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中国生物制品学 2010年第11期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性1153-1157

摘要：目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a（＋）载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高（P〈0.01）。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。

中国百日咳鲍特菌ptxS1和prn基因多态性分析1158-1162

摘要：目的分析我国近50年来分离的百日咳鲍特菌抗原百日咳毒素（Pertussistoxin,PT）S1亚基（ptxS1）和百日咳黏附素（Pertactin,prn）基因多态性。方法收集85株百日咳杆菌,分别进行ptxS1和prn基因的PCR扩增和测序,并对序列进行比较分析。结果共发现4个ptxS1基因型和6个prn基因型的百日咳杆菌。自20世纪60年代,非疫苗型ptxS1A菌株逐渐取代疫苗型菌株;含有prn2和prn3新基因型的菌株出现在2000年以后。基因的系统进化树显示,菌株ptxS1和prn基因型的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在97%以上。结论我国近50年流行的百日咳临床分离菌株ptxS1和prn基因存在抗原漂移现象,本研究为加强我国百日咳的流行病学监控与新型无细胞百日咳疫苗的研发奠定了基础。

免疫蛋白质组学技术筛选布鲁菌高免疫原性膜蛋白1163-1167

摘要：目的建立布鲁菌免疫蛋白质组学方法,从羊布鲁菌膜蛋白中筛选免疫候选抗原。方法提取羊布鲁菌16M膜蛋白,进行双向电泳（2-DE）分离,分别用牛、羊布鲁菌感染的阳性血清进行Westernblot分析,筛选出的免疫显性蛋白点进行LC-MS/MS质谱鉴定,并进行生物信息学分析。结果筛选出56个免疫显性蛋白点,鉴定成功35个,其中有12个蛋白是能够被牛、羊2种血清共同识别的抗原。数据检索显示,这些蛋白主要涉及布鲁菌的能量代谢,蛋白质、氨基酸合成,脂肪酸代谢及糖和辅酶的合成等生物过程。结论利用免疫蛋白质组学技术成功筛选出羊布鲁菌高免疫原性膜蛋白,为布鲁菌亚单位疫苗的研制提供了大量的候选抗原。

靶向人Gadd45α基因的shRNA慢病毒载体对缺氧致人脐静脉内皮细胞生物学功能损伤的影响1168-1172

摘要：目的研究靶向人生长阻滞和DNA损伤45α（Growth arrest and DNA damage 45 alpha,Gadd45α）基因和表达绿色荧光蛋白（Green fluorescert protein,GFP）的shRNA慢病毒载体对缺氧致人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelialcells,HUVECs）表达上调的Gadd45α的沉默作用,初步阐明Gadd45α在缺氧应激致HUVECs生物学功能损伤过程中的作用。方法慢病毒包装后感染HUVECs,筛选最适MOI及感染时间。感染72h后,采用Real-time PCR和Western blot检测细胞中Gadd45αmRNA和蛋白的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Transwell小室实验检测细胞的迁移率;ELISA检测细胞sFlt-1和sEng的分泌水平。结果包装后慢病毒载体的滴度为1×10^8TU/ml,最适MOI为20,最适感染时间为72h,对HUVECs的感染效率约为80%。Gadd45α shRNA慢病毒载体对Gadd45α基因的沉默效率可达80%,阴性对照慢病毒载体对Gadd45α的表达无抑制作用。缺氧可致HUVECs中Gadd45α的表达上调,靶向Gadd45α基因的shRNA慢病毒颗粒可有效抑制缺氧致HUVECs的凋亡,减少sFlt-1及sEng的释放,同时增强其体外迁移能力,与缺氧组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）。Gadd45α蛋白的表达水平与sFlt-1及sEng的分泌水平呈正相关（r1=0.89,r2=0.77,P均〈0.05）。结论沉默Gadd45α基因对缺氧应激条件下的HUVECs生物学功能具有保护作用;Gadd45α可能是一个关键上游位点,参与子痫前期时sFlt-1及sEng的释放。

抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对人自然杀伤细胞肿瘤杀伤活性的抑制作用1173-1177

