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中国生物制品学 2010年第07期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性673-677

摘要：目的在大肠杆菌（E.coli）中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F（rmIL-17F）,并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。

CENP-E变异体在不同肿瘤细胞株及癌组织中的表达差异678-682

摘要：目的研究CENP-E变异体（CENP-EⅠ）在不同肿瘤细胞株及癌组织和相应的癌旁组织中的表达情况。方法应用巢式RT-PCR检测14个细胞株和17份癌组织及相应癌旁组织标本中CENP-EⅠmRNA（缺失第38个外显子）的表达情况,并比较变异体和野生型CENP-E（CENP-EWT） mRNA的表达差异;应用巢式PCR检测上述标本中CENP-E在DNA水平上的变异;并通过细胞增殖试验、细胞周期检测和染色体核型鉴定,分析CENP-EⅠ与细胞恶性程度的相关性。结果 RT-PCR结果显示,实验样本中CENP-E mRNA均有CENP-EWT和CENP-EⅠ两种形式同时存在于一种组织或细胞中,且在正常细胞株和癌旁组织中CENP-EWT表达量较高,在肿瘤细胞株和癌组织中CENP-EⅠ表达量较高,且差异有统计学意义（P〈0.05）;样本中CENP-E在DNA水平上不存在第38个外显子缺失,且细胞间CENP-E表达量的差异无统计学意义（P〉0.05）;CENP-EⅠ与细胞的恶性程度有一定的相关性。结论同一细胞内存在2种或2种以上形式的CENP-E mRNA,CENP-E变异体可能与肿瘤的发生有关。

稳定表达丙型肝炎病毒HLA-A2限制性多表位基因C1R-AAD细胞克隆的建立683-686

摘要：目的建立稳定表达丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性多表位基因的C1R-AAD细胞克隆。方法合成人泛素基因（Ub）和HCVHLA-A2限制性多表位基因（Mep）,分别克隆入原核表达质粒pRSET-A,构建多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pRSET-Ub-Mep,得到复合多表位基因Ub-Mep,亚克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（-）,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1（-）-Ub-Mep,转染至C1R-AAD细胞,G418压力筛选后,通过有限稀释法获得稳定表达Ub-Mep融合蛋白的C1R-AAD细胞克隆,采用RT-PCR法检测稳定转染细胞中Ub-Mep基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Westernblot法检测Ub-Mep蛋白在稳定转染细胞中的表达。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1（-）-Ub-Mep经酶切鉴定证明构建正确;在稳定转染的C1R-AAD细胞中可检测到Ub-MepmRNA和蛋白水平的表达。结论已建立了稳定表达HCVHLA-A2限制性多表位抗原的C1R-AAD细胞克隆,为进一步研究HLA-A2限制性多表位基因诱导的细胞免疫应答建立了靶细胞。

Kozak序列对TIMP1基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响687-691

摘要：目的探讨Kozak序列对基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响。方法构建pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K（含有Kozak序列）重组真核表达质粒,用FugeneHD转染试剂将重组表达质粒转染MCF-7细胞,采用荧光定量PCR和Western blot检测pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K在MCF-7细胞中表达的差异。结果重组真核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。质粒pcDNA3.1-TIMP1-K转染细胞比空白对照细胞TIMP1基因mRNA表达量高约0.95倍,蛋白表达量高0.43倍;而质粒pcDNA3.1-TIMP1转染细胞比空白对照细胞mRNA表达量高0.37倍,蛋白表达量高0.25倍。结论质粒pcDNA3.1-TIMP1-K与pcDNA3.1-TIMP1在MCF-7细胞中mRNA和蛋白表达水平均存在差异,Kozak序列提高了TIMP1基因的表达。

