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中国生物制品学 2011年第06期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

脊髓灰质炎病毒Sabin2株结构蛋白VP1在昆虫杆状病毒表达系统中的表达625-628

摘要：目的在昆虫杆状病毒表达系统中表达脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）Sabin2株结构蛋白VP1。方法从Sabin2疫苗原液中RT-PCR扩增PV结构蛋白VP1基因,克隆入pFastBac1质粒,转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP1,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-VP1。将第2代rBac-VP1感染sf9细胞,间接免疫荧光法检测VP1蛋白的表达,并优化感染条件。结果重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP1转化子可扩增出3 203 bp的目的片段;第2代rBac-VP1的滴度为6×107 pfu/ml,其感染的sf9细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,以不同MOI的rBac-VP1感染sf9细胞,VP1蛋白表达量差别不大,而在96 h内,随着感染时间的延长,VP1蛋白的表达量逐渐升高。结论在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达了PV Sabin2株结构蛋白VP1,为脊髓灰质炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。

中国生物制品学杂志消息

中国生物制品大会暨第十一次全国生物制品学术研讨会征文通知628-628

摘要：为了促进中国生物制品事业的发展,为专业研究人员提供交流与合作机会,中国生物制品大会暨第十一次全国生物制品学术研讨会将于2011年9月22～25日在成都召开。本次会议由中华预防医学会生物制品分会主办,中国生物技术集团公司和国药励展展览有限责任公司承办,国药中生成都生物制品研究所协办。大会将邀请著名专家作相关专题报告,同时面向从事医学生物制品学及相关专业的工作者征集论文。希望有关领域的工作人员踊跃投稿,积极参会交流。

中国生物制品学杂志基础研究

抑制JTV1基因表达对大黄素引起的K562细胞凋亡的影响及其机制634-638

摘要：目的探讨抑制JTV1基因表达对大黄素引起的人白血病K562细胞系凋亡的影响及其机制。方法将pGene-Sil-1-JTV1-1.1 siRNA重组质粒、pGeneSil-1-N.1阴性对照质粒及pGeneSil-1空载体分别转染人K562细胞,通过集落形成试验检测细胞的增殖能力;各组转染K562细胞经80μmol/L大黄素处理后,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率,RT-PCR法检测细胞中凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc转录水平的变化,Western blot法检测Bcl-2、Bax、C-myc翻译水平的变化。结果抑制JTV1基因的表达后,K562细胞的增殖能力明显提高;抑制JTV1基因表达可使经80μmol/L大黄素处理的K562细胞G1期细胞比例下降,并减轻大黄素引起的细胞凋亡,同时,细胞Bax基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平均明显下降,而Bcl-2基因和C-myc基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平则明显上调。结论抑制JTV1基因表达可能通过上调Bcl-2和C-myc基因的表达,下调Bax基因的表达,促进K562细胞的增殖,并阻止细胞凋亡。

羊布氏菌SOD基因重组酿酒酵母菌株的构建及鉴定639-642

摘要：目的构建羊布氏菌超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）基因重组酿酒酵母菌株,并进行鉴定。方法 PCR扩增羊布氏菌16M株SOD基因,与psos载体连接,构建重组表达质粒psos-SOD,转化酿酒酵母菌cdc25H,并进行PCR鉴定、表型验证、自激活及定位情况检验。结果重组真核表达质粒psos-SOD经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌经PCR可扩增出525 bp的SOD基因条带,其表型正常,无自激活宿主菌的作用,表达蛋白定位正确。结论已成功构建了羊布氏菌SOD基因重组酿酒酵母菌株,为研究布氏菌致病的分子机制奠定了基础。

来自ATCC的基因靶向工具642-642

摘要：ATCC三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4 MEF（ATCC^？SCRC-1045^TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-1049TM）是一个克隆,来自于具有G418抗性和鼠类LIF高表达的STO细胞系。SNLP76／7-4（SCRC-1050^TM）是一株带有嘌呤霉素抗性的克隆，来自于SNL76／7。要了解更多信息，请访问WWW．atcc．org／MEF6。

