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中国生物制品学 2010年第08期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

骨髓间充质干细胞对大鼠脑胶质瘤C6细胞系分化的影响793-796

摘要：目的探讨骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）对大鼠脑胶质瘤C6细胞系分化的影响及其相关机制。方法用Transwell小室共培养BMSCs与C6细胞,采用细胞计数法检测C6细胞增殖水平;流式细胞术检测C6细胞的细胞周期;免疫荧光与免疫组化法分别检测波形蛋白（vimentin）和胶质纤维酸性蛋白（Glia lfibrillary acidic protein,GFAP）的表达;生化法检测谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）的活性。结果 BMSCs对C6细胞的增殖具有抑制作用;与BMSCs进行双层培养72h的C6细胞出现G0/G1期细胞周期阻滞,双层培养组的C6细胞GFAP表达明显增强,同时vimentin表达减弱,并且这两种分化标志物在细胞内的分布及排列发生了改变;双层培养组C6细胞内GS活性升高。结论 BMSCs能诱导C6细胞向成熟星形胶质细胞分化,可能与BMSCs分泌的某些细胞因子有关。

BCG-CpG-DNA一般毒性的初步评价797-802

摘要：目的观察BCG-CpG-DNA对小鼠急性毒性和28d长期毒性作用,评价其一般毒性。方法小鼠分别经背部皮下给予BCG-CpG-DNA100、250和500μg1次（急性毒性试验）和7次（28d长期毒性试验）,对照组注射生理盐水。单次给药后观察小鼠的生长情况和体重变化,14d后观察脏器是否发生病变;重复给药期间及末次给药后3周恢复期内,每周观察小鼠外观体征、局部刺激性和体重变化;末次给药后3d及3周检测血液学、血液生化学指标及主要脏器系数和抗双链DNA抗体水平。结果 BCG-CpG-DNA急性毒性试验中,各组小鼠均健康存活,体重增加,无毒性反应。BCG-CpG-DNA28d长期毒性试验中,动物体重、行为活动无异常,给药部位无局部刺激性表现;BCG-CpG-DNA重复给药可提高小鼠免疫细胞的数量;末次给药后3d,各试验组脾脏系数均高于对照组,且差异有统计学意义（P〈0.05）,经过3周恢复期回复正常;各试验组血清中抗双链DNA水平与对照组比较,差异无统计学意义,均低于25U/ml的临界值。结论 BCG-CpG-DNA主要影响小鼠的免疫细胞和免疫器官,未见其他明显的急性毒性和长期毒性作用,表明BCG-CpG-DNA具有较好的安全性。

中国生物制品学杂志消息

征稿802-802

摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和中国生物技术集团公司长春生物制品研究所主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。

中国生物制品学杂志基础研究

S-腺苷酰-L-甲硫氨酸对肝癌细胞HepG2增殖、迁移及癌基因C-myc表达的影响803-806

摘要：目的探讨S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAMe）对肝癌细胞HepG2增殖、迁移及癌基因C-myc表达的影响,为深入研究SAMe在肝癌治疗中的作用奠定基础。方法体外培养HepG2细胞,MTT法检测不同浓度SAMe作用不同时间对HepG2细胞增殖的影响;细胞划痕法检测最适浓度SAMe对HepG2细胞迁移能力的影响;RT-PCR、免疫细胞化学法及Westernblot法检测SAMe对HepG2细胞癌基因C-myc转录、蛋白定位及表达的影响。结果终浓度为15.0μmol/L的SAMe处理细胞5d,细胞抑制率达54.6%,且抑制作用呈时间与剂量依赖性;经15.0μmol/LSAMe处理的细胞迁移能力明显下降,愈合速率为对照组的76.78%;细胞中癌基因C-myc的转录和蛋白表达均明显下降,蛋白定位无明显变化。结论 SAMe可通过降低C-myc的表达,抑制HepG2细胞的增殖和迁移,为肝癌治疗性药物的研究提供了一个新的方向。

