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中国生物制品学 2009年第11期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

HIV-1 HXB2株ta（tB41-101N）融合基因原核表达质粒的构建及表达1049-1053

摘要：目的构建HIV-1HXB2株ta（tB41-101N）融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta（tB41-101N）融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸（aa）,采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta（tB41-101N）,并构建其原核表达质粒pET32a-ta（tB41-101N）,经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2＋-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta（tB41-101N）融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta（tB41-101N）构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta（tB41-101N）融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta（tB41-101N）融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清（抗Tat抗体阳性）均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta（tB41-101N）融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。

稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系的建立1054-1056

摘要：目的建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DN段重组到逆转录病毒质粒pSUPERRetro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Westernblot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组。结论已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shRNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。

白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体的构建及其功能检测1057-1062

摘要：目的构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制。方法重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列,表达并纯化突变体蛋白。血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响。结果双酶切、PCR及测序证实突变体构建正确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上。野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能。结论已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制,抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础。

抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选1063-1067

摘要：目的构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体。方法从20份人外周血淋巴细胞（包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份）中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链（VH）和轻链（VL）可变区基因,以重叠延伸PCR法将VH和VL拼接成scFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8×109,多样性良好。共筛选出18个阳性克隆。结论已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件。

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其在HepG2.2.15细胞中的表达1068-1070

摘要：目的构建人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达NIRF蛋白。方法从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染HepG2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染HepG2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达。结论已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础。

RNA干扰技术对MCF-7细胞Aurora-A基因表达的影响1071-1074

摘要：目的构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用。方法将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi-U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定。并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Westernblot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响。结果测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降。结论已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础,并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法。

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵1075-1079

摘要：目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b（＋）-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta-gami2（DE3）,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b（＋）-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2（DE3）宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2（DE3）中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双...

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化1080-1083

摘要：目的构建乙型肝炎病毒（HBV）P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段（1～534、1008～2040和2043～2526bp）,分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2＋-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。

中国生物制品学杂志消息

征稿1083-1083

摘要：《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管，中华预防医学会和中国生物技术集团公司长春生物制品研究所主办，是中华预防医学会系列杂志之一，月刊。

中国生物制品学杂志预防制品

麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株的遗传稳定性1095-1098

摘要：目的分析麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株病毒结构基因的遗传稳定性。方法将北京天坛生物制品股份有限公司（天坛生物）用于麻疹疫苗生产的S191株25代病毒（S191-BJ25）传至29代（S191-BJ29）,上海生物制品研究所保存的S191株24代病毒（S191-SH24）传至33代（S191-SH33）。从S191株传代病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段N、M、F、H进行扩增及测序。将测序结果与GenBank中1994年收录的S191株麻疹病毒的相应序列进行比较分析。结果S191-BJ25传代病毒N、M、F、H4个基因的总突变率为0.02%,S191-SH24传代病毒为0.15%;与1994年的S191疫苗株相比,S191-BJ25传代病毒N、M、F、H4个基因的总突变率为0.3%,S191-SH24传代病毒为0.4%。结论目前天坛生物使用的麻疹疫苗S191株生产用三级种子库具有可靠的遗传稳定性,从主代种子到疫苗的传代过程中,N、M、F、H结构基因表现出稳定的分子遗传特征。目前使用的S191毒株的4个结构基因较1994年以前的疫苗株发生了变化,但目前没有证据表明这些变化对免疫原性产生不利影响。

我国生产用卡介菌的传代稳定性1102-1104

摘要：目的研究我国生产用卡介菌上海株在传代过程中分子遗传学特性的稳定性。方法应用多重PCR法,对我国生产用卡介菌上海株工作种子批及其不同代次菌的各缺失区、插入序列IS6110及基因座SenX3-RenX3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海株的工作种子批及其第6、9、12代菌均缺失RD1、RD2,未缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo;含有1个IS6110插入序列和3个SenX3-RenX3基因座串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海株在传12代以内,其分子遗传学特性是稳定的。

冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）非动物源性稳定剂的筛选1110-1112

摘要：目的筛选冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）非动物源性稳定剂,以替代传统的动物源性稳定剂。方法取同一批乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）原液,分别加入A、B、C、D稳定剂（非动物源性）,制备成冻干剂型,分别检测其外观、水分、有效抗原含量和效力等,以传统稳定剂作对照,并考察其稳定性。结果冻干前后,疫苗的有效抗原含量及效力与对照无明显差异。加入D稳定剂（不含人血白蛋白和明胶）的冻干乙型脑炎灭活疫苗于37℃放置6个月,效力降低15.1%;于2～8℃放置2年,效力仍高于参考品。其他检测指标均符合要求。结论D稳定剂可替代传统稳定剂,用于制备冻干乙型脑炎灭活疫苗。

中国生物制品学杂志治疗制品

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化1113-1116

摘要：目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21（SUMO-rhFGF-21）融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。

重组人白细胞介素-12（CHO细胞）的纯化及其活性1117-1121

摘要：目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12（rhIL-12）的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值（40000和35000）相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×10^6IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。

中国生物制品学杂志消息

《英汉-汉英生物制品学词汇》出版发行1125-1125

摘要：由国家药典委员会组织巾国生物制品领域众多知名专家主编、中国生物制品集团公司协编的《英汉一汉英生物制品学词汇》，已南科学出版社于2008年第四季度出版。本书是我国第一部综合生物制品所涉及的有关分支学科词汇的丁具书，包括英汉和汉英两部分，收录有病毒学、细菌学、微生物学、细胞学、血液制品、血液学分子生物学、生物化学、生物技术、遗传学、传染病学、免疫学、流行病学、诊断制品、寄生虫学等多学科的名词术语，还收录了部分与生物制品生产质量管理和新制品临床研究规范（GMP，GCP）相关的专业术语，共约25000条。

中国生物制品学杂志诊断制品

依赖利福平结核分枝杆菌Rv0341天然蛋白的诊断价值1126-1129

摘要：目的探讨依赖利福平结核分枝杆菌（依R菌）Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,诊断依R菌感染肺结核病的价值。方法典型依R菌经SDS-PAGE、转膜后,获得Rv0341天然蛋白带,采用结核分枝杆菌抗体DIGFA诊断试剂检测血清Rv0341抗体,并考察该方法的重复性、特异性及敏感性。结果利用Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,具有良好的批内和批间重复性;血清Rv0341抗体在耐R菌肺结核组和R敏感菌肺结核组的特异性分别为92.3%（24/26）和79.3%（23/29）,在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为88.9%（16/18）;在培养阴性结核组中,阳性率为23.8%（29/122）。54份阳性结果血清进行重复实验,确认为阳性。结论Rv0341天然蛋白可作为诊断抗原用于依R菌结核病血清学诊断试剂盒的研发,以快速辅助诊断依R菌结核病,特别对菌阴依R菌结核病更有诊断价值。

中国生物制品学杂志临床观察

Bel亚型的血型血清学特征及其遗传背景分析1130-1131

摘要：目的分析Bel亚型的血型血清学特征及其遗传背景。方法采用红细胞凝集试验检测先证者及其家庭成员红细胞上的A、B、H抗原和血清中的抗-A、抗-B抗体;凝集抑制试验检测唾液中的A、B、H血型物质;吸收放散试验检测红细胞表面是否存在B抗原。用序列特异性引物多聚酶链式反应技术（PCR-SSP）进行ABO血型基因分型。结果先证者与其父确定为Bel亚型;先证者的两个妹妹分别为ABel亚型和A型;先证者的母亲、配偶、女儿、儿子分别为A、AB、A和B型。结论Bel亚型有家族遗传性。

中国生物制品学杂志实验技术

国内不同基因型Asia1型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法的建立1132-1135

摘要：目的建立口蹄疫病毒（FMDV）Asia1型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法。方法在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asia1型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件,并进行特异性及相关病毒检测。结果优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好,检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致。结论已建立了FMDVAsia1型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础。