摘要：目的探讨抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对体外扩增的人自然杀伤（Natural killer,NK）细胞的肿瘤杀伤活性的影响。方法体外活化人外周血单个核细胞来源的NK细胞,并检测其表面黏附分子DNAM-1和LFA-1的表达水平;通过Trans-well阻隔试验,阻断NK细胞与靶细胞接触,考察细胞-细胞直接接触对NK细胞杀伤活性的影响;通过NK细胞毒性试验,引入抗DNAM-1单克隆抗体和抗LFA-1单克隆抗体,阻断相应信号途径,考察相关黏附分子在NK细胞肿瘤杀伤过程中的作用。结果体外活化的NK细胞高表达表面黏附分子DNAM-1和LFA-1。阻断NK细胞与靶细胞接触,NK细胞的肿瘤杀伤效应大大降低。应用单克隆抗体阻断DNAM-1或LFA-1信号途径,可显著降低NK细胞肿瘤的杀伤效应;联合阻断DNAM-1和LFA-1信号途径,可进一步降低NK的细胞杀伤效应。结论细胞-细胞间直接接触是NK细胞发挥肿瘤杀伤效应的重要机制,表面黏附分子DNAM-1和LFA-1介导的信号途径对维持NK细胞肿瘤杀伤活性具有重要意义。

多效生长因子对Schlafen3和Schlafen4基因表达的负调控作用1178-1181

摘要：目的研究多效生长因子（Pleiotrophin,PTN）对Schlafen3（Slfn3）和Schlafen4（Slfn4）基因表达的负调控作用。方法采用RT-PCR和Northern blot法检测对照细胞（表达Ptn的Pten-/-小鼠胚胎成纤维细胞）与Ptn-/-细胞（Ptn表达沉默的Pten-/-小鼠胚胎成纤维细胞）中Slfn3/Slfn4基因的表达;分析人脑胶质瘤U87MG细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞中Ptn与Slfn3/Slfn4基因表达水平的关系;在Ptn-/-细胞培养液中加入50ng/mlPTN,检测Slfn3/Slfn4基因的表达;用Ptn-/-细胞培养液作用对照细胞后,检测Slf3/Slf4基因的表达。结果 Ptn-/-细胞中Slfn3/Slfn4基因高表达;在U87MG和MDA-MB-231细胞中,Ptn与Slfn3/Slfn4基因的表达呈负相关;在Ptn-/-细胞培养液中加入PTN后,Slfn3/Slfn4基因的表达受到抑制;Ptn-/-细胞培养液对Slfn3/Slfn4基因的表达具有诱导作用。结论 PTN对Slfn3/Slfn4基因的表达具有负调控作用。

Tgo DNA聚合酶的表达、纯化及其扩增性能1182-1184

摘要：目的表达、纯化Tgo DNA聚合酶,并检测其扩增性能。方法采用PCR技术从嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius中扩增Tgo DNA聚合酶基因,并克隆至含His-Tag靶序列的pET101载体中,转化E.coliBL21Sta（rDE3）,IPTG诱导表达。目的蛋白纯化后经SDS-PAGE分析,并利用标准pfu酶,采用对比法初略测定酶活性;以质粒pUC19为模板,用Tgo酶和pfu酶进行PCR扩增,比较二者的扩增效率,采用改进的蓝白试验法检测Tgo酶的扩增忠实性。结果 PCR扩增的Tgo DNA聚合酶基因大小约2300bp,根据测序获得的基因序列推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的序列一致。表达的目的蛋白为可溶性蛋白,相对分子质量约为89000,表达量为350μg/gE.coli,50%甘油保存的酶活性约为5U/μl。Tgo酶和pfu酶的扩增产出率和忠实性均相当。结论成功表达并纯化了Tgo DNA聚合酶,其扩增性能与pfu酶相当。