解偶联蛋白-2在软脂酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗中的作用及其与核转录因子-κB的关系807-812

摘要：目的探讨解偶联蛋白-2（Uncoupling protein-2,UCP-2）在软脂酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗（Insulin-resistance,IR）中的作用及其与核转录因子-κB（Nuclearfactor-κB,NF-κB）的关系。方法将HepG2细胞分为正常对照组、软脂酸组（加0.25mmol/L软脂酸）、高胰岛素组（加100nmol/L胰岛素）、软脂酸＋京尼平组（加0.25mmol/L软脂酸和10μmol/L京尼平）,培养24h后,再用100nmol/L胰岛素刺激,分别于12h后测定培养液中葡萄糖、MDA、SOD、ALT、AST、GGT、TG的浓度;油红O染色法观察细胞的脂变情况;流式细胞术检测线粒体膜电位改变;30min后采用半定量RT-PCR及Westernblot法检测细胞IRS-2、UCP-2及NF-κB的表达水平。结果胰岛素作用12h后,细胞培养液中葡萄糖含量软脂酸组与高胰岛素组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。培养液中葡萄糖含量、ALT、AST、MDA、GGT、TG的含量及UCP-2和NF-κB的表达水平,软脂酸组均较正常对照组和软脂酸＋京尼平组显著升高（P〈0.05）,软脂酸＋京尼平组与正常对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。线粒体膜电位、SOD和IRS-2的水平,软脂酸组显著低于正常对照组和软脂酸＋京尼平组（P〈0.05）,软脂酸＋京尼平组与正常对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 UCP-2在软脂酸诱导的肝脏胰岛素抵抗中起着重要作用,其机制可能与NF-κB有关。

幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS的原核表达及纯化813-815

摘要：目的原核表达并纯化幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS,为深入研究其功能及其在幽门螺杆菌耐酸机制中的作用奠定基础。方法以幽门螺杆菌菌株26695基因组为模板,采用PCR法扩增ArsS基因,插入pET-22b（＋）载体,构建重组原核表达质粒pET-22b（＋）-ArsS,转化E.coliBL21（DE3）,0.5mmol/LIPTG25℃诱导表达,并采用亲和层析与分子筛层析对重组蛋白进行纯化。结果重组原核表达质粒pET-22b（＋）-ArsS经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组蛋白以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;分子筛层析图谱显示,在150mmol/LNaCl条件下,目的蛋白层析效果较好,纯化后的重组蛋白纯度可达95%以上,浓度约为10mg/ml。结论已成功原核表达并纯化获得了高纯度的ArsS蛋白。

蛋白酶体抑制剂诱导的PC12细胞帕金森病模型中血红素加氧酶-1的差异表达816-820

摘要：目的探讨蛋白酶体抑制剂（Proteasome inhibitor,PSI）诱导的PC12细胞帕金森病（Parkinson disease,PD）模型中血红素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1,HO-1）的差异表达,为深入研究PD的发病机制提供理论依据。方法取培养的PC12细胞,加入终浓度为10μmol/L的PSI,建立PSI诱导的PC12细胞模型,以加入终浓度为10μmol/L的二甲基亚砜（DMSO）为对照组。经HE、AO＆EB及α-SYN染色进行鉴定;PSI作用48h后提取蛋白,应用荧光差异凝胶电泳（DIGE）系统获得差异蛋白点,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOFProMS）鉴定差异蛋白。结果模型组与对照组比较,PSI作用48h可见细胞内嗜酸性类Lewy小体形成及细胞凋亡,凋亡率达（24.74±4.55）%。模型组与对照组比较,HO-1表达量显著增加。结论在泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system,UPS）功能障碍诱发PD过程中,氧化应激反应发挥着一定的作用。