L-精氨酸对高糖高胰岛素诱导心肌细胞肥大的抑制作用692-695

摘要：目的探讨L-精氨酸（L-Arg）对高糖高胰岛素（High glucose and insulin,HGI）诱导心肌细胞肥大的抑制作用。方法体外培养乳鼠心肌细胞,将细胞分为正常对照组（5.5mmol/L葡萄糖）、模型组（HGI组,给予25.5mmol/L葡萄糖与0.1μmol/L胰岛素）、L-Arg低、中、高剂量组（给予HGI组药物,并分别加入0.01、0.1和1.0mmol/L的L-Arg）和L-Arg＋L-NAME组[给予HGI组药物,并加入0.1mmol/LL-Arg和一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,NOS）特异性抑制剂L-NAME],以细胞表面积、蛋白质含量和心房利钠因子（Atrial natriuretic factor,ANF）mRNA表达为反映心肌肥大的指标,观察L-Arg对HGI致心肌细胞肥大作用的影响;采用Real-timePCR法检测内皮型一氧化氮合酶（Endothelial NOS,eNOS）和诱生型一氧化氮合酶（Inducible NOS,iNOS）mRNA的表达;比色法和硝酸还原法分别检测细胞培养液中NOS的活性和NO的含量。结果 L-Arg呈浓度依赖性地抑制HGI诱导的心肌细胞肥大;并上调eNOS mRNA的表达及NOS的活性,增加NO的浓度。NOS抑制剂L-NAME可完全阻断L-Arg的上述作用。结论 L-Arg可通过激活eNOS表达,促进NO释放,产生抗HGI诱导心肌肥大的作用。

缺氧诱导因子-1α与缺氧状态下胃癌细胞侵袭的相关性696-699

摘要：目的探讨缺氧状态下及缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）RNA干扰后,HIF-1α的表达及其与胃癌细胞黏附、游走、侵袭能力的相关性。方法将HIF-1α shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-HIF-1α-2484转染胃癌细胞SGC-7901,构建靶向干扰HIF-1α表达的SGC-7901稳定转染细胞株;采用Western blot法检测缺氧及HIF-1αRNA干扰对SGC-7901细胞HIF-1α表达的影响;MTT法检测缺氧及HIF-1αRNA干扰对SGC-7901细胞黏附能力的影响;采用Boyden Chamber膜侵袭系统,观察缺氧及HIF-1αRNA干扰对SGC-7901细胞游走及侵袭能力的影响。结果 SGC-7901细胞在缺氧培养4、8和16h时,HIF-1α均呈阳性表达,并随时间的延长而显著增加;细胞粘贴率、游走和侵袭穿膜细胞数分别随时间延长而显著增加,与HIF-1α表达呈显著正相关。HIF-1αRNA干扰后,缺氧SGC-7901细胞HIF-1α表达显著下降,细胞粘贴率、游走和侵袭穿膜细胞数均显著下降。结论 HIF-1α的过度表达导致胃癌细胞黏附、游走及侵袭能力增强,可能是胃癌局部侵袭和远处转移的重要原因之一。

庆大霉素诱导急性肾损伤大鼠模型肾损伤分子-1的表达700-703

摘要：目的探讨庆大霉素（Gentamycin,GM）诱导急性肾损伤大鼠模型肾损伤分子-1（Kidney injury molecule-1,KIM-1）的表达。方法建立GM诱导大鼠急性肾损伤模型;检测各组大鼠血、尿各项生化指标;取大鼠肾组织,进行病理组织学观察;ELISA法检测各组大鼠尿液中KIM-1的分泌;RT-PCR法检测各组大鼠肾组织KIM-1mRNA的表达;免疫组织化学SP法检测各组大鼠肾组织KIM-1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）的表达。结果与对照组比较,模型组大鼠血、尿各项生化指标及病理组织学观察均出现不同程度的病变;ELISA检测显示,大鼠尿液中KIM-1的含量显著增高（P〈0.05）;RT-PCR检测显示,肾组织KIM-1mRNA表达上调（P〈0.05）,且呈时间依赖性;免疫组化法检测显示,KIM-1表达量随肾损伤加重而显著升高,且呈时间依赖性。结论 KIM-1具有良好的敏感性和特异性,可作为GM所致肾小管损伤的早期诊断标志物。

