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中国生物制品学 2011年第03期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性249-254

摘要：目的原核表达、纯化乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）（1～155）与前S1抗原（PreS1）（3～55）融合蛋白,并分析其免疫原性。方法从HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,以其为模板,PCR分别扩增HBcAg和preS1部分基因片段及融合基因CS1,将CS1基因亚克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,构建重组原核表达质粒pET-CS1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经纯化后进行SDS-PAGE、HPLC和Western blot等分析。将纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用竞争抑制法检测血清Anti-HBc水平,间接ELISA法检测Anti-PreS1水平,并检测抗体亚类;ELISPOT法评价其细胞免疫效果。结果重组原核表达质粒pET-CS1经双酶切证明构建正确;电镜分析表明粗纯的CS1可自行组装成病毒样颗粒（VLP）,直径约为30 nm;SDS-PAGE和HPLC分析显示,CS1蛋白纯度分别为98.2%和93%;纯化的CS1蛋白可与兔抗人HBcAgr多抗和鼠抗人PreS1单抗特异结合,并能诱导小鼠产生Anti-HBc和Anti-PreS1抗体,抗体亚类以IgG2a为主,并能够诱生小鼠脾细胞产生HBcAg特异性的IFNγ。结论已成功原核表达并纯化了融合蛋白CS1,纯化的CS1纯度较高,能诱导机体产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫反应。

RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒的构建及其在Vero细胞中的表达255-258

摘要：目的构建RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达。方法应用重叠延伸PCR方法,采用一定的linker序列（Gly4Ser）2将已克隆的狂犬病病毒糖蛋白（Rabies virus glycoprotein,RV-G）基因片段和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（E.coli heat-labile enterotoxin subunit B,LTB）基因片段进行融合,扩增融合基因G-linker-LTB,并插入真核表达质粒pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-G-linker-LTB,转染Vero细胞,间接免疫荧光试验和Western blot法检测融合蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pVAX1-G-linker-LTB经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染Vero细胞后,可检测到融合蛋白的表达。结论已成功构建了RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达了融合蛋白。

人S100A8重组腺病毒质粒的构建及鉴定259-262

摘要：目的构建人S100A8（hS100A8）重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础。方法从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PmeⅠ酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。结果重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011 IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达。结论成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hS100A8奠定了基础。

单核李斯特菌溶血素蛋白的原核表达及纯化263-265

摘要：目的原核表达并纯化单核李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）溶血素（Listeriolysin O,LLO）蛋白。方法用1对LM LLO基因特异性引物从LM基因组DNA中扩增LLO基因,并构建重组原核表达质粒pET-30a（＋）/rLLO,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达的rLLO蛋白经镍离子金属螯合柱纯化后,进行SDS-PAGE及质谱分析。结果重组表达质粒pET-30a（＋）/rLLO经PCR、双酶切及测序,证明构建正确。表达的rLLO融合蛋白相对分子质量约为78 000,主要以包涵体形式表达。质谱分析显示,两个相对分子质量分别为35 000和45 000的小分子也均为LLO蛋白。结论已成功地在大肠杆菌中表达了rLLO蛋白,并进行了纯化,为进一步研究LLO蛋白的生物学功能及研制基于LLO蛋白的特异性诊断制剂奠定了基础。

人偏肺病毒标准株在不同细胞中的复制动力学266-269

摘要：目的探讨人偏肺病毒（Human metapneumovirus,hMPV）标准株在不同细胞中的复制动力学,确定适合分离和培养hMPV的细胞。方法将hMPV A亚型标准株hMPV/NL/1/00和B亚型标准株hMPV/NL/1/99分别接种于Vero、Vero-E6、LLC-MK2、A549和HEp-2细胞,盲传数代,逐日观察细胞病变（CPE）,并于接种后第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天提取细胞RNA,逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR检测hMPV F蛋白基因。结果接种hMPV后3 d可在Vero、Vero-E6、LLC-MK2和A549细胞中观察到CPE,不同亚型的hMPV所致的CPE无差别;hMPV可在Vero、Vero-E6和LLC-MK2细胞中稳定复制,不能在A549和HEp-2细胞中稳定传代。结论 Vero、Vero-E6和LLC-MK2细胞是适合培养hMPV的细胞,A549和HEp-2细胞不适合用于培养hMPV。