圆弧青霉碱性脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达1185-1189

摘要：目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达圆弧青霉碱性脂肪酶（Alkaline lipase,LipⅠ）。方法采用RT-PCR法从圆弧青霉PG37中扩增lipⅠ基因的cDN段,克隆入表达质粒pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-lipⅠ,转化入毕赤酵母GS115,筛选高拷贝重组子GS115/lipⅠ,甲醇诱导表达,并对诱导表达条件进行初步优化。结果 GS115/lipⅠ在培养基初始pH6.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,于30℃诱导96h,发酵液上清中LipⅠ的活性为10.5U/ml。在培养基初始pH9.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,24℃诱导120h,GS115/lipⅠ发酵液上清中LipⅠ的活性最高,达407U/ml。结论在毕赤酵母GS115中高效表达了具有活性的圆弧青霉LipⅠ。

神经纤毛蛋白1基因RNA干扰质粒对胃腺癌细胞SGC7901增殖和凋亡的影响1190-1192

摘要：目的探讨神经纤毛蛋白1（Neuropilin1,NRP1）基因RNA干扰质粒对胃腺癌细胞SGC7901增殖和凋亡的影响。方法构建NRP1基因特异性shRNA表达质粒,经脂质体介导转染入人胃腺癌SGC7901细胞。采用Western blot法检测细胞中NRP1蛋白的表达水平,应用流式细胞术和Annexin-V-FITC/PI法检测细胞的增殖水平和凋亡率。结果经酶切及测序鉴定证明,shRNA-NRP1质粒构建正确,转染SGC7901细胞48h后,能有效抑制NRP1蛋白的表达,G0/G1期细胞百分比显著升高,S期细胞显著减少,细胞凋亡率增加。结论 shRNA-NRP1质粒能有效抑制胃腺癌SGC7901细胞株NRP1蛋白的表达,细胞周期阻滞在G0/G1期,从而降低细胞的增殖水平,诱导细胞进入凋亡期。

铁载体受体蛋白IroN的原核表达及其对肠道外致病性大肠杆菌感染小鼠的免疫保护作用1193-1197

摘要：目的原核表达重组铁载体受体蛋白IroN,并探讨其对小鼠肠道外致病性大肠杆菌群（Extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC）感染的免疫保护作用。方法从E.coliJ96基因组DNA中扩增IroN基因,克隆入原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达质粒pET-32a-IroN,转化E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达的重组IroN蛋白纯化后,经皮下免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和尿液中的抗体水平;以E.coliJ96菌株分别经腹腔和尿道途径攻击免疫小鼠,计算保护率并计数细菌数。结果重组IroN蛋白的表达量为32%,纯化后纯度超过85%,且具有良好的反应原性。重组IroN蛋白经皮下免疫小鼠,可诱导小鼠血清产生高水平的特异性IgG抗体,在尿液中未检测到特异性IgA抗体。重组IroN蛋白对腹腔攻击ExPEC感染小鼠的保护率为81.8%（P〈0.05）;重组IroN蛋白免疫的小鼠经尿道攻击ExPEC后,肾脏分离的菌落数比对照组（PBS免疫）降低了100倍以上（P〈0.05）,但膀胱和尿液中的菌落数两组差异无统计学意义（P〉0.05）。结论已原核表达并纯化了IroN蛋白,其对ExPEC感染小鼠的腹腔和肾脏具有显著的保护作用,但对膀胱感染无保护作用。

不同品种马属动物的免疫效果分析1198-1200

摘要：目的分析不同品种马属动物的免疫效果。方法对不同地区、不同品种的马属动物进行分群,采用相同的破伤风类毒素及免疫方法免疫,分析不同群之间的抗毒素效价、免疫成功率、形成免疫耐受的程次、马匹淘汰率的差异及平均免疫寿命。结果不同群之间免疫效果存在差异,身体素质和健康状况不同的马匹,免疫效果不同。结论要生产高效价的免疫血清,应选择高质量的马匹,可采用育种方法培育出适合免疫血清生产用的优良马匹。