重组腺病毒pAd-sTGF-β RⅡ对大鼠心肌梗死后心室重塑的影响643-648

摘要：目的研究携带TGF-βRⅡ胞外区基因的重组腺病毒pAd-sTGF-βRⅡ对大鼠心肌梗死（Myocardial infarction,MI）后心室重塑的影响,并探讨其可能的机制。方法结扎SD大鼠左冠状动脉前降支,建立大鼠MI模型,将模型大鼠随机分为MI组（生理盐水）、pAd-sTGF-βRⅡ组（pAd-sTGF-βRⅡ病毒上清液）、空载体组（pAdTrack）,并另设假手术组。4周后,取冰冻切片,荧光显微镜下观察sTGF-βRⅡ在大鼠心肌组织中的表达;HE染色观察心肌组织结构;天狼猩红-饱和苦味酸染色法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达;RT-PCR法检测凋亡相关基因bax、bcl-2 mRNA的表达。结果与MI组比较,pAd-sTGF-βRⅡ组大鼠心肌组织总Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-9蛋白和bax基因mRNA的表达水平均明显降低（P〈0.01）,α-SMA阳性细胞数亦明显减少,bcl-2基因mRNA表达水平增加（P〈0.01）。与假手术组比较,pAd-sTGF-βRⅡ组大鼠心肌组织总Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-9蛋白和bax基因mRNA的表达水平明显升高（P〈0.01）,bcl-2基因mRNA的表达水平无明显差异（P〉0.05）。结论重组腺病毒pAd-sTGF-βRⅡ干预可改善大鼠MI后心室重塑,其机制可能是通过抑制TGF-β介导的心肌纤维化和心肌细胞凋亡实现的。

TIMP1基因重组真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达649-652

摘要：目的构建3种TIMP1基因重组真核表达质粒,并在人乳腺癌MCF-7细胞中表达。方法将TIMP1基因分别插入3种真核表达载体pcDNA3.1（＋）、pVAXⅠ和pEGFP-C1,构建3种重组表达质粒pcDNA3.1（＋）-TIMP1、pVAXⅠ-TIMP1和pEGFP-C1-TIMP1,转染MCF-7细胞,采用Real-time PCR和Western blot法检测TIMP1基因在MCF-7细胞中的表达。结果 3种重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;重组表达质粒pEGFP-C1-TIMP1转染MCF-7细胞48 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,而pcDNA3.1（＋）-TIMP1和pVAXⅠ-TIMP1转染的细胞则观察不到绿色荧光;在转染的MCF-7细胞中,TIMP1基因mRNA转录水平和蛋白表达水平从高到低依次为pcDNA3.1（＋）-TIMP1、pVAXⅠ-TIMP1和pEGFP-C1-TIMP1。结论已成功构建了3种TIMP1基因重组真核表达质粒,其在MCF-7细胞中的表达量有差异。

GalR2基因真核表达质粒的构建及鉴定653-656

摘要：目的构建GalR2基因真核表达质粒,并在HeLa细胞中表达。方法从C57BL∕6J小鼠海马组织中提取总RNA,RT-PCR法扩增GalR2基因,克隆至pEGFP-C1载体中,构建重组真核表达质粒pEGFP-GalR2。将重组表达质粒转染至HeLa细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位,RT-PCR和Western blot分别检测GalR2基因的转录及表达。结果从C57BL∕6J小鼠海马组织扩增出1 116 bp的GalR2基因;重组表达质粒pEGFP-GalR2经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;转染细胞融合基因的表达产物定位于细胞核,GalR2基因在mRNA及蛋白水平上均有表达。结论已成功构建了GalR2基因真核表达质粒pEGFP-GalR2,并在HeLa细胞中成功表达了GalR2蛋白,为进一步探讨GalR2的生物学活性奠定了基础,也为寻找抗抑郁药物的靶点提供了新的思路。