合成抗菌肽TachyplesinⅠ的体外生物活性及其降解规律270-275

摘要：目的探讨合成抗菌肽TachyplesinⅠ在体外的生物活性及在模拟消化环境中的降解规律。方法采用不同温度、pH值、阳离子浓度、溶剂极性、模拟消化环境分别处理TachyplesinⅠ,通过检测TachyplesinⅠ生物活性的变化分析其稳定性;检测TachyplesinⅠ对小鼠血细胞的溶血活性;通过HPLC图谱变化评定TachyplesinⅠ在模拟消化环境中的降解情况。结果 TachyplesinⅠ在低于100℃、pH值小于10.3的情况下具有稳定性,阳离子浓度和溶液极性对TachyplesinⅠ的抗菌活性具有一定影响;在TachyplesinⅠ浓度大于80 mg/L时,作用时间大于30 min时,表现出一定的溶血活性;TachyplesinⅠ在模拟胃液、胃黏膜匀浆和血浆系统中表现出很高的稳定性,色谱峰型基本未改变,几乎无降解作用,TachyplesinⅠ的最小抑菌浓度为5.0～20.0 mg/L;在模拟小肠液和小肠黏膜匀浆系统中稍微敏感,色谱峰型降低,出现小杂峰,生物活性明显降低,最小抑菌浓度在80～160 mg/L之间。结论 TachyplesinⅠ具有较强的高温耐受性,在酸性条件下稳定,同时具有一定的耐受体内蛋白酶降解的能力。

罗格列酮对人结肠癌Lovo细胞增殖的抑制作用及其机制276-279

摘要：目的探讨罗格列酮对人结肠癌Lovo细胞增殖的抑制作用及其可能的作用机制。方法人结肠癌Lovo细胞分别经不同浓度（10-6、10-5、10-4和10-3 mol/L）的罗格列酮和美洛昔康作用6、12和24 h后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测罗格列酮处理24 h的细胞COX-2基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞COX-2蛋白的表达水平。结果罗格列酮浓度大于10-5 mol/L,美洛昔康浓度大于10-4 mol/L均可明显抑制Lovo细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性;罗格列酮可明显降低Lovo细胞COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平,且均呈浓度依赖性。结论罗格列酮能抑制人结肠癌Lovo细胞增殖,其作用机制与抑制细胞COX-2的表达有关。

中国生物制品学杂志消息

2011第四届工业生物技术大会279-279

摘要：由中国医药生物技术协会主办,大连百奥泰科技有限公司承办的第四届工业生物技术大会,将于2011年4月25～29日在中国大连世界博览广场举行。工业生物技术大会是为全球工业生物技术研究的科学工作者、研究机构和生产企业搭建的思想、学术和技术、

中国生物制品学杂志基础研究

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测280-284

摘要：目的预测中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。

激活素A及激活素结合蛋白在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达285-287

摘要：目的探讨激活素A（Activin A）及激活素结合蛋白（Follistatin,FS）在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达。方法通过1次/12 h给予小鼠5 g/Kg酒精连续灌胃3次,复制急性酒精性肝损伤小鼠模型,采用实时定量RT-PCR检测小鼠肝组织Activin A及FS mRNA表达水平,免疫组织化学染色观察小鼠肝组织Activin A及FS蛋白的表达水平。结果急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组（P〈0.01）;FS mRNA和蛋白表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A-FS表达失衡,以Activin A升高为主,提示Activin A-FS系统失衡可能与酒精性肝损伤有关。

肺癌抑癌基因1对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响288-291

摘要：目的探讨肺癌抑癌基因1（Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1）对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平。MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-TSLC1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力。结论 TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点。

白藜芦醇对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的影响292-296

摘要：目的探讨白藜芦醇（Resveratrol,Res）对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组,线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型）、Res低剂量组（15 mg/kg,I/R＋R1组）和Res高剂量组（30 mg/kg,I/R＋R2组）,于缺血2 h再灌注24 h进行神经功能缺损评分;化学比色法测定大鼠血清和脑组织中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性;TTC法测定脑梗死体积;干湿重法测定脑含水量,HE染色观察脑组织的病理改变。结果与I/R组相比,Res能改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失（P〈0.01）,降低血清及脑组织中MDA的含量（P〈0.01）,提高SOD活性（P〈0.01）,缩小脑梗死体积（P〈0.01）,降低损伤侧脑含水量（P〈0.01）,改善脑组织的病理变化,且呈剂量依赖性。结论 Res对大鼠局灶性脑缺血再灌注氧化应激损伤具有良好的保护作用,其机制可能与清除自由基,减轻氧化性损伤有关。