不同pH诱导重组和血源人血白蛋白构象变化的光谱分析704-707

摘要：目的分析不同pH诱导重组人血白蛋白（Recombinant human serum albumin,rHSA）和血源人血白蛋白（Plasma-derived human serum albumin,pHSA）的构象变化。方法在不同pH值条件下,分别经紫外和荧光光谱扫描分析rHSA与pHSA及3批rHSA的二阶导数谱及275nm和295nm激发波长下的荧光光谱。结果 rHSA与pHSA的最大吸收波长均为278nm,二阶导数谱和荧光光谱均随pH值发生变化,趋势基本一致;3批rHSA的紫外和荧光光谱间无显著差异。结论 rHSA在不同pH值条件下的构象变化与pHSA基本一致,3批rHSA的构象具有良好的批间一致性。

小鼠微RNA miR-21真核表达质粒的构建及其在小鼠肾小球系膜细胞中的表达708-710

摘要：目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR技术检测miR-21的表达。结果经酶切鉴定和测序证实,合成的miR-21基因序列完全正确,并已成功克隆到真核表达质粒pGenesil-1上。重组真核表达质粒转染小鼠肾小球系膜细胞后,筛选出的阳性克隆可稳定高表达miR-21。结论已成功构建miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中高效表达,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了基础。

大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株的构建与表达711-713

摘要：目的构建大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株,提高邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的产量。方法利用依赖于DpnⅠ酶的PCR方法突变表达载体pET-22b（＋）-Trp Operon上的关键位点,PCR扩增Trp OperonM基因,构建pET-22b（＋）-Trp OperonM重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。制备粗酶液,经比色法测定邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性。结果 PCR扩增产物可见约7000bp的Trp OperonM条带;所构建的重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确;邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性比大肠杆菌BL21（DE3）空菌分别提高了4.5倍和5.2倍。结论已成功构建了大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株BL21（DE3）/pET-22b（＋）-Trp OperonM,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性均有提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。

β-羟丁酸对体外培养牛肝细胞肉碱脂酰基转移酶-Ⅰ转录和翻译水平的影响714-716

摘要：目的检测不同浓度β-羟丁酸（β-hydroxy butyrate,BHBA）对体外培养牛肝细胞肉碱脂酰基转移酶Ⅰ（Carnitine palmityl transferase-Ⅰ,CPT-Ⅰ）转录及翻译水平的影响。方法分别采用荧光定量PCR法和ELISA法,检测不同浓度BHBA（0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8mmol/L）对体外培养牛肝细胞CPT-I基因和蛋白表达的影响。结果随着BHBA浓度的增加,肝细胞CPT-Ⅰ的转录和翻译水平均下降。当BHBA浓度大于1.2mmol/L时,肝细胞CPT-I的转录和翻译水平下降更显著。结论高浓度的BHBA可显著抑制体外培养牛肝细胞CPT-I的表达,可能减少肝细胞脂肪酸氧化代谢。

中国生物制品学杂志消息

征稿716-716

摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和中国生物技术集团公司长春生物制品研究所主办,

中国生物制品学杂志基础研究

激活素A对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用717-719

摘要：目的研究激活素A（Activin A）对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用。方法原代培养孕期17d小鼠胎鼠脑神经细胞,免疫细胞化学染色观察激活素受体（ActRIIA）在神经细胞中的表达;将原代培养神经细胞分为阴性对照组（5%胎牛血清-DMEM/F12培养基）、阳性对照组（4ng/ml神经生长因子）和激活素A（5ng/ml）组,分别于培养第1、3、5、7和9天,采用台酚蓝染色法检测神经元存活情况。结果培养的小鼠胎鼠脑神经细胞可表达ActRIIA;阴性对照组存活神经元呈时间依赖性减少,在培养第9天已检测不到存活的神经元;而阳性对照组和激活素A组在培养第9天仍有部分神经元存活。结论激活素A具有维持小鼠胎鼠大脑皮层神经元长期存活的作用。

中国生物制品学杂志消息

《中国预防医学杂志》征订征稿通知719-719

摘要：《中国预防医学杂志》为中华人民共和国卫生部主管,中华预防医学会主办的预防医学与公共卫生领域权威性学术期刊,国内外公开发行（中国标准刊号：ISSN1009-6639,