糖尿病肾病相关微小RNA对高糖下肾小球系膜细胞增殖的影响及其机制821-824

摘要：目的探讨在高糖培养条件下,糖尿病肾病相关微小RNA（MicroRNA,miRNA）即miR-21对小鼠肾小球系膜细胞生长、增殖的影响,及miR-21高表达对PTEN/PI3K信号途径的影响。方法采用高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞模拟糖尿病状态,在Lipofectamine2000介导下经miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21转染,G418筛选获得稳定表达细胞株。采用实时RT-PCR检测转染细胞miR-21的表达水平,MTT法检测细胞增殖,细胞免疫化学法和Western blot法检测PTEN/PI3K信号途径关键分子PTEN、phospho-Ak（tSer473）和PI3Kp85α蛋白的表达水平。结果筛选出的肾小球系膜细胞能稳定高表达miR-21;高表达的miR-21对细胞增殖能力有明显的抑制作用,且可显著下调PTEN的表达水平（P〈0.05）,同时上调phospho-Akt（Ser473）和PI3Kp85α的表达水平（P〈0.05）。结论 miR-21可通过特异性靶向抑制PTEN蛋白的表达,提高phospho-Akt（Ser473）和PI3Kp85α蛋白的表达水平,以减缓肾小球系膜细胞增殖,可能为一个预防和治疗糖尿病肾病新型的潜在靶点。

奶牛胎衣不下与胎儿胎盘中iNOS、eNOS及MMP-2表达的相关性825-828

摘要：目的分析奶牛胎衣不下（Retained fetal membranes,RFM）与胎儿胎盘中诱导型一氧化氮合酶（Induction nitric oxid esynthase,iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,eNOS）和基质金属蛋白酶-2（Matrix metallopeptidase-2,MMP-2）表达的相关性,探讨RFM发生的分子机制。方法 RT-PCR扩增、克隆产后胎衣正常脱落（No retention of fetal membranes,NRFM）和RFM奶牛胎儿胎盘中iNOS、eNOS和MMP-2基因,以牛β-actin基因为内参,采用荧光定量PCR法检测RFM和NRFM奶牛胎儿胎盘组织中iNOS、eNOS和MMP-2基因表达的差异。结果克隆的iNOS、eNOS和MMP-2基因片段与GenBank中登录的核苷酸序列同源性均达100%。RFM组iNOS基因mRNA的转录水平明显高于NRFM组（P〈0.05）,eNOS和MMP-2基因mRNA的转录水平则明显低于NRFM组（P〈0.05）。结论 iNOS、eNOS和MMP-2基因mRNA的转录水平与RFM的发生密切相关。

重组人核糖核酸酶抑制因子腺相关病毒的构建及表达834-838

摘要：目的构建携带全长人核糖核酸酶抑制因子（Ribonuclease inhibitor,RI）基因的重组腺相关病毒,并在膀胱癌细胞T24中表达。方法 Trizol法提取人脐静脉内皮细胞ECV30总RNA,经RT-PCR扩增RI基因,克隆至pUCm-T质粒中,再亚克隆至pAAV-IRES-hrGFP载体,构建pAAV-IRES-hrGFP-RI重组质粒,与pAAV-RC和pAAV-Helper质粒共转染HEK293细胞,包装并扩增腺相关病毒RI-AAV,检测其感染性滴度,并转染T24细胞,采用RT-PCR检测RI基因mRNA的转录水平,Westernblot检测RI蛋白的表达水平。结果重组质粒pAAV-IRES-hrGFP-RI经酶切及测序鉴定构建正确;重组腺相关病毒RI-AAV的感染性滴度为1.1×1010U/ml;RI-AAV转染的T24细胞RI基因mRNA的转录水平及蛋白表达水平较未转染组及空病毒转染组均显著提高,且差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论已成功构建人RI基因重组腺相关病毒,为进一步研究RI对膀胱癌细胞的侵袭和转移的作用奠定了基础。

