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中国生物制品学 2010年第01期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株全基因序列测定及分析1-8

摘要：目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株（VZV84-7株）的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G＋C含量为46.1%。基因组各区段长度及G＋C含量分别为：UL：104746bp,G＋C：44.3%;TRL和IRL：各89bp,G＋C：69.7%;Us：5235bp,G＋C：42.8%;TRS和IRS：各7462bp,G＋C：59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达9-12

摘要：目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素（CyaA,ACT）基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。

乙型脑炎减毒株SA14-14-2全长cDNA克隆感染性的研究13-16

摘要：目的在获得乙型脑炎病毒（JEV）全长cDNA分子的基础上,建立感染性转录体,获得恢复病毒,为JEV致病机理、疫苗研制及分子病毒学研究提供方法。方法将全长JEV cDNA分子克隆入改造后的pBluescript KS I（I＋）载体上,经T7启动子体外转录,在Lipofectamine2000介导下,将转录产物转染入BHK-21细胞,经RT-PCR、测序、间接免疫荧光试验及噬斑试验鉴定恢复病毒。结果转录产物转染BHK-21细胞后,观察到明显的细胞病变;收获恢复病毒,经RT-PCR、测序、间接免疫荧光试验及噬斑试验证实为JEV。结论已建立了JEV全长cDNA克隆经体外转录获得JEV感染性RNA的方法,为JEV分子生物学及疫苗研究等奠定了基础。

A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性17-21

摘要：目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法（IFA）检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。

RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用22-24

摘要：目的研究ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录的影响,探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用。方法将ALU全基因序列插入pcDNA3.1（-）载体的CMV启动子（一个RNA聚合酶Ⅱ启动子）的下游,构建重组质粒pcDNA3.1-ALU;转染HEK293细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR筛选稳定表达ALU的细胞;用干扰素处理稳定表达ALU序列的细胞,Western blot法检测PKR的磷酸化水平。结果ALU全基因序列插入pcDNA3.1载体的CMV启动子直接下游,能够被RNA聚合酶Ⅱ有效转录;在稳定表达ALU的HEK293细胞中,加干扰素与未加干扰素组PKR的磷酸化水平均明显高于相应的HEK293细胞对照组。结论ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录无明显影响,但与RNA聚合酶Ⅲ启动下转录的ALU不同,RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU失去了对干扰素的拮抗作用,反而可以通过形成双链RNA的方式激活PKR的活性。

泽泻提取物中萜类单体V-54对小RNA病毒增殖的抑制效应25-27

摘要：目的探讨泽泻提取物中提取的萜类衍生物单体V-54对小RNA病毒感染增殖的抑制效应及其生物学机理。方法采用KMB17细胞,分别感染HAV-H、PV-Ⅰ和Cox-B2病毒,经V-54处理后检测病毒滴度,分析PV-Ⅰ和Cox-B2病毒增殖抑制的动力学及V-54对KMB17细胞凋亡的影响。结果V-54可抑制3种病毒在KMB17细胞上增殖,PV-Ⅰ和Cox-B2病毒感染滴度比未处理组明显降低,V-54对两种病毒的抑制作用呈剂量依赖性。作用24h内,V-54可使KMB17细胞凋亡率明显增加,随后逐渐恢复正常。结论V-54可抑制特定的小RNA病毒的感染增殖,其机制可能为V-54分子结合到细胞表面的相关受体,导致病毒感染效率降低。

缰核损毁对下丘脑内GABA_A受体α1亚单位表达的影响28-29

摘要：目的观察缰核损毁对下丘脑内GABAA受体α1亚单位（GABAAα1）表达的影响,以揭示缰核与下丘脑之间功能联系的可能的分子机制。方法建立缰核损毁大鼠模型,以假手术组为对照。分离下丘脑,提取总RNA及总蛋白,采用RT-PCR和Western blot方法检测两组大鼠下丘脑内GABAAα1 mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果缰核损毁大鼠下丘脑内GABAAα1 mRNA的转录水平及蛋白表达水平均明显高于假手术对照组。结论缰核损毁可显著提高下丘脑内GABAAα1的表达水平,提示GABAA受体可能在缰核与下丘脑共同参与的生理调节过程中起重要作用。

血红素肽-铁的分离纯化及其清除自由基能力30-35

摘要：目的分离纯化血红素肽-铁,并分析其清除自由基的能力。方法以聚丙烯酰胺为载体,对利用真空及低压高频脉冲胰蛋白酶降解猪血红蛋白的产物进行金属螯合亲和层析分离纯化,利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）及生物信息学网站分析血红素肽-铁的分子结构;以维生素C（Vc）为对照,分析血红素肽-铁的抗氧化能力;以邻苯三酚法分析血红素肽-铁清除超氧阴离子的能力;以脱氧核糖法分析血红素肽-铁清除羟基自由基（·OH）的能力;以三氯甲烷-甲醇法分析血红素肽-铁对脂质过氧化的抑制作用。结果分离纯化的血红素肽-铁由139个氨基酸组成,相对分子质量为16065.08,铁离子含量为11013.5μg/L,理论pI为8.10,消光系数为6990,脂肪系数为92.73,不稳定系数为1.18,总平均疏水性为-0.023;在体外具有较强的清除超氧阴离子和抗氧化自由基能力。结论分离纯化的血红素肽-铁具有清除自由基的能力。

骨髓间充质干细胞对电离辐射诱发的小鼠胸腺瘤的抑制作用36-38

摘要：目的观察骨髓间充质干细胞（MSCs）对电离辐射诱发的小鼠胸腺瘤的抑制作用。方法采用经典Kaplan法复制电离辐射诱发的小鼠胸腺瘤模型。应用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠MSCs,DAPI标记,经尾静脉注入荷瘤小鼠后,分别于1、5、10d处死小鼠,取胸腺组织,激光共聚焦显微镜下观察MSCs在胸腺瘤组织中的定位;第1次全身大剂量照射后6个月取胸腺组织,HE染色观察胸腺组织的病理变化,并判断成瘤情况。结果激光共聚焦显微镜下观察可见,MSCs经尾静脉输注后可迁徙至小鼠胸腺组织内;病理观察显示,胸腺组织皮髓质结构清楚,淋巴样肿瘤细胞较少,细胞形态、大小不一,偶见核分裂象;MSCs输注使辐射诱导的胸腺瘤成瘤率由57.00%±9.78%降低至37.50%±7.55%。结论已成功建立辐射诱发的小鼠胸腺瘤模型;输注的MSCs可迁徙至胸腺组织中,并降低胸腺瘤的成瘤率。

绿脓杆菌及其鞭毛蛋白联合rhIL-12体外对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响39-42

摘要：目的探讨绿脓杆菌及其鞭毛蛋白联合rhIL-12体外对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响,为rhIL-12作为佐剂应用于临床提供理论依据。方法取健康人及慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）,分别与绿脓杆菌、鞭毛蛋白、rhIL-12、绿脓杆菌＋rhIL-12、鞭毛蛋白＋rhIL-12孵育,ELISA法检测细胞培养上清中IFNγ的含量。结果绿脓杆菌和鞭毛蛋白组只诱导产生低水平的IFNγ,rhIL-12组诱导产生IFNγ的水平较阴性对照组显著提高;而绿脓杆菌＋rhIL-12组、鞭毛蛋白＋rhIL-12组诱导产生IFNγ的水平显著高于绿脓杆菌、鞭毛蛋白和rhIL-12组,差异均有统计学意义,且rhIL-12的作用呈剂量依赖性。结论绿脓杆菌及其鞭毛蛋白联合rhIL-12体外能显著提高健康人和慢性乙型肝炎患者PBMCs产生IFNγ的水平,增强其细胞免疫应答。

密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21在毕赤酵母中的表达43-46

摘要：目的在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21（hFGF-21）,为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础。方法经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25000的目的蛋白条带,目的蛋白的表达量约为6μg/L。Westernblot显示该蛋白具有良好的反应原性。诱导96h和培养液pH值为4.0时,目的蛋白的表达量最高,甲醇浓度对表达量无影响。结论已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21。

中国生物制品学杂志预防制品

mp65和sap2真核表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌感染的免疫保护作用47-50

摘要：目的研究白色念珠菌mp65和sap2基因真核表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌感染的免疫保护作用。方法将pcDNA3.1-mp65和pcDNA3.1-sap2质粒分别或联合免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠外周血中抗MP65和抗Sap2蛋白特异性IgG抗体,流式细胞仪检测免疫小鼠脾脏中CD4＋、CD8＋T淋巴细胞百分含量的变化,并观察白色念珠菌攻击后免疫小鼠的存活率。结果免疫后小鼠血清中可检测出抗两种蛋白的特异性IgG抗体,两种质粒均能诱导脾脏中CD4＋T淋巴细胞百分含量增高,并可提高白色念珠菌系统性感染小鼠的存活率。结论pcDNA3.1-mp65和pcDNA3.1-sap2质粒均能诱导小鼠的体液免疫和以CD4＋T淋巴细胞为主的细胞免疫,且对白色念珠菌的系统性感染有一定的保护作用。

重组弓形虫Peroxiredoxin蛋白诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用51-53

摘要：目的观察不同剂量重组弓形虫Peroxiredoxin蛋白（rTgPrx）诱导小鼠的体液免疫、细胞免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用。方法BALB/c小鼠60只,随机分为5组,分别用20、40、60、80μgrTgPrx（溶于100μlPBS中）和100μlPBS皮下免疫小鼠3次,间隔2周。末次免疫后第14天,用1×10^4个速殖子/只灌胃攻击,逐日观察小鼠健康状况。攻击后第30天,ELISA法检测小鼠血清IgG和小肠冲洗液sIgA水平,分离并计数脾淋巴细胞和小肠上皮内淋巴细胞（IEL）,分离肝、脑组织内弓形虫速殖子并计数。结果60μgrTgPrx组小鼠血清IgG水平显著高于PBS、20μg和40μgrTgPrx组,小肠冲洗液sIgA组间比较差异无统计学意义;80μgrTgPrx组小鼠脾淋巴细胞数量明显高于PBS和20μgrTgPrx组,IEL数量各组间差异无统计学意义;60μg和80μgrTgPrx组小鼠脑和肝组织虫荷均低于PBS和20μgrTgPrx组。结论60μg和80μgrTgPrx皮下免疫小鼠可诱导有效的体液免疫、细胞免疫应答,且抗弓形虫感染的保护作用效果良好。