Spiegelmer NOX 1255对LHRH-PE40与HeLa细胞上LHRH受体结合的抑制作用657-659

摘要：目的探讨Spiegelmer NOX 1255对促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素40（Luteinizing hormone-releasing hor-mone-Pseudomonas aeruginosa exotoxin 40,LHRH-PE40）与HeLa细胞上促黄体激素释放激素（LHRH）受体结合的抑制作用。方法分别将25μmol/L的LHRH-PE40、PEA和PE40与HeLa细胞共孵育24 h后,观察细胞的形态学变化;用Spiegelmer NOX1255特异性结合LHRH-PE40上的LHRH,光学显微镜观察Spiegelmer NOX 1255对LHRH-PE40的抑制作用,ELISA检测Spiege-lmer NOX 1255对LHRH-PE40与LHRH受体结合的抑制作用。结果 LHRH-PE40和PEA可直接杀伤HeLa细胞,而PE40不能对HeLa细胞产生毒性作用;Spiegelmer NOX 1255能够结合LHRH-PE40中的LHRH,抑制LHRH-PE40与LHRH受体的结合及PE40的毒性作用。结论 LHRH-PE40对HeLa细胞的毒性作用是通过细胞表面的LHRH受体产生的;Spiegelmer NOX 1255可阻断LHRH-PE40与HeLa细胞表面LHRH受体的结合。

H3N2 SIV河南分离株NS1基因的克隆及原核表达665-667

摘要：目的克隆并原核表达猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）非结构蛋白1（Nonstructural protein 1,NS1）基因,为建立人工免疫猪和自然感染猪的鉴别诊断方法奠定基础。方法从 H3N2 SIV河南分离株中提取病毒RNA,RT-PCR扩增NS1基因,克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果测序结果表明,扩增的NS1基因与国内外多株SIV NS1基因序列同源性达98%以上,表达的重组蛋白相对分子质量约为27 000,能与SIV感染猪阳性血清发生特异性反应。结论已成功克隆了H3N2 SIV河南分离株NS1基因,并在E.coli BL21（DE3）中表达了重组NS1蛋白,为建立人工免疫猪和自然感染猪的鉴别诊断方法奠定了基础。

siRNA-NRP1对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用668-671

摘要：目的探讨神经纤毛蛋白1（Neuropilin 1,NRP1）基因小干扰RNA（siRNA）质粒对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用。方法设计靶向人NRP1基因的siRNA序列,合成一对互补的寡核苷酸,退火后克隆至质粒pGenesil-1.1上,构建重组质粒siRNA-NRP1;将人胃癌细胞SGC7901注入裸鼠右臀部皮下,构建移植瘤模型,成瘤后将重组质粒siRNA-NRP1注入瘤内,观察裸鼠临床表现,并测定裸鼠移植瘤的体积及重量;病理切片观察肿瘤组织及血管生长情况;免疫组化方法观察裸鼠移植瘤中NRP1的表达及微血管密度。结果酶切分析及测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已克隆至质粒pGenesil-1.1中;siRNA-NRP1组裸鼠移植瘤的体积及重量均小于对照组（P〈0.01）;病理切片显示siRNA-NRP1组肿瘤细胞坏死较对照组明显;免疫组化显示siRNA-NRP1组裸鼠移植瘤中NRP1的表达及微血管密度均低于对照组（P〈0.01）。结论通过siRNA-NRP1抑制裸鼠胃癌移植瘤中NRP1的表达,可影响裸鼠移植瘤中血管的生成,最终抑制肿瘤的生长。