体外循环对兔骨骼肌葡萄糖转运蛋白4和胰岛葡萄糖转运蛋白2的影响839-842

摘要：目的观察体外循环（Cardiopulmonary bypass,CPB）对兔骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（Glucose transporter 4,GLUT4）和胰岛葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）的影响,探讨CPB中高血糖的可能机制。方法取健康成年新西兰大白兔24只,随机分为正常对照组（N组）和CPB组（C组）,每组12只。N组不行CPB,C组行CPB。两组分别于麻醉后即刻（T1）、主动脉阻断即刻（T2）、主动脉开放5min（T3）、主动脉开放35min（T4）和主动脉开放75min（T5）采集动脉血液,氧化酶法检测血糖水平,放免法检测胰岛素水平;免疫组织化学法检测主动脉开放5min和75min时骨骼肌总GLUT4和细胞膜上GLUT4的转位表达及开放75min时胰岛细胞GLUT2的表达。结果与T1比较,两组T2～T5的血糖和胰岛素水平均显著升高（P〈0.05）;C组T2～T5的血糖和胰岛素水平较N组显著升高（P〈0.05）;主动脉开放5min和75min时,C组骨骼肌总GLUT4和细胞膜上GLUT4的转位表达均显著下调（P〈0.05）;主动脉开放75min时,胰岛细胞GLUT2的表达显著上调（P〈0.05）;C组主动脉开放75min比5min时,骨骼肌总GLUT4和细胞膜上GLUT4的转位表达均显著上调（P〈0.05）。结论兔CPB中高血糖可能与骨骼肌GLUT4表达下调和转位障碍有关。胰岛细胞GLUT2表达上调可能使胰岛素分泌增加,但增加的胰岛素并不能完全代偿高血糖。

改良RPMI1640培养基对CIK细胞增殖的影响843-844

摘要：目的探讨改良RPMI1640培养基对CIK细胞体外增殖的影响,为临床治疗提供质量好、数量多的CIK细胞。方法用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞,分别采用传统RPMI1640培养基和改良RPMI1640培养基培养,于培养当天及3、6、9、12、15、18d,采用台盼蓝拒染法计数细胞,检测细胞的增殖水平;流式细胞术分析细胞表型;MTT法检测CIK细胞的体外细胞毒活性。结果培养至第12天后,改良培养基培养条件下,CIK细胞的增殖倍数明显高于传统培养基培养的CIK细胞（P〈0.05）;CD3＋CD56＋细胞比例达33%以上;培养15d,对BGC-823和SPC-A-1细胞的细胞毒活性均高于传统培养基。结论改良RP-MI1640培养基较传统RPMI1640培养基可更好地促进CIK细胞增殖,为其临床应用提供了试验数据。

中国生物制品学杂志预防制品

Poly IC佐剂狂犬病疫苗诱导小鼠的免疫应答852-856

摘要：目的观察PolyIC佐剂狂犬病疫苗诱导小鼠的免疫应答。方法将PolyIC佐剂狂犬病地鼠肾细胞疫苗（PHKCV＋P）、人用狂犬病地鼠肾细胞疫苗（PHKCV）和中国狂犬病疫苗参考品（R）稀释后,分别于0d1次和0、7d2次腹腔注射BALB/c小鼠,另设PolyIC佐剂对照组（P）和空白对照组（N）,并分别于初免后第7天和第14天处死小鼠,分离血清,检测中和抗体水平;同时取脾脏,采用ELISPOT法检测脾淋巴细胞经狂犬病疫苗刺激后分泌IFNγ的水平;另1组相同免疫的小鼠于初免后第7天和第14天用CVS毒株经脑腔攻击,观察疫苗的保护效果。结果小鼠免疫2针后,PHKCV＋P组小鼠血清中和抗体水平明显高于PHKCV组;免疫1针和2针后,PHKCV＋P组免疫小鼠诱生的特异性IFNγ斑点形成细胞（SFC）数均高于其他疫苗组,其保护效果明显优于PHKCV组。结论 PolyIC佐剂狂犬病疫苗可减少抗原用量,增强细胞免疫和体液免疫应答,特别是能产生早期的细胞免疫应答,从而提高传统狂犬病疫苗的保护效果。