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“血液制品生产技术与装备”研讨会296-296

摘要：＂血液制品生产技术与装备＂研讨会,由中国医学装备协会生物工程装备技术专业委员会主办,《中国生物制品学杂志》担任传媒支持。特邀国内外血液制品著名企业和知名专家做专题报告,

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人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达297-301

摘要：目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶（Human lysozyme,hLY）-木聚糖酶（Xylanases,XynⅡ）融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。

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第二届国际DNA和基因组活动周301-301

摘要：大连2011年4月25～29日,由中国医药生物技术协会和国家外国专家局国外人才信息中心主办、百奥泰生物技术有限公司承办的第二届中国大连国际DNA和基因组活动周将在大连世界博览广场举行。本届活动周计划邀请国内外基因领域的著名专家、

中国生物制品学杂志基础研究

血管生成素-2对人结肠癌细胞SW1116增殖的影响及其机制302-304

摘要：目的探讨血管生成素-2（Angiopoietin-2,Ang-2）对人结肠癌细胞SW1116增殖的影响及其机制。方法用不同浓度的Ang-2处理SW1116细胞,MTT法检测其对SW1116细胞增殖的影响;将SW1116细胞分为正常对照、无血清DMEM、Ang-2（1.2 mg/L）及PI3K/Akt阻断剂LY294002（10μmol/L）＋Ang-2组,作用24 h后,MTT法检测LY294002对SW1116细胞增殖的影响,Western blot分析Tie-2、PI3K和Akt蛋白的表达。结果 Ang-2在1.2 mg/L时,对SW1116细胞增殖的影响最显著;LY294002能有效抑制由Ang-2引起的SW1116细胞的增殖;Ang-2组与无血清DMEM组比较,Tie-2的表达略有上升,但差异无统计学意义（P〉0.05）,Akt蛋白的表达显著增强（P〈0.01）,而PI3K蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,LY294002＋Ang-2组中3种蛋白的表达与Ang-2组相比,均明显降低（P均〈0.01）。结论 Ang-2能促进SW1116细胞增殖,LY294002可抑制由Ang-2引起的SW1116细胞的增殖,其机制可能与Tie-2/PI3′-kinase/Akt调节的信号通路有关。

西洋参皂甙对免疫抑制小鼠免疫功能的影响305-308

摘要：目的探讨西洋参皂甙对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法用不同浓度的西洋参皂甙[0.12、1.20和12 g/（kg.d）]灌胃小鼠,每天1次,连续灌胃21 d,第10～14天,经腹腔注射环磷酰胺0.1 g/（kg.d）。测定小鼠血中血小板（PLT）、白细胞（WBC）、红细胞（RBC）的数量和血红蛋白（Hb）含量以及免疫器官重量;鸡红细胞吞噬试验检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,并进行二硝基氟苯（2,4-D）皮肤试验（DTH）;体外测定小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞的增殖活性、腹腔巨噬细胞NO含量以及脾淋巴细胞转化功能。结果西洋参皂甙可使免疫抑制小鼠血中的PLT、WBC、RBC和Hb的降低恢复良好,并恢复小鼠免疫器官重量,2,4-D所致迟发型超敏反应减轻,促进小鼠腹腔巨噬细胞代谢,增强巨噬细胞吞噬功能,诱导巨噬细胞产生NO,提高脾淋巴细胞转化率及淋转指数。结论西洋参皂甙能提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能,增强小鼠细胞免疫与体液免疫功能。

RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对HEK293细胞凋亡的影响309-312

摘要：目的探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293（HEK293）细胞凋亡的影响以及干扰素（IFN）在此机制中的作用。方法取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组（瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU）、pcDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒pcDNA3.1（-）,作为阴性对照]、Poly I∶C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸（Poly I∶C）,作为阳性对照]、IFNβ-293组（加入1.65×104 U IFNβ,作为阳性对照）、空白对照组（未经处理的HEK293细胞）和HBs-293组（瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs）,转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平。结果瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβmRNA的水平显著上调。结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡。