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中国生物制品学 2010年第02期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达113-117

摘要：目的构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达。方法采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和pcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达。通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达量,流式细胞术（FCM）分析嵌合抗体的结合活性。结果抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确 RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录 转染后48、72、96和120h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28ng/ml FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合。结论已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1和E蛋白的原核表达及其免疫原性118-123

摘要：目的原核表达乙型脑炎病毒（JEV）NS1和E蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白基因片段,分别克隆入原核表达载体pET-30a（＋）和pET-32a（＋）,构建重组表达质粒pET-30NS1和pET-32Et,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达水平。两种蛋白经亲和层析纯化后,Western blot鉴定其反应原性。通过小鼠主动和被动保护力试验及豚鼠病毒血症试验,检测两种蛋白的免疫原性。结果酶切及测序证明重组表达质粒构建正确 表达的重组NS1和E蛋白的相对分子质量分别约为40000和47000,均以包涵体形式表达 纯化的重组NS1和E蛋白的浓度分别为160.7和380μg/ml,均具有良好的反应原性 小鼠主动和被动保护力试验表明两种蛋白均有保护活性 豚鼠病毒血症试验显示,NS1蛋白免疫豚鼠后能明显抑制病毒血症的产生。结论已成功表达并纯化了JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白,两种蛋白均有较好的免疫保护活性。

低剂量电离辐射对糖尿病小鼠血清中炎症因子表达的影响124-128

摘要：目的探讨低剂量电离辐射（LDR）对链尿佐菌素（STZ）诱导的Ⅰ型糖尿病（DM）小鼠血清中炎症因子表达的影响。方法取健康C57BL/6J小鼠,经腹腔注射STZ复制小鼠糖尿病模型,并设空白对照组。将糖尿病模型小鼠分为DM和DM/LDR组,空白对照组分为LDR组及对照组。DM/LDR组和LDR组给予25mGyLDR,隔日照射1次,共照射4周 DM组和对照组不经LDR照射。分别于照射后2、4、8、12及16周,采用ELISA法检测小鼠血清中不同炎症因子的表达水平。结果LDR照射前,4组小鼠血清中ICAM-1和IL-18的表达水平较为接近,而糖尿病小鼠血清中TNFα和MCP-1的表达水平显著高于非糖尿病小鼠 给予LDR照射后,在不同时间点DM/LDR组小鼠血清中IL-18、MCP-1及TNFα的表达水平与DM组相比,均显著降低,LDR组小鼠血清中IL-18、MCP-1及TNFα的表达水平较对照组明显增加。ICAM-1表达的变化与其他因子不同,LDR照射4周时,糖尿病小鼠显著高于非糖尿病小鼠,但在任何时间点,DM/LDR与DM组、LDR与对照组之间差异均无统计学意义。结论在糖尿病状态下,LDR能有效降低血清中IL-18、TNFα和MCP-1的表达水平,缓解糖尿病肾脏中的炎症反应强度 但在正常机体中表现为提高免疫力,促进免疫相关因子的释放。表明LDR针对机体所处的不同状态发挥着不同的生物调节功能。

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达138-141

摘要：目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1（OAZ1）功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达146-149

摘要：目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100% SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上 Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。

人Makorin环指蛋白1基因沉默对HEK293细胞的影响150-153

摘要：目的探讨特异性抑制人Makorin环指蛋白1（MKRN1）基因的表达对HEK293细胞的影响。方法用脂质体将前期筛选出的含最有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因mRNA转录水平、蛋白表达水平及细胞增殖的影响。结果人MKRN1基因shRNA真核表达质粒转染HEK293细胞后,在mRNA和蛋白水平均能明显上调细胞hTERT基因的表达,且细胞明显增殖。结论抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达,可导致hTERT基因mRNA转录水平和蛋白表达水平上调,并促进细胞增殖。

南蛇藤提取物诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡及其机制154-156

摘要：目的观察南蛇藤乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在体外诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡的作用,并初步探讨其分子机制。方法制备南蛇藤乙酸乙酯和正丁醇提取物,采用MTT法检测二者对SGC-7901胃癌细胞增殖的影响 应用FITC-AnnexinⅤ及碘化丙锭（PI）双标法,通过流式细胞仪（FCM）观察SGC-7901细胞的凋亡率及P53蛋白的表达。结果不同浓度的南蛇藤乙酸乙酯和正丁醇提取物（15、30、60、120μg/ml）对SGC-7901细胞的增殖均有一定的抑制作用,且呈剂量依赖性。两种南蛇藤提取物（60、120、240、480μg/ml）可剂量依赖性地诱导肿瘤细胞凋亡,且随着浓度的升高,SGC-7901细胞P53蛋白的表达也增加,浓度为240和480μg/ml的提取物组与对照组相比,差异有统计学意义。结论南蛇藤乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在体外可诱导SGC-7901细胞凋亡,上调细胞中P53基因的表达可能是其抗肿瘤作用的分子机制之一。

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达157-160

摘要：目的克隆猪血清白蛋白（PSA）基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞的分化161-164

摘要：目的探讨乳鼠视网膜细胞条件分化液诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）的神经分化情况,以期为视网膜退行性疾病提供治疗方案。方法体外分离培养Wistar大鼠乳鼠BMSCs,观察BMSCs的增殖情况并进行鉴定 制备乳鼠视网膜细胞条件分化液,以其诱导BMSCs,观察BMSCs的神经分化情况,并行免疫组化鉴定。结果体外培养获得了较纯的BMSCs 在乳鼠视网膜细胞条件分化液的环境中,诱导后72h,BMSCs胞体收缩成锥形或球形,细胞突起变细、变长,呈神经细胞的典型形态 免疫组化结果显示,部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（nestin）和Thy1.1阳性反应。结论乳鼠视网膜细胞条件分化液可诱导BMSCs分化成视网膜神经节样细胞。

骨髓间充质干细胞在脊髓损伤模型大鼠体内的转化165-167

摘要：目的观察静脉移植骨髓间充质干细胞（MSCs）在脊髓损伤模型大鼠体内向神经样细胞转化的情况。方法体外扩增培养MSCs,流式细胞仪检测表面标志CD34和CD44的表达 采用击打法制备大鼠脊髓损伤模型 Brdu标记的MSCs经尾静脉移植入脊髓损伤模型大鼠体内,输注后21d,取脊髓组织进行免疫组化染色,检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。结果体外扩增的MSCs经流式细胞仪检测不表达CD34,表达CD44 激光共聚焦显微镜下观察可见,移植Brdu标记的MSCs组在大鼠损伤的脊髓组织中可同时表达Brdu和NSE。结论移植的MSCs可迁移到损伤的脊髓组织,并可转化为神经样细胞。

中国生物制品学杂志预防制品

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性168-171

摘要：目的构建口蹄疫病毒（FMDV）VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6% 共表达组和融合表达组保护率均为42.9% 灭活疫苗组保护率为100% 空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。

重组弓形虫热休克蛋白70联合弗氏佐剂免疫小鼠的抗弓形虫感染作用172-175

摘要：目的评价重组弓形虫热休克蛋白70（rTgHSP70）联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠的抗弓形虫感染作用。方法BALB/c小鼠70只,随机分为7组,分别为PBS组、A组（佐剂＋PBS）、20PA组（20μg rTgHSP70＋佐剂）、40P组（40μgrTgH-SP70）、40PA组（40μg rTgHSP70＋佐剂）、60PA组（60μg rTgHSP70＋佐剂）及80PA组（80μg rTgHSP70＋佐剂）,皮下免疫,间隔2周,加强免疫2次,共免疫3次。末次免疫后14d,用2×104个RH株弓形虫速殖子/只灌胃攻击各组小鼠,攻击后30d处死,ELISA检测血清IgG和肠液sIgA 分离脑组织内弓形虫速殖子,并计数。结果在添加佐剂组中,血清IgG水平随rTgHSP70剂量的增加而升高,与PBS组和A组比较,差异有统计学意义 肠液sIgA水平60PA组最高,与20PA和40PA组比较,差异有统计学意义 与PBS组相比,A、20PA、40P、40PA、60PA和80PA组的脑组织内速殖子数分别减少了56.87%、56.46%、61.90%、48.74%、62.87%和70.44%。结论rTgHSP70联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠可诱导一定的抗弓形虫感染作用,80μgrTgHSP70为较佳剂量。

抗乙型脑炎病毒阳性血清抗体效价参考品的制备176-178

摘要：目的制备抗乙型脑炎病毒阳性血清抗体效价参考品。方法评估乙脑病毒IgG酶联免疫试剂盒定量检测不同浓度阳性血清抗体的线性范围、准确性、精密性及特异性,并以正常血清及其他免疫球蛋白产品为对照,对该参考品抗体效价定位进行适用性比较。结果不同浓度阳性血清的线性范围为0.625～10IU/ml,抗体效价回收率为91.2%～112.8%,试验内变异系数≤7.8%,正常血清与阳性血清的乙脑抗体效价相差15倍。试验用的阳性血清乙脑病毒抗体效价设为10U/ml时,在特定的疫苗免疫程序下,效价峰值期能够实现合格血浆≥50%的收获率。结论兼顾原料血浆的可获取性与产品临床效果的难以替代性,特定阳性血清定位为10U/ml。