旋毛虫成虫与肌幼虫排泄分泌抗原蛋白组分的比较分析1201-1203

摘要：目的比较大理猪源旋毛虫（Trichinela spiralis）成虫与肌幼虫排泄分泌抗原（Excretory-secretory antigens,ES）的蛋白组分差异,并进一步分析其反应原性,为分离筛选出免疫原性和反应原性强的旋毛虫抗原成分奠定基础。方法分别收集和纯化旋毛虫成虫、肌幼虫虫体,制备ES,采用SDS-PAGE分析成虫和肌幼虫ES蛋白成分,Western blot分析其反应原性。结果经SDS-PAGE分析,旋毛虫成虫ES显示17条蛋白条带,相对分子质量范围在120000～14000之间,其中主带6条,相对分子质量分别为120000、64000、43000、40000、35000、33000;旋毛虫肌幼虫ES显示20条蛋白条带,相对分子质量范围在112000～10000之间,其中主带11条,相对分子质量分别为112000、66000、56000、55000、53000、49000、45000、43000、25000、21000、10000。Westernblot分析表明,旋毛虫成虫ES抗原显示7条反应带,相对分子质量分别为43000、40000、35000、27000、19000、18000、14000,其中相对分子质量43000、40000、27000、18000的条带着色明显;旋毛虫肌幼虫ES抗原显示14条反应带,相对分子质量范围在74000～12000之间,其中相对分子质量53000、49000、45000、43000、35000、27000、18000、12000的条带显色明显。结论旋毛虫成虫和肌幼虫ES抗原蛋白组分均复杂,有共同组分,也有不同组分,旋毛虫ES抗原具有较强的反应原性,是旋毛虫病研究的重要候选抗原。

植物乳杆菌组氨酸脱羧酶基因的克隆及序列分析1204-1206

摘要：目的克隆植物乳杆菌组氨酸脱羧酶（Histidine decarboxylase,HDC）基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中登录的乳酸菌HDC基因序列设计引物,提取植物乳杆菌Uvs44基因组DNA进行PCR扩增及克隆,并与其他乳杆菌HDC基因的核苷酸序列进行同源性分析。结果克隆的植物乳杆菌HDC基因大小约为900bp,其核苷酸序列与Lactobacillus sakei同源性最高,为99.9%;与Lactobacillus buchneri的同源性最低,为89.1%。32～489bp为高变区序列,T和C发生的替换较多。结论为产组胺乳酸菌的检测提供了理论依据,也为构建HDC基因缺失工程菌奠定了基础。

破伤风毒素重组质粒的构建及应用1214-1216

摘要：目的构建含破伤风毒素（Tetanus toxin,TT）特异性基因片段的重组质粒,并对其进行应用。方法采用PCR方法,以破伤风灭活菌株基因组DNA为模板,扩增TT的3个特异性基因片段,连接至pMD19-TSimple载体,构建重组质粒pMD19-TTx,以其为阳性参照对模拟破伤风危险品进行PCR检测。结果 PCR及测序证明重组质粒构建正确,以其为阳性参照可快速检出破伤风模拟危险品。结论成功构建了TT重组质粒pMD19-TTx,为破伤风梭菌的检测提供了阳性参照。

中国生物制品学杂志预防制品

Asia 1型FMDV复合多表位亚单位疫苗在毕赤酵母中的表达及其免疫原性1217-1221

摘要：目的构建以霍乱毒素B亚单位（Cholera toxin B subunit,CTB）为分子佐剂的Asia1型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）复合多表位亚单位疫苗,在毕赤酵母中进行表达,并评价其免疫原性。方法构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K-P1/2A-CTB-TEpi,转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,表达产物经硫酸铵沉淀法纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将纯化的P1/2A-CTB-TEpi蛋白和FMD灭活疫苗分别免疫BALB/c小鼠,以注射PBS作为对照,分别于0、21d各免疫1次。每周尾静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清抗体水平;第2次免疫后10d,处死小鼠,分离脾脏淋巴细胞,进行淋巴细胞增殖试验和IFNγELISPOT检测。结果目的蛋白在毕赤酵母中经诱导表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为82600（P1/2A）和40500（CTB-TEpi）处可见2条特异性蛋白表达条带,占上清液中可溶蛋白的21%。纯化后的目的蛋白P1/2A和CTB-TEpi的比例约为1∶2,且具有良好的反应原性。P1/2A-CTB-TEpi蛋白免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其特异性血清抗体水平与灭活疫苗组差异无统计学意义（P〉0.05）,而淋巴细胞增殖水平和IFNγ分泌水平显著高于灭活疫苗组（P〈0.01）。结论构建了以CTB为分子佐剂的Asia1型FMDV复合多表位亚单位疫苗,其免疫原性良好,为FMD多表位疫苗和亚单位疫苗的研究奠定了基础。