中国生物制品学杂志基础研究

单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ的分离纯化及其酶学性质720-723

摘要：目的分离纯化单一组分的单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析其酶学性质。方法单环刺螠体腔液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶过滤等方法进行分离纯化,得到单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE、SDS-PAGE和飞行质谱分析,测定其纯度和相对分子质量;并以酪蛋白为底物,Folin-酚试剂法测定酶活力,对其酶学性质进行分析。结果分离纯化的UFE-Ⅱ具有水解纤维蛋白的活性,其水解酪蛋白的比活力达到375.6U/mg,纯化倍数为10.3倍,回收率为14.0%。UFE-Ⅱ为单一组分,纯度达99%以上,相对分子质量为24329。UFE-Ⅱ的最适反应温度约为45℃;最适反应pH值为7.0;Ca2＋、Mn2＋和Fe2＋是该酶的强激活剂;Fe3＋、Cu2＋和Pb2＋对该酶活力具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF能完全抑制酶活力,表明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂可部分抑制酶活力,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒可较弱地抑制酶活力。结论从单环刺螠体内成功分离纯化出纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析了其酶学性质,该酶具有进一步开发利用价值。

牛乳溶菌酶的原核表达及初步纯化724-726

摘要：目的原核表达并初步纯化牛乳溶菌酶（Bos taurus lysozyme1,LYZ1）。方法人工设计并合成LYZ1基因CDS序列,将其克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-LYZ1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,筛选阳性菌株,经IPTG诱导,初步纯化表达产物,并对其进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果所构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确;SDS-PAGE分析显示,目的蛋白相对分子质量约为32000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的70%以上,切胶纯化后纯度达95%;Western blot分析显示,重组融合蛋白可与小鼠Anti-HisTag单抗特异结合。结论已成功原核表达并初步纯化了LYZ1,为后续研究与应用奠定了基础。

中国生物制品学杂志预防制品

产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性727-729

摘要：目的观察产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性。方法将含ETEC抗原成分热不稳定肠毒素B亚单位（Heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB）的双歧杆菌疫苗给SD大鼠灌胃4次,同时设对照组,以PBS平行灌胃。采用ELISA法检测大鼠粪便上清液IgA及血清IgG抗体水平;免疫组化法检测大鼠空肠中sIgA抗体的表达;肠绊试验检测肠毒素的活性。结果免疫疫苗的SD大鼠粪便上清液中产生了IgA抗体,血清中产生了特异性的IgG抗体,肠道内产生了特异性分泌型sIgA抗体;免疫组化结果显示,随着免疫次数的增加,抗体分泌量明显增加;双歧杆菌疫苗免疫的大鼠能够抵抗LT抗原的侵袭,而对照组大鼠则出现明显的肠道积液现象。结论构建的双歧杆菌疫苗具有良好的免疫效果,可保护SD大鼠免受ETEC的感染。

广州市1992～2007年乙型肝炎疫苗接种率与发病趋势分析730-733

摘要：目的分析广州市1992~2007年乙型肝炎疫苗接种率与发病趋势,为乙肝免疫和防治策略提供依据。方法对广州市1992~2007年出生的儿童乙肝疫苗接种率及乙肝发病率进行调查。结果接种初期（1992~1994年）疫苗接种率为63.14%,接种后期（2002~2007年）为95.72%。1992~2007年1~16岁年龄组乙型肝炎发病13699例,总发病率在（26.21~122.74）/10万之间,其中接种初期发病率最高,为122.74/10万,接种后期最低,为26.21/10万,下降了78.65%。1~5岁、6~10岁和11~16岁组乙肝发病呈逐年下降趋势,降幅分别为54.82%,75.04%和83.04%。接种后期与接种初、中（1995~2001年）期比较,HBsAg阳性率分别下降了80.80%和79.13%,抗-HBs阳性率分别升高了8.70%和13.15%,抗-HBc阳性率分别下降了23.24%和4.29%。结论广州市推广新生儿乙肝疫苗接种已取得良好效果。