中国生物制品学杂志治疗制品

红色诺卡菌细胞壁骨架胶囊的制备及其生物学活性179-181

摘要：目的制备红色诺卡菌细胞壁骨架（N-CWS）胶囊,并检测其生物学活性。方法采用超声波法和冷冻干燥法制备N-CWS胶囊,并通过影响因素试验、加速试验及长期试验考察其稳定性,通过小鼠抑瘤试验检测其生物学活性。结果所制备的N-CWS胶囊各项质量指标均符合相关要求,稳定性良好 口服给药对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用。结论本实验制备的N-CWS胶囊质量稳定,抗肿瘤活性强,适于工业化生产。

中国生物制品学杂志诊断制品

高特异性长双歧杆菌多克隆抗体的制备182-184

摘要：目的制备高特异性长双歧杆菌多克隆抗体,为长双歧杆菌的免疫学检测提供参考。方法以破碎的长双歧杆菌细胞碎片为抗原免疫小鼠,制备抗血清 利用偶联相同抗原的磁珠,分离纯化长双歧杆菌多抗,分别采用间接ELISA、SDS-PAGE和点杂交法检测纯化多抗的效价、纯度和交叉反应性。结果所制备的纯化多抗效价约为1∶1500,回收率约为80%,纯度可达83%。纯化的多抗有效消除了与金黄葡萄球菌的非特异性交叉反应。结论已制备出高特异性的长双歧杆菌多克隆抗体,可用于长双歧杆菌制剂的菌体检测。

中国生物制品学杂志临床观察

Rh血型系统在安全输血中的意义185-186

摘要：目的研究配血不合患者血样中不规则抗体的分布特征,确定Rh血型系统在安全输血中的意义及输血策略。方法采用盐水介质法、聚凝胺试验、抗人球蛋白试验和木瓜酶试验对2007年1月～2008年12月来河北省血液中心申请疑难配血的153例患者血样进行血型鉴定、抗体筛查和特异性鉴定及交叉配血试验。结果153例受血者血液中,有134例存在不规则抗体,其中Rh系统免疫抗体68例（占50.75%）,12例由多次妊娠免疫产生,55例由反复输血引起,1例为自身特异性 ABO和Rh以外其他血型系统抗体10例（占7.46%）,单纯自身抗体阳性者56例（占41.79%）。结论在引起配血不合或溶血性输血反应的原因中,Rh系统的免疫居第1位,为受血者提供Rh因子同型血液输注是减少长期输血治疗患者发生Rh免疫的重要策略。

中国生物制品学杂志实验技术

人偏肺病毒检测方法的比较187-191

摘要：目的比较几种人偏肺病毒（hMPV）的检测方法,为临床选择适当的检测方法提供依据。方法不同稀释度的hMPV分别感染Vero-E6细胞,出现细胞病变（CPE）后,分别用RT-PCR、Real-time PCR和IFA进行检测,比较3种方法的灵敏度 10倍系列稀释滴度为105.2TCID50/ml的hMPV,分别用RT-PCR及Real-time PCR进行检测,定量比较两种方法的灵敏度 分别用Real-time PCR和IFA检测523份急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物。结果IFA、RT-PCR和Real-time PCR分别可检出10-4、10-5、10-7稀释度孔中的病毒 RT-PCR和Real-time PCR检测的灵敏度分别为1.0×103和1TCID50/ml 在523份鼻咽分泌物标本中,IFA检测阳性率为9.18%,Real-time PCR检测阳性率为31.55%。结论Real-time PCR检测鼻咽分泌物标本中hMPV为儿科临床早期诊断的最佳方法 IFA可作为基层医院及hMPV相关严重呼吸道感染的检测方法。

6C型肺炎链球菌抗血清的制备及鉴定196-198

摘要：目的制备6C型肺炎链球菌抗血清,并进行鉴定。方法将经美国单克隆抗体方法鉴定为6C型的肺炎链球菌制成菌体抗原免疫家兔,制备抗血清 将抗血清与6A、6B和6C型肺炎链球菌进行荚膜肿胀和凝集试验 用6A、6B及6A和6B型肺炎链球菌吸附血清后,再次检测其与各型肺炎链球菌的凝集效价。结果免疫前的兔血清与6A、6B和6C型肺炎链球菌均未出现荚膜肿胀及凝集反应。免疫后的血清与6A、6B和6C型的凝集效价分别为1∶64、1∶32和1∶64 经6A或6A和6B型吸附后,与6A、6B和6C型的凝集效价分别为（-）、（-）和1∶8 经6B型吸附后,与6A、6B和6C型的凝集效价分别为1∶16、（-）和1∶16。结论6C型为新的肺炎链球菌血清型,已成功制备出6C型抗血清,可用于血清分型研究。