肺炎支原体黏附蛋白P1羧基末端的原核表达及纯化672-675

摘要：目的原核表达并纯化肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）黏附蛋白P1羧基末端。方法提取MP FH型基因组DNA,以其为模板,PCR扩增P1羧基末端基因,插入原核表达载体pET-32a（＋）,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA鉴定。结果重组表达质粒pET-32a-MP-P1C经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约55 900,以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的47%;纯化的重组蛋白纯度达94%以上,浓度为3.77 mg/ml,可与支原体肺炎患者血清特异性反应,经3 000倍稀释后,仍可与支原体肺炎患者血清发生阳性反应。结论原核表达并纯化了MP黏附蛋白P1羧基末端,为进一步研究MP的致病机制及研发诊断试剂和基因疫苗奠定了基础。

白芨多糖对小鼠免疫功能的调节作用676-678

摘要：目的探讨白芨多糖（Bletilla striata polysaccharide,BSPS）对小鼠免疫功能的调节作用。方法提取白芨多糖并测定其含量。通过腹腔注射环磷酰胺100 mg/（kg.d）,连续3 d,建立免疫功能低下小鼠模型,观察灌服不同剂量白芨多糖溶液对免疫功能低下小鼠碳廓清试验的影响;采用MTT法测定白芨多糖对刀豆蛋白A（Concanavalin A,Con A）和脂多糖（Lipopoly-saccharide,LPS）诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果提取的3批白芨多糖中的多糖含量分别为93.490%、92.280%和92.629%。在碳廓清试验中,与模型组相比,500 mg/（kg.d）白芨多糖能显著提高免疫抑制小鼠的吞噬指数,其作用与100 mg/（kg.d）的左旋咪唑大致相当。淋巴细胞增殖试验中,1、3、10μg/ml的白芨多糖均可显著提升Con A诱导的小鼠T淋巴细胞增殖的能力,白芨多糖终浓度为3μg/ml时,提升作用最为显著;3μg/ml白芨多糖可显著提升LPS诱导的小鼠B淋巴细胞增殖的能力。结论白芨多糖对小鼠的非特异性免疫和特异性免疫反应均有促进作用。

猪附红细胞体感染小鼠血清IgG和IgE水平的变化679-681

摘要：目的建立猪附红细胞体感染BALB/c小鼠模型,检测小鼠血清IgG和IgE水平的变化。方法将未感染猪附红细胞体的BALB/c小鼠随机分为3组：A组注射猪附红细胞体阳性血液,B组注射猪附红细胞体阴性血液,C组注射生理盐水。采用镜检和PCR法检测各组小鼠猪附红细胞体感染情况;ELISA法检测各组小鼠血清IgG和IgE水平。结果镜检观察A组小鼠血液中可见猪附红细胞体。PCR结果显示,A组小鼠血液中可扩增出602 bp的特异性条带。在接种后第7和19天,3组小鼠血清IgG水平差异无统计学意义（P〉0.05）,至第10、13和16天,A组小鼠血清IgG水平明显高于B组和C组（P〈0.01）,B组明显高于C组（P〈0.01）;在接种后第10、13和22天,3组小鼠血清IgE水平差异无统计学意义（P〉0.05）,至第16和19天,A组小鼠血清IgE水平明显高于B组和C组（P〈0.01）,B组明显高于C组（P〈0.01）。结论已成功建立猪附红细胞体感染小鼠模型,IgG和IgE在小鼠抗猪附红细胞体免疫应答中发挥重要作用。

靶向人原癌基因c-fos的shRNA表达质粒的构建及鉴定682-684

摘要：目的构建靶向人原癌基因c-fos的短发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法构建靶向人c-fos基因的shRNA重组表达质粒Psilencer 3.1-sic-fos,转染乳腺癌MCF-7细胞,采用RT-PCR法检测稳定转染细胞中c-fos基因mRNA的表达。结果重组表达质粒Psilencer 3.1-sic-fos经PCR、双酶切及测序证明构建正确;重组表达质粒在mRNA水平明显抑制了MCF-7细胞c-fos基因的表达（P〈0.05）。结论已成功构建了人c-fos基因shRNA重组表达质粒,为深入研究c-fos基因在肿瘤发生、发展过程中的作用提供了技术手段。

