鉴定正确的重组质粒免疫BALB/c小鼠,凝集试验检测小鼠血清特异性抗体水平,ELISA法检测小鼠血清中细胞因子含量,MTT掺入法检测小鼠脾脏淋巴细胞的增殖效应。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P39经双酶切鉴定构建正确;该重组质粒能够刺激小鼠产生特异性抗体（抗体峰值滴度为1∶320）,显著增加Th1型细胞因子的产生,并能够增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应。结论成功构建了羊布氏菌P39基因重组真核表达质粒pcDNA3.1-P39,该重组质粒能够诱导BALB/c小鼠产生特异性免疫应答。

let-7a对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响885-888

摘要：目的研究let-7a对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的分子机制。方法将A549细胞、稳定转染let-7a重组质粒的A549-let-7a细胞及稳定转染对照质粒的A549-control细胞分别接种至BALB/c裸鼠背部皮下,观察各组细胞在裸鼠体内的生长情况,测量肿瘤体积并绘制生长曲线;30 d后处死裸鼠,取出瘤体,称重并计算抑瘤率;HE染色观察瘤组织的形态学改变;Western blot及免疫组化法检测各组瘤组织中k-Ras蛋白的表达情况。结果与A549细胞组相比,A549-let-7a细胞组裸鼠的瘤体生长速度明显减慢,瘤体重量显著降低（P〈0.01）,抑瘤率为27.51%,A549-control细胞组差异无统计学意义（P〉0.05）;HE染色显示,A549-let-7a细胞组癌细胞体积较其他两组减小,核浆比例明显缩小,核分裂相显著减少;Westernblot及免疫组化结果表明,与A549细胞组相比,A549-let-7a细胞组瘤组织中k-Ras蛋白的表达明显降低（P〈0.01）,而A549-control细胞组中k-Ras蛋白的表达差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 let-7a能显著抑制A549细胞在裸鼠体内的生长能力,其机制可能与下调k-Ras蛋白的表达有关。

羊型布氏菌WbkC基因真核表达质粒的构建及鉴定889-892

摘要：目的构建羊型布氏菌脂多糖O-侧链合成必需的甲酰基转移酶WbkC基因真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取16M株羊型布氏菌基因组DNA,PCR扩增WbkC基因,克隆至psos载体上,构建诱饵重组质粒psos-WbkC,转化酵母菌株cdc25Hα,进行菌落PCR鉴定,并检测其在酵母双杂交系统中的自激活和定位情况。结果诱饵重组质粒psos-WbkC经PCR双酶切及测序证明构建正确;重组酵母菌经PCR鉴定,可扩增出约780 bp的目的基因;诱饵质粒在酵母双杂交系统中无自激活且定位正确。结论已构建了羊型布氏菌WbkC基因真核表达质粒psos-WbkC,可应用于酵母双杂交系统中,用于寻找巨噬细胞cDNA文库中与WbkC相互作用的蛋白质。

含阿德福韦酯耐药突变位点的HBV聚合酶逆转录酶区域的原核表达893-897

摘要：目的原核表达含阿德福韦酯（Adefovir,ADV）耐药突变位点的HBV聚合酶逆转录酶（Reverse transcriptase,RT）区域。方法以野生型HBV DNA为模板,PCR扩增HBV聚合酶RT区域,克隆至质粒pHis-SUMO上,构建重组表达质粒SUMO-RTWT,并通过定点突变构建含ADV耐药突变位点（181T/V＋236T）的突变质粒SUMO-MT1和SUMO-MT2,转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析,并进行表达条件的优化及HBV聚合酶RT区域的结构建模。结果重组表达质粒SUMO-RTWT、SUMO-MT1和SUMO-MT2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合;经表达条件优化后,3种重组质粒在大肠杆菌Roset-ta（DE3）中均获得有效稳定的表达;同源结构建模结果表明,HBV聚合酶RT区域具有典型的DNA聚合酶的结构。结论已成功构建了含ADV耐药突变位点HBV聚合酶RT区域的重组原核表达质粒,并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得稳定表达的可溶性目的蛋白,为研究ADV的耐药机制奠定了基础。