中国生物制品学杂志实验技术

实验动物终末处置的新方法——锐性弹切脊髓高位离断术856-856

摘要：急性生命剥夺（宰杀）是一项与动物福利相关且经常发生的重要事件。对实验动物处死的方法必须尽可能做到不给其带来过多痛苦;不干扰或基本不干扰动物临终前的生理状态;不损坏科学实验研究的靶器官（或组织）;不对实验者造成过大的心理冲击。常用方法有脊髓牵拉断裂法、

中国生物制品学杂志预防制品

轮状病毒基因重配株LD_9（G_2型）Vero细胞适应株的选育及其生物学特性857-860

摘要：目的探讨轮状病毒基因重配株LD（9G2型）在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株（G2型）（LD9-1、LD9-2、LD9-3）在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变（CPE）,病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株（G2型）经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。

中国生物制品学杂志治疗制品

牛睾丸中透明质酸酶的提取及其临床应用860-860

摘要：透明质酸为组织基质中具有限制水分及其他细胞外物质扩散作用的成分,透明质酸酶为一种能水解透明质酸的酶,应用于人体能暂时降低细胞间质的黏性,促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收,为一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂,促进药物的吸收,促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。本研究从牛睾丸中提取透明质酸酶,并应用于临床,现将结果报道如下。

重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立861-865

摘要：目的建立重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体（rhRMcAb）的质控方法和质量标准。方法采用小鼠中和试验（MNT）和快速荧光灶抑制试验（RFFIT）分别测定6批rhRMcAb样品的中和活性;还原、非还原SDS-PAGE检测rhRMcAb样品的纯度;还原烷基化胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法分析rhRMcAb的肽图;焦谷氨酸肽酶去除N-端焦谷氨酸封闭后,氨基酸序列分析仪测定rhRMcAb的N-端氨基酸序列;表面等离子共振法（Surface plasmon resonance,SPR）测定rhRMcAb与狂犬病病毒糖蛋白的亲和常数;按《中国药典》三部（2005版）要求检测rhRMcAb的各项其他指标,并建立其质量标准。结果采用MNT和RFFIT2种方法检测6批rhRMcAb的中和活性,批间活性基本一致;3批rhRMcAb原液的还原SDS-PAGE纯度大于99.0%,非还原SDS-PAGE除抗体主带外,在高、低相对分子质量处分别存在一些次带;3批原液样品的肽图图谱与理化测定对照品一致;N-端氨基酸序列与理论序列一致;结合狂犬病病毒糖蛋白抗原的亲和常数为1.86×108/M;其他各项指标均符合《中国药典》三部（2005版）要求;建立的质量标准中,中和活性应不低于500IU/mg,SDS-PAGE及HPLC纯度应不低于98.0%。结论已建立了rhRMcAb的质控方法和质量标准,可用于rhRMcAb产品的检定。

阿魏酸钠对大鼠纤维化心肌组织中结缔组织生长因子表达的影响871-874

摘要：目的探讨阿魏酸钠（Sodium ferulate,SF）对大鼠纤维化心肌组织中结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）表达的影响。方法一次性皮下注射盐酸异丙肾上腺素（Isoproterenol,Iso）15mg/kg体重,复制Wistar大鼠心肌缺血性坏死模型,于不同时间点脱臼处死大鼠,取心脏,采用半定量RT-PCR法检测大鼠组织中CTGF基因mRNA的转录水平,免疫组化法检测CTGF蛋白的表达水平。再次复制大鼠心肌缺血坏死模型,同时注射SF进行同步干预,3周后检测大鼠心肌组织中CTGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果注射Iso后24h,CTGF基因mRNA的转录水平达高峰,较正常对照组明显增加,3周时仍高于正常对照组;CTGF蛋白的表达随纤维化病变程度的加重而增加。SF干预后,CTGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显下降。结论 CTGF的表达与大鼠心肌纤维化（Myocardial fibrosis,MF）程度密切相关,提示CTGF可能在MF中起重要作用;SF对CTGF的表达具有抑制作用。