中国生物制品学杂志预防制品

重组弓形虫热休克蛋白70鼻内及皮下免疫小鼠诱导的免疫应答比较689-692

摘要：目的比较重组弓形虫热休克蛋白70（rTgHSP70）滴鼻及皮下免疫小鼠诱导的免疫应答及其持续时间。方法将90只BALB/c小鼠随机分为3组：滴鼻组用20μg rTgHSP70滴鼻,皮下组用80μg rTgHSP70皮下免疫,间隔2周加强免疫1次,对照组不处理。末次免疫后第1、2、3、4、5、6周,每组分别处死小鼠5只,ELISA法检测血清IgG水平、鼻咽和肠冲洗液sIgA水平;分离脾淋巴细胞和肠上皮内淋巴细胞（IEL）并计数。结果滴鼻组小鼠血清IgG水平第1～6周高于皮下组和对照组,其中第3～5周差异有统计学意义（P〈0.001）;皮下组小鼠第3、4周显著高于对照组（P〈0.001）。滴鼻组小鼠第3～5周,皮下组小鼠第4～5周鼻咽冲洗液sIgA水平显著高于对照组（P〈0.001）。滴鼻组小鼠小肠冲洗液sIgA水平第1～6周显著高于皮下组和对照组（P均〈0.001）;皮下组小鼠第3、4周显著高于对照组（P〈0.001）。滴鼻组小鼠脾淋巴细胞数量第2～4周显著高于对照组（P〈0.000 1）,3～4周显著高于皮下组（P〈0.001）;皮下组小鼠第2～4周显著高于对照组（P〈0.001）。滴鼻组小鼠IEL数量第1～6周显著高于对照组（P〈0.000 1）,第3～4周显著高于皮下组（P〈0.000 1）,皮下组小鼠第1～5周显著高于对照组（P〈0.05）。结论 rTgHSP70皮下和滴鼻免疫小鼠均能诱导有效的黏膜和系统免疫应答,且滴鼻免疫的效果优于皮下免疫,是rTgHSP70更为有效的免疫途径。

皮卡重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）的稳定性693-694

摘要：目的观察皮卡重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）的稳定性。方法将皮卡重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）分别于37、25和2～8℃放置不同时间,检测疫苗的体外相对效力（Relative potency,RP）、pH值和纯度的变化,观察其稳定性。结果疫苗于37℃放置45 d,RP略有下降,但仍在合格范围内;25℃放置6个月,RP和pH值均无明显变化;2～8℃放置12个月,RP、pH值和纯度均无明显变化。结论皮卡重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）稳定性良好。

中国生物制品学杂志治疗制品

重组人尿激酶原纯化工艺病毒去除效果验证695-698

摘要：目的验证重组人尿激酶原（Prourokinase,Pro-uk）纯化工艺的病毒去除效果。方法采用模拟Pro-uk纯化工艺中阴离子和阳离子交换层析的scale-down模型,以水泡性口炎病毒（Vesivular stomatitis virus,VSV）、脑心肌炎病毒（Encephalo-myocarditis virus,EMCV）、人单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type-1,HSV-1）为指示病毒,采用细胞病变法评价离子交换层析的病毒去除效果。结果阴离子交换层析对脂包膜病毒VSV和HSV-1的去除能力强,对无脂包膜病毒EMCV的去除能力较弱;阳离子交换层析对VSV和HSV-1的去除能力较弱,对EMCV的去除能力较强。经离子交换层析纯化后,3种指示病毒的累计去除效率均〉99.99%（大于4 log10）。结论 Pro-uk纯化工艺中的离子交换层析是控制病毒安全性的有效步骤,其去除效率达到了《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》规定的安全标准。