稳定表达重组长效促红细胞生成素的CHO-K1细胞株的筛选898-902

摘要：目的将密码子优化的一系列长效促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）基因定点整合至CHO-K1细胞株中,获得高效稳定表达的细胞株。方法对EPO基因定点突变得到Darbepoetin-1序列（专利公开序列）及其同义密码子序列Darbe-poetin-2、Darbepoetin-3,并构建相应重组表达质粒pcDNA5/FRT/dbp（s）,采用定点整合技术,转染CHO-K1细胞株,经ELISA和荧光定量PCR法鉴定转染细胞株,比较同一整合位点同义密码子Darbepoetin alfa蛋白表达水平的差异。蛋白样品经蓝胶亲和层析、凝胶过滤和离子交换层析后,进行SDS-PAGE、Western blot及等电聚焦电泳分析。结果重组表达质粒pcDNA5/FRT/dbp（s）经测序鉴定正确;ELISA检测表明,Darbepoetin-2的表达水平明显优于Darbepoetin-1和Darbepoetin-3,最高可达1 845 IU/ml;SDS-PAGE分析显示,纯化的Darbepoetin alfa比rHuEPO具有更高的相对分子质量,可与兔抗人EPO多抗特异性结合,且比rHuEPO具有更高的唾液酸丰度。结论获得了高效稳定表达重组Darbepoetin alfa的CHO-K1细胞株。

人肝细胞生长因子在毕赤酵母中的分泌表达及其活性903-906

摘要：目的在毕赤酵母中分泌表达人肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）,并检测其活性。方法从真核表达质粒pRC/CMV-HGF中扩增HGF的编码基因,将其克隆入表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-HGF,电穿孔法转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达重组人HGF（rhHGF）。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,检测其对原代培养的大鼠肝细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pPIC9K-HGF经酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约80 000,表达量占菌体总蛋白的18%,可与兔抗人HGF多抗特异性结合,并可刺激大鼠肝细胞增殖。结论在毕赤酵母菌中成功分泌表达了rhHGF,表达产物具有促进肝细胞增殖的活性。

Quil A对O型口蹄疫疫苗的免疫增强作用907-910

摘要：目的探讨Quil A对口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）疫苗的免疫增强作用。方法将O型FMDV抗体阴性的仔猪随机分为4组：1组首次免疫O型口蹄疫核酸苗pVIRIL18P1,第2次免疫重组鸡痘苗vUTAL3CP1;2组首次免疫Quil A＋O型口蹄疫核酸苗pVIRIL18P1,第2次免疫重组鸡痘苗vUTAL3CP1;3组两次均免疫猪O型口蹄疫合成肽疫苗;4组两次均免疫PBS。首次免疫后0、14、42 d,检测猪血清中FMDV VP1结构蛋白抗体及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFNγ的水平;首次免疫后42 d,检测T淋巴细胞增殖水平。结果 2次免疫后,2组猪血清中FMDV VP1结构蛋白抗体水平、细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFNγ水平及T淋巴细胞增殖率均显著升高。首次免疫后42 d,2组上述指标中除IL-2水平外,与3组和4组比较差异均有统计学意义（P〈0.05或〈0.01）;除IL-2、IL-10和IFNγ水平外,与1组比较差异均有统计学意义（P〈0.05或〈0.01）。结论 Quil A对O型口蹄疫疫苗具有较好的免疫增强作用。

sh-hnRNP-E2逆转录病毒对32D-P210细胞诱导的白血病模型小鼠的保护作用915-920

摘要：目的探讨sh-hnRNP-E2逆转录病毒对32D-P210细胞诱导的白血病模型小鼠的保护作用。方法建立32D-P210转化细胞株在C3H等基因小鼠体内定殖的慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）模型,并进行鉴定;sh-hn-RNP-E2逆转录病毒感染32D-P210细胞24 h后,经尾静脉移植入C3H等基因雌性小鼠中,观察sh-hnRNP-E2对CML模型小鼠的保护作用。结果经鉴定已成功建立32D-P210转化细胞株在C3H等基因小鼠体内定殖的CML模型;sh-hnRNP-E2逆转录病毒预感染32D-P210靶细胞,可促进靶细胞向粒系分化,并显著延长模型小鼠的生存期。结论 sh-hnRNP-E2逆转录病毒感染对CML模型小鼠具有显著的保护效应,是一种有效的CML体内治疗策略。