中国生物制品学杂志治疗制品

塞来昔布对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力、VEGF表达及放疗敏感性的影响54-58

摘要：目的探讨环氧化酶-2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布（Celecoxib）对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力、血管内皮生长因子（VEGF）表达及放疗敏感性的影响。方法HNE-1细胞经不同浓度塞来昔布处理后,采用MTT法检测各组细胞的增殖水平,细胞侵袭试验检测细胞的侵袭转移能力,RT-PCR及ELISA分别检测细胞VEGF mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,克隆形成试验检测细胞对放疗的敏感性。结果不同浓度的塞来昔布均可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力,并显著下调HNE-1细胞VEGF在mRNA及蛋白水平的表达,且均呈剂量依赖性,差异具有统计学意义。克隆形成试验结果表明,125μmol/L的塞来昔布与放疗联用对HNE-1细胞有明显的协同抗肿瘤效应。结论塞来昔布对HNE-1细胞的增殖与侵袭能力及VEGF的表达均有明显的抑制作用;经塞来昔布处理可增强HNE-1细胞对放疗的敏感性。

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体诱导的免疫应答59-62

摘要：目的观察鼻咽癌人源抗独特型单链抗体G22ScFv在小鼠体内诱导的免疫应答,探讨其作为鼻咽癌疫苗的可能性。方法在大肠杆菌中诱导表达G22ScFv并进行纯化,以纯化的G22ScFv免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA及竞争抑制ELISA检测免疫小鼠特异性体液免疫应答水平;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表型的变化。结果纯化的融合蛋白纯度达95%以上,且具有良好的反应原性。经ELISA检测,G22ScFv免疫后,小鼠产生了Ab3,且小鼠脾脏CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数量升高。结论G22ScFv可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,为鼻咽癌人源抗独特型抗体疫苗的临床应用奠定了基础。

中国生物制品学杂志诊断制品

戊型肝炎病毒ORF2N-端和C-端多肽的抗原性分析63-66

摘要：目的分析戊型肝炎病毒（HEV）ORF2N-端和C-端多肽的抗原性。方法以纯化的4型HEVORF2N-端1～124aa多肽pS4-1和4型HEVORF2C-端385～674aa多肽pS4-6分别包被微孔板,采用间接酶联免疫法（EIA）检测感染HEV的猴系列血清中的抗HEVIgG抗体,分析两种多肽的抗原性,并与进口试剂的检测结果进行比较。结果在感染HEV的猴系列血清中,针对HEVORF2N-端抗原的抗体产生时间早,持续时间短,其峰值与转氨酶（ALT）的峰值几乎重叠;针对HEVORF2C-端抗原的抗体在HEV感染早期产生的滴度较低,但逐渐升高,在14周的观察期内,抗体滴度几乎无下降趋势。用两种多肽检测HEVIgG抗体的灵敏度均高于进口试剂。结论两种多肽均具有较好的抗原性,但在HEV感染的不同时期,其反应性不同。

中国生物制品学杂志临床观察

血管紧张素Ⅱ2型受体基因多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压的相关性71-73

摘要：目的研究血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2R）基因A1675G多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压（EH）的相关性。方法随机选取山东省济宁地区汉族女性EH患者127例（EH组）和体检正常的女性119例（正常对照组）,提取外周血基因组DNA,PCR扩增A1675G基因,高分辨率熔解（HRM）法测定A1675G基因的多态性。结果EH组AA、AG和GG基因型频率（分别为26.8%、53.5%和19.7%）与正常对照组（分别为27.7%、42.0%和30.3%）比较,差异均无统计学意义;等位基因频率（A：53.5%;G：46.5%）与正常对照组（A：48.7%;G：51.3%）比较,差异也无统计学意义。结论A1675G基因多态性可能与山东省济宁地区汉族女性原发性高血压无明显相关性。

中国生物制品学杂志实验技术

STR图谱分析法鉴别人源细胞交叉污染74-78

摘要：目的采用STR图谱分析法鉴别人源细胞交叉污染。方法采用PCR-毛细管电泳分析方法,分别检测人源、猴源及鼠源细胞以及人源细胞交叉污染模型的16个STR位点,分析STR图谱法用于细胞交叉污染检测的可行性。并对来自不同生物制品生产单位的27株生产用细胞及5株组织工程医疗产品用细胞进行STR图谱分析。结果STR图谱分析方法具有人源细胞特异性,猴源细胞及鼠源细胞不产生特征性图谱。此方法可以对形态相似或不相似的人源细胞交叉污染模型进行明确鉴别。采用此方法检测的27株生物制品生产用人源细胞未发现有交叉污染现象,而5株组织工程医疗产品用细胞中,发现有2株为非单个个体的混合细胞。结论STR图谱分析法具有高特异性,可用于人源细胞间交叉污染或细胞个体来源的鉴别。