鳜致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗原液生产工艺的建立1222-1225

摘要：目的建立鳜致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗原液的生产工艺。方法分别采用摇瓶和5L发酵罐于28℃培养嗜水气单胞菌GYK1株,测定不同时间菌液的A650值;培养菌液添加不同浓度的甲醛液,检测不同时间的灭活效果;依次采用摇瓶、种子罐、发酵罐培养,甲醛灭活,制备灭活疫苗原液,并进行安全性和效力试验。结果摇瓶培养时,培养菌液18h进入生长稳定期,24h左右达高峰;用5L发酵罐培养时,培养菌液8h即进入生长稳定期,10h左右达高峰;0.30%的甲醛,37℃,24h可完全灭活菌液,且甲醛残留量较低;制备的灭活疫苗原液安全性良好,效力合格。结论初步建立了鳜致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗原液的生产工艺。

中国生物制品学杂志治疗制品

氨氯地平对小鼠肝癌H_（22）细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响1235-1238

摘要：目的探讨氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响。方法用不同浓度的氨氯地平作用小鼠肝癌H22细胞,采用MTT法检测细胞的增殖水平,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,免疫组化及RT-PCR法检测细胞周期蛋白CyclinB1和肿瘤抑制基因p53在蛋白水平和基因水平的表达。结果氨氯地平（1.75×10^-3、3.5×10^-3、7×10^-3、14×10^-3、28×10^-3mg/ml）作用24、36、48h,均可抑制细胞增殖,作用48h的半数抑制浓度（IC50）为13.4μmol/L;氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞细胞周期G2期具有阻滞作用且可使细胞发生凋亡;氨氯地平作用后的小鼠肝癌H22细胞周期蛋白CyclinB1的表达明显降低,p53表达明显增高,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论氨氯地平能显著抑制小鼠肝癌H22细胞增殖,并通过下调G2期周期蛋白CyclinB1水平和上调肿瘤抑制基因p53的表达而达到抗肿瘤效果。

中国生物制品学杂志诊断制品

多聚赖氨酸为载体的聚合物标记物在丙型肝炎病毒核心抗原检测中的应用1239-1243

摘要：目的探讨以多聚赖氨酸为载体的聚合物标记物在丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）核心抗原检测中的应用。方法以多聚赖氨酸作为载体,将HCV核心抗原单克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联形成聚合物标记物,同时制备过碘酸钠标记物,比较两种标记物中的抗体相对含量及抗体反应性;将两种标记物分别应用于ELISA和Western blot法检测HCV核心抗原中,比较二者的检测结果,并与市售试剂盒进行比较。结果通过竞争抑制和直接结合试验结果显示,当达到50%抑制率时,聚合物标记物和过碘酸钠标记物的游离抗体浓度分别为0.0019和0.0011mg/ml;当A403值为1.0时,聚合物标记物的稀释度为1：200000左右,而传统标记物为1：20000左右。聚合物标记物和过碘酸钠标记物应用于ELISA法,检测HCV核心抗原的最低检测限分别为2.0和10pg/ml,试验内、试验间变异系数均〈10%,特异性良好,临床血清标本检测结果与市售试剂盒的符合率分别为97.0%和98.6%;在Western blot检测中,与过碘酸钠标记物相比,聚合物标记物至少可以提高检测灵敏度10倍。结论以多聚赖氨酸为载体的聚合物标记物可应用于HCV核心抗原的ELISA和Western blot检测,且能提高酶、抗体的比例,进而提高检测的灵敏度,防止漏检。