氢氧化铝吸附炭疽杆菌重组保护性抗原的影响因素921-922

摘要：目的探讨氢氧化铝吸附炭疽杆菌重组保护性抗原（Recombinant protective antigen,rPA）的影响因素。方法取含不同PO43-浓度的PBS和添加EDTA的PBS,分别稀释rPA后,加入氢氧化铝,放置2～8℃及（23±2）℃作用不同时间,检测A280和A260值,计算未吸附的rPA蛋白量,并比较不同溶液中氢氧化铝对rPA的吸附效果。结果氢氧化铝对rPA的吸附率随PO43-浓度的增加而降低;PBS中添加EDTA后,氢氧化铝对rPA的吸附效果明显下降;2～8℃较（23±2）℃的吸附率略有增加,但不同时间的吸附量无明显差异;在H2O中氢氧化铝对rPA的吸附效率比在PBS中高。结论稀释缓冲液和离子强度、EDTA均可影响氢氧化铝与rPA的吸附效果,但吸附温度和时间对吸附的影响不大。

表达鼠干扰素γ的重组卡介苗的构建及鉴定923-926

摘要：目的构建分泌表达鼠IFNγ（Mouse interferon-gamma,mIFN-γ）的重组卡介苗（Bacillus Calmette-Gu伢rin,BCG）,并进行鉴定。方法 PCR扩增BCG抗原85B的信号肽序列,插入E.coli-BCG穿梭载体pBCG3000的启动子下游,构建分泌性重组穿梭质粒S-pBCG3000;以PHA刺激小鼠脾细胞产生的RNA为模板,RT-PCR扩增mIFNγ成熟肽的编码cDNA,插入S-pBCG3000质粒的信号肽序列下游,构建mIFNγ的表达质粒S-pBCG3000-γ;通过电穿孔技术将表达质粒转入BCG,以卡那霉素和PCR筛选重组BCG,ELISA法检测重组BCG培养滤液中的mIFNγ含量,细胞病变抑制法鉴定mIFNγ的生物活性。结果经测序、PCR扩增和酶切鉴定分析,Ag85B信号肽和mIFNγ成熟肽的编码序列均成功克隆并插入到pBCG3000的相应位点,表达质粒转化BCG后获得的重组BCG分泌mIFNγ的含量高达1 234.1 pg/ml,在L929细胞中的抗VSV活性为64 U/ml。结论所构建的重组BCG可分泌具有功能活性的mIFNγ,为进一步研究其免疫效应奠定了基础。

三七皂甙对慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠心肌胶原重构的调控927-930

摘要：目的探讨三七皂甙（Panax notoginseng saponins,PNS）对慢性血栓栓塞性肺动脉高压（Chronic thromembolismpulmonary hypertension,CTPH）大鼠心肌胶原重构的调控作用及可能的机制。方法利用二次血栓栓塞法建立大鼠CTPH模型,4周后,将正常大鼠分为A、B组,模型大鼠分为C、D组,A、C组经腹腔注射0.9%生理盐水,2 ml/d;B、D组经腹腔注射PNS,100 mg/（kg.d）。每天注射1次,4周后,测定各组大鼠的血流动力学指标、心室游离壁厚度,HE和VG染色观察心肌组织的形态学改变,Western blot检测心肌组织中基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达。结果 C组与A组、B组比较,右心室收缩压、右室（RV）/左室（LV）游离壁厚度比、心肌间质胶原增生、MMP-2的表达均明显升高（P〈0.05）;经PNS干预后,D组右心室收缩压、RV/LV游离壁厚度比、心肌间质胶原增生、MMP-2的表达均明显降低（P〈0.05）。结论在CTPH心肌重构过程中,PNS可以逆转右心室重构,其机制可能与上调MMP-2的表达、促进心室间质胶原的降解有关。

CML来源的DC激活的T淋巴细胞对自体CML细胞的杀伤作用931-934

摘要：目的探讨慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia,CML）来源的树突状细胞（Dendritic cell,DC）激活的T淋巴细胞对自体CML细胞的杀伤作用。方法利用rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α体外定向诱导CML患者外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）生成DC,光学显微镜和透射电镜观察所诱导的DC形态特征;流式细胞术进行表型检测;采用FISH和RT-PCR法检测所诱导的DC的白血病源性;MTT法检测其对自体CML细胞的杀伤作用。结果 CML患者PBMC在体外可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DC,其激活的T淋巴细胞对自体CML细胞的杀伤作用明显强于单独应用T淋巴细胞对CML细胞的杀伤作用。结论 CML患者PBMC能够诱导生成白血病源的DC,该DC能够激活T淋巴细胞对CML细胞的特异性杀伤作用。

Hedgehog信号通路阻断对人胃癌细胞SGC-7901侵袭和血管内皮生长因子表达的影响935-938

摘要：目的探讨Hedgehog（Hh）信号通路阻断对人胃癌细胞SGC-7901侵袭的影响及其可能的机制。方法免疫荧光检测Hh信号通路分子Shh和Gli1蛋白在SGC-7901细胞中的表达;用不同浓度（2.5、5、10μmol/L）的Hh信号通路特异性阻断剂环靶明作用SGC-7901细胞48 h后,Transwell小室试验检测SGC-7901细胞的侵袭能力,半定量RT-PCR检测SGC-7901细胞中Shh、Gli1和血管内皮生长因子（VEGF）基因mRNA的表达。结果 Shh和Gli1蛋白在SGC-7901细胞中高表达;环靶明能显著抑制SGC-7901细胞的侵袭,且呈剂量依赖性;Hh信号通路阻断后,SGC-7901细胞中Shh基因mRNA的表达水平无明显改变,Gli1和VEGF基因mRNA的表达水平显著下降。结论 Hh信号通路分子在SGC-7901细胞中高表达,阻断Hh信号通路可以抑制SGC-7901细胞的侵袭,可能是通过抑制Gli1下调VEGF起作用。

胃癌组织中分化抑制因子1和血管内皮生长因子的表达与微血管密度的相关性939-941

摘要：目的探讨胃癌组织中分化抑制因子1（Inhibitor of DNA binding/differentiation1,ID1）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达与微血管密度（Microvessel density,MVD）的相关性。方法采用免疫组化定性分析ID1、VEGF和CD34在胃癌及癌旁非癌组织中的表达及MVD,Western blot半定量分析ID1和VEGF蛋白在胃癌及癌旁非癌组织中的表达。结果胃癌组织中ID1和VEGF的表达及MVD明显高于癌旁非癌组织,且差异均有统计学意义（P均〈0.05）;ID1表达阳性的胃癌组织的MVD明显高于ID1表达阴性的胃癌组织,且差异有统计学意义（P〈0.001）。结论胃癌组织中ID1的表达与VEGF和MVD具有相关性,ID1可能具有促进胃癌血管生成的作用。

中国生物制品学杂志预防制品

广谱流感噬菌体微球疫苗对豚鼠的免疫保护作用942-944

摘要：目的探讨广谱流感噬菌体微球疫苗对分别感染H3N2、H1N1和B型流感病毒豚鼠的免疫保护作用。方法以广谱流感噬菌体微球疫苗免疫豚鼠,1个月后采血,间接ELISA法检测豚鼠血清中抗流感病毒IgG抗体的滴度;并于采血后3 d,经滴鼻途径分别攻击3个型别的流感病毒,攻击后3 d,检测豚鼠鼻腔洗液和肺组织中的病毒滴度。结果免疫豚鼠血清中均能检测出抗H1N1、H3N2和B型流感毒株的IgG抗体;分别以H3N2、H1N1和B型流感病毒攻击后3 d,在疫苗组豚鼠鼻腔洗液中检出少量病毒,而肺组织中则未检出,空白对照组豚鼠鼻腔洗液和肺组织中均检出较大量的流感病毒。结论广谱流感噬菌体微球疫苗对感染H3N2、H1N1和B型流感病毒的豚鼠均具有一定的免疫保护效果。

中国生物制品学杂志消息

2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会第二轮通知944-944

摘要：为促进中国生物制品事业的发展,为专业研究人员提供交流与合作机会,由中华预防医学会生物制品分会主办、中国生物技术集团公司和国药励展展览有限责任公司承办、国药中生成都生物制品研究所和中国医药生物技术协会疫苗专业委员会协办的＂2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会＂定于2011年9月21～23日在四川成都博瑞花